《草鱼出血病》草鱼出血病细胞弱毒疫苗的研究

维资讯pww. http:/www.cqvip.com 3-引草鱼,出血病,研究 《珠江水产》总19期 1992.10 草鱼出血病细胞弱毒疫苗的研究S93.2 李焕林淑英邓国成姜兰 提要 自1986年草鱼吻端成纤维细胞系PSF建立以来,作者应用此细胞系进行 了草鱼出血病病毒的接种分离、适应性培养馴化和制备细胞疫苗等一系列试 验。本文报导841号毒株的筛选、弱毒副化细胞弱毒湿疫苗和冻干疫苗制 备、稀释度、剂量以及保存期测定的试验;细胞弱毒疫苗中间试验与生产表证 的初步结果.84-1号毒株在PSF细胞中继代化至53代达到减毒目的,用筛选 代53~59代作毒种制备的细胞弱毒疫苗使用安全,以10-2~10-3浓度0.1-0.2 毫升/尾剂量注射免疫草鱼,免疫保护率达到85%以上。 主题词:草鱼出血病,毒株,种毒,细胞弱毒苗,湿苗,冻干苗。 前言 人类和动物免疫使用的疫苗制品,从发展上经历了三个阶段:(1)灭活疫苗; (2)弱毒疫苗(3)基因工程亚单位疫苗。目前医学和畜医学预防病毒病使用的普 遍为弱毒活疫苗,灭活疫苗已很少应用。基因工程亚单位疫苗刚在世界兴起,只在医学 上少数病毒病中试用 鱼用疫苗制品研制在我国起步较晚。但自1969珠江水产研究所李焕林等首次研制 试用获得成功以来,鱼类免疫防病二十年来有了很大发展,在生产上的应用规模,我国 已届于世界前列目前主要疫苗种类为灭活组织疫苗,包括珠江水产研究所的“三病” 组织疫苗1和中科院水生所的草鱼出血病灭活苗2草鱼经免疫后成活率达80%以 上。然而组织疫苗取材来源于病鱼肝、脾、肾和显症组织,要在流行季节从自然界收集, 或靠鱼体在适温条件下感染扩大,使大批量生产几乎不可能,往往冬末春初放种时因缺 乏疫苗而错过了预防免疫的时机。 我国自从鱼类细胞建株(系)获得成功以后,浙江淡水水产研究所杨广智等32 长江水产研究所杨先乐等4中科院水生生物研究所邓初夏等先后利用草鱼出血病病 毒敏感细胞株(系)室内离体培养病毒,研制草鱼出血病灭活细胞疫苗,获得一定效 果。但迄今尚未有关于草鱼出血病细胞弱毒疫苗研究的报导。 23

7j一 《珠 江 水 产 》 总 19期 薇 l 1992．10． 草鱼 出血病细胞弱毒疫苗 李焕林 许淑 、 国成 姜 兰 提 要 的研宄 S9移tH 自1986年草 鱼吻端成纤维细 胞 系PSF建立 以来，作者应 用此细 胞 ．罨 进 行 T草 鱼 出血病 病毒 的接 种分 离， 适应性培 养驯化和 制备细胞 疫苗等一 系 列 试 验。 本文报 导84— 1号毒 株的 筛选、弱毒 制化 ；细胞弱毒 湿疫 苗和 冻干疫 苗制 备 、稀 释度 、 剂量 以厦保存 期测 定的试验 ；细 胞弱毒 疫苗 中问试验与 生产 表证 的初 步结果 。84一 l号毒株在PSF细胞 中继代驯化 至53代连到 减毒 目的 ，用筛选 代53~59代作毒 种制备 的细 胞弱毒 疫 苗使 用安 奎，以10 ～10。 浓度9．1— 0．2 毫 尾 剂量 注射 免疫草鱼， 免疫保护率达到85 以上。 主题 词 ：草 鱼 出血 病，毒 株，种毒 ，细胞 弱毒 疫苗，湿 苗， 冻干 苗。 前 言 人类和 动物免疫使用 的疫 苗制 品，从 发展 上经历 了 三 个 阶段 ； ( 1)灭 活疫苗 ； (2 )弱毒疫苗 j (3 )基因工程 亚单位疫苗。 目前医学 和畜 医学预 防病毒病使用 的普 遍 为弱毒活疫苗，灭 活疫苗 已很少应用 。基 因工程亚单位疫 苗刚在世界兴 起，只 在医学 上少数病 毒病 中试用 。 鱼用疫苗 制 品研 制在我国起步较晚 。但 自1969年珠 江水 产研究 所李 焕林 等首次研 制 试用 获得成功 以来 ，鱼 类免疫 防病二十 年来有 了很 大发展， 在生 产上 的应用规模 ，我 国 已届于世界前 列 目前 主要疫苗种类 为灭活组织 疫苗， 包括珠江水 产研究 所的 “三病 ” r ● 、 … 组 织疫 苗“ 和 中科院水生 所的草鱼 出血病灭活疫苗 j。草鱼经免疫后 成活率达80％以 上 。然而 组织疫苗取材来源 于病 鱼肝 、脾 、肾和显症组 织，要在 流行季节 从 自然界收集， 或靠鱼体在 适温条件 下感 染扩大，使大批量生 产几乎不 可能，往 往冬 末春初放种 时因缺 乏疫苗而 错过 了预防免疫 的时机。 我 国 自从鱼 类 细胞 建株 (系 )获得成功 以后，浙 江淡 水水 产研究 所杨 广智等 ， 长江水产研究 所杨先 乐等L4J中科 院水 生生物研究 所邓 初夏 等 先后 利用 草鱼 出血病病 毒 敏感细胞株 (系 )室 内离 体培养病毒，研 制草鱼 出血病灭 活 细胞 疫苗，获 得 一 定 效 果 。但迄 今尚未有关 于草鱼 出血病细胞 弱毒 疫苗研究 的报 导。 23 旖 v红 牲 维普资讯 http://www.cqvip.com

《珠江水产》总19期 t892。10 作者应用草鱼吻端成纤维细胞系PSF1988年首先完成了草鱼出血病高滴度强毒株弱 毒化驯化,制备了草鱼出血病细胞弱毒疫苗〔湿苗和冻干苗),进行了小型实验、中间 产表证,获得良好效果。本文报告这一工作。 村料与方法 毒种驯化 1、病毒提取 从珠江三角洲地区池塘采集具有典型草鱼出血病症状的病鱼,取其肝丶脾、肾组 织,称重、剪碎后,用玻璃研磨器匀浆然后加入不含血清的199培养液使成10-浓度, 置冰箱预冷至4℃,经10000°m离心20分钟,吸取上清液,加入1000单位/毫升青霉素 和100微克/毫升链霉素,放4℃冰箱过液,即为除菌组织病毒液。 2、毒株筛选 用采自珠江三角洲不同地区的野毒材料,分别制备除菌组织病毒液。通过鱼体感染 扩大或接种PSF细胞增殖,回归感染草鱼,从中篼选出毒力强的毒株,作为弱毒驯化的 种毒 8丶种毒弱毒化驯化 取长成致密单层的PSF细胞,用0,25%胰蛋白酶和0,02%乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)消液消化一分钟左右,加入含10%小牛血清pH72左右的199培养液,吹打 分散细胞,然后以1:100的比例加入种毒,一分为四分装细胞瓶内(细胞浓度约1·5 104个/毫升)。在一定条件下静止培养,7~10天收获。-20℃冰结。冻融后收获细胞 病毒液,即为某一代的种毒。按上述方法在PSF细胞中连续继代驯化。与此同时,每代 种毒以10°~10-浓度03毫升/尾剂量注射接种全长9~12厘米的草鱼,作毒力检查。接 种15天后以100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,观察15~20天,检查其免疫保护力 、细胞弱毒疫苗制备 1、细胞培养弱毒湿苗 采用静止和旋转两种培养方法制备 静止培养方法同“种毒弱毒化驯化”的继代培养。用10°浓度03毫升/尾剂量感染 全长9~12厘米草鱼,安全、免疫原性强的84~1号弱毒株缩选代作毒种 旋转培养用每小时15转的转鼓带动大容量的小口旋转培养瓶。接种毒种代数及其浓 度、接种方法、培养液成份、培养条件及时间同静止培养。但接种的细胞浓度比静止培 养大一培

《珠 江水 产 》 总19期 l明2．10． ＼ ．作者应用草鱼吻端成纤维细胞系PSF1988~首先完成了草龟出血病高滴度强l篓毋 r ，‘■■■ 毒化驯 化，制备 了草鱼 出血病 细胞 弱毒疫苗 (湿 苗和冻千苗 )，进行 了小型 实验 、中间 等 。 一 、 毒 种 驯 化 1、病 毒提取 从珠江三 角洲地 区池塘采集具有典 型草鱼 出血病症状 的 病 鱼 ，取其肝 、脾 、肾组 织。称重 、剪 碎后 ，用 玻璃 研磨器匀浆 ，然后加入不含血清 的199培养液使成 10I1浓度 ， 置冰 箱预 冷至 4℃，经 10000rpm离心20分钟 ，吸取上 清液 ，加．x．1000单位／毫升青 霉 素 和 1000微克／毫升链霉素 ，放 4℃冰箱过液， 即为 除菌 组织 病毒 液。 2 、毒株 筛选 用采 自珠 江三 角洲不 同地 区的野 毒材料，分 别制备除 菌组 织病毒液。通过鱼体 感染 扩大或接 种PSF细胞增 殖，回归感染 草鱼， 从中筛选 出毒力强 的毒株， 作为弱毒驯化 的 种毒 。 3、种毒 弱毒化驯化 取长成致密单 层 的PSF细胞 ，用0．25％胰蛋 白酶 和0．02％ 乙 二 胺 四 乙 酸 二 铺 (EDTA )消液消化一分钟左 右，加入含 10％小 牛血 清、pH7．2左右 的199培养 液 ，吹打 分 散细胞 ，然 后 以 1t100的比例加入种 毒，一分 为 四分装 细胞瓶 内 (细胞 浓度 约 1．5× lO个／毫升 )。在 一定 条件下静止培 养， 7～ l0天收获。 一20℃冰 结。冻融后 收获 细胞 病 毒液，即为某一代 的种毒 。按 上述方 法在PSF细胞 中连 续继代驯化。 与此 同时，每代 种毒以10。～l0 浓度0．3毫升／尾剂量注射接种全长 9～l2厘米的草鱼，作毒力检查。接 种 l5天后 以100LD5o的强毒 0．2毫升／尾的剂量攻击 ，观 察15~2o天 ，检查 其免疫保护力。 二、 细胞 弱毒 疫 苗 制备 l、细 胞培养 弱毒湿苗 采用静止和旋转两 种培养方法制备 。 静止培养方法同 种毒弱毒化驯化”的继代培养 。用l0。浓度o．3毫升／尾剂量感染 全 长 9～l2厘米草鱼 ，安全 、免 疫原性强 的84～ l号弱毒株筛 选代 作 毒种。 旋转 培养用 每小时 l5转的转 鼓带动大 容量的小 71旋转培养瓶 。接种毒种代数 及其 浓 度、接种方 法、培养液成份、培 养条件及时 间同静止培养。但 接种的细胞浓度 比静止 培 养大 一培。 24 维普资讯 http://www.cqvip.com

《珠江水产》总19朝 199210 细胞培养弱毒冻于 将收获后经安全性和抗原性检验合格,置-20℃保存的各批细胞培养弱毒湿苗,无 菌操作倒入大容量的玻璃瓶混合,然后按1:1的比例加入含5%蔗糖的脱脂牛奶作保 护剂、再按总量加入500单位/亳升青霉素和500微克/毫升链霉素,充分抵匀后,在无菌 室分装冻于瓶,每瓶5毫升,最后置真空冷冻干燥机进行冻干处理,出柜后在无菌室加 塞、抽真空、封腊。 三、细胞弱毒疫苗稀释度,剂量和保存期测定 1、稀释度 取84—1号弱毒株55、56、57代作毒种,分别制备细胞培养弱毒湿苗,以10-1 10-‘各种稀释度0,2毫升/尼剂量注射免安全长9~12厘米的当年草鱼,同时设空白对照 组。兔疫15天后以100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,观察15~20天,记录和统计 免疫鱼和对照鱼的显症死亡率,计算出各种稀释度的免疫保拉力。 2、剂量 用同一批细胞培养弱毒冻干苗10-~104各稀释度的三种不同剂量(010.2、 0,3升/尾)注射免疫全长9~12厘米的当年草鱼,同时设空白对照组。免疫15天后以 100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,观察15~20天,记录和计算比较各种稀释度不 同剂量的免疫保护力。 3、保存期 将同一批细胞培养弱毒冻干苗分别存放于室温、4℃、-20℃三种不同温度,经两个 月后间隔一定时间从各个保存温度随机取出一瓶,用065%生理盐水稀释成10-1~104 儿种浓度,以02毫升/尾注射免疫全长9~12厘米的当年草鱼。同时设空白对照组。免 疫15天后以100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,现察15天,检查其免疫保护力。 试验结果 弱毒株84-1号的安全性与免疫原性 1984~1989年,通过数十个野毒村料筛选出84-1号和89-2号两个毒力强的毒 株。84-1号毒株LD50为314,2号毒株LD50为382。其中84—1号毒株作为弱毒驯 化的种毒,几年来在PSF细胞中进行适应性培养,一直保持较强毒力。但在一定培养条 件下传至50代毒力显著减弱,回归感染死亡率仅30%;传至50代降至10%;传至53代毒 力更弱,注射接种草鱼不出现显症、死亡或其它异常现象,而且连续传至59代,均能保 持这种弱化性状(表1)。用这些筛选代作毒种制备的湿苗或冻干苗,均能达到安全

《珠 江 水 产 》 总 19期 1992．10． 2、细胞 培养弱 毒冻 干苗 将 收获后 经安全性和抗 原性检验合 格，置 一20℃保存 的各批细胞培 养弱毒湿苗，无 菌操 作倒入 大容量 的玻璃 瓶混合 ，然 后按 l ·l的 比例加入含 5 蔗糖 的脱晴牛奶 作保 护剂 ，再 按总量加入 500单位／毫升 青霉 索和500微克／毫 升链 霉索 ，充分摇匀后，在无菌 室分装 冻干瓶 ， 每瓶 5毫升 ，最后置真 空冷冻干燥机进 行冻干处理 ，出柜后在无菌 室加 塞 抽真 空、封 腊。 三、细胞弱 毒疫苗稀 释度 ，剂量 和保存 期测 定 l、稀 释 度 取 84一 l号弱毒株 55、56、57代 作毒种，分别 制备 细胞 培养弱 毒 湿 苗， 以l0～～ 1O 各种稀释 度0．2毫升／尾剂量注 射免 疫全长 9～ 】2厘 米 的当年草鱼 ，同时设 空白对照 组 。免 疫l5天后 100LD50的强毒O．2毫升／尾的剂量攻 击，观 察 15～ 20天 ，记录和统讣 免疫鱼和 对照鱼的显症 死亡率，计算 出 各种稀释 度 的免 疫保 护力 。 2、 剂 量 用 同一批 细胞 培养 弱毒冻干茁 10-～ lo 各稀释度 的 三 种不 同剂量 (0．1、0．2、 0．3毫升／尾 )注射 免疫全 长 9～ 12厘 米的当年草鱼， 同时设 空 自对照 组。免疫 15天后 以 1001D50的强毒0．2毫升／尾 的剂量攻 击，观 察 15~20天，记录 和计算 比较 各种稀释度不 同剂量 的免 疫保 护力 。 S、 保 存 期 将同一批 细胞培 养弱毒冻干 苗分 别存放于室温 、4℃、一20℃三 种不 同温度 ，经两 个 月 后间隔一定时 间从 各个 保存 温度 随机 取出一瓶，用 0．65 生理盐水稀释成 1O ～ l0’t 几 种浓度， 以0．2毫升／尾注射 免疫 全长 9～l2厘米的当 年草 鱼。同时设 空白对照 组。 免 疫 l5天后 以100LD50的强毒0．2毫升／尾 的剂量 攻 击 ，观察 15天，检查 其免疫保 护力 。 试 验 结 果 一 、 弱毒株84一 l号 的安全性 与免疫原’巨 1984~ 1989年，通过数 十个野 毒材料筛 选出84～ l号和89～ 2号两 个 毒 力强 的毒 株。84一 l号 毒株LD50为3．14， 2号 毒株LDs0为 3．82。其 中84一 l号毒栋 作为 弱毒 驯 化 的种 毒， 几年来在 PSF细胞 中进行 适应 性培养，一直 保持较 强毒力 。但在一定培 养条 件下抟至 5O代毒力 显著减弱， 回归感染 死 亡率仅3O i传至 50代 降至 10 j传 至53代 毒 力更 弱，注射接种草鱼不出现显症、死亡或其它异常现象，而且连续传至59代，均能保 持 这种 弱毒 化性状 (表 1)。用 这些 筛选代作 毒种制备 的湿苗或冻 干苗 ，均能 达到安全 25 维普资讯 http://www.cqvip.com

《珠江水产》总19期 检验的要求(表2)。 53~59各代弱毒接种兔疫的草鱼,其兔疫保护力均在50%以上(表I)。而用这些 选代作毒种制备的湿苗或冻干苗,稀释成10浓度,兔疫保护力仍可达100%(表3 表4)。 表1 84-1号毒株49~69代毒力变化及弱毒化后的兔疫原性 疫 攻 代浓剂量显症试验组对照组对照组显|兔疫 死亡率成活率成活率症死亡率保护力 (毫升/尾 (%)(%)(%) (%)(%) 03 30 5010-103 30 5210-1 03 100 03 0 85。7 G,3 0 l00 30 100 56 50 03 0 100 100 10n 03 100 30 70 100 细胞弱毒疫苗的稀释度、剂量和保存期 1、稀释度 以84一1号弱毒株55、56、57各代分别作毒种制备的湿苗,稀释度103免疫保护力 均达100%,10-4兔疫保护力亦可达50%(表3)。 2,剂量 同一批细胞培养弱毒冻干苗对全长9~12厘米草鱼免疫后攻击试验表明,用01毫 升/尾剂量注射免疫引起的保护力效应与03毫升尾相同。10浓度03毫升/尾剂量与

《珠江 水产 》 总19期 1992．10． 检 验 的要 求 (表 2 )。 53～ 59各代 弱毒梭种 免疫的草鱼，其免疫保 护力 均在5O 以上 (表 1)。而用这 些 筛 选代作毒 种制备 的湿苗或冻干 苗，稀 释成10。。浓度 ，免 疫保 护力 仍可达 i00 (表 3、 表 4 )。 表 l 84一 I号 毒株伯～69代毒 力变化 殛弱毒化后 的兔疫屎性 免 疫 攻 击 数 剂 量 显 症 试 验 组 对 照 组 对照 组显 免 疫 代 浓度 死亡 率 成 活 率 成 活 率 症死 亡率 保 护力 (毫升／尾 ) (％ ) ( ) (％ ) ( ) (％ ) 49 10一 0．3 3O 一 50 l0一 0．3 30 5l 10— 0．3 0 52 10— O．3 10 53 l0一’ O．3 O 1O0 30 70 100 — — — — — 54 1O一 0．3 0 9O 30 70 85．7 — — 55 10一i O。3 0 100 30 7O lO0 56 1O0 O．3 0 TO0 6O 5O lOO — — — 57 10— 0．3 0 100 30 70 l00 58 lO0 0．3 0 i00 20 80 10n — — 1 59 10。 j 0．3 0 100 30 7O IOO J { 二 、细胞 弱毒 疫苗的稀释度 、剂量 和保存 期 l、 稀 释 度 以84～ l号 弱毒椿55、56、57各代分 别作毒种 制备 的湿苗，稀释度1O 免疫 保护力 均达 i00％， 10 免疫保护力亦 可达 5O％ (表 3 ) 2 剂量 同一批细胞培养 弱毒冻 干苗 对全长 9～l2厘米草鱼免疫后攻 击 试验 表明，用 0·1毫 升／尾 剂量注射免 疫引起 的保护力 效应与 0．3毫升／尾相 同。 10 浓 度O．3毫升／尾剂量 与 26 维普资讯 http://www.cqvip.com

《珠江水产》总19期 i99210 表2 温苗和冻干苗的安全性试验 疫苗批号疫苗浓度 试验鱼/居数显症鱼成活率 尾 (%) 10 0 湿苗1号10 10 0 100 10 100 10 0 湿苗2号10- 10 100 10 10 0 湿苗3号 10 100 10 0 10-1 10 0 冻干苗89—1号 10 100 10-a 10 0 100 100 100 冻干苗89—2号 10 0 10 103浓度01毫升/尾剂量免疫保护力均为100%(表4)。 3、保存期 同一批细胞培养弱毒冻干苗保存于室温、4℃和-20℃三种不同温度半年后的试验 结果初步显示,细胞培养弱毒冻干苗保存于一20℃和4℃6个月,效价不变。10-1 10-4浓度注射免疫草鱼,免疫保护力均保持100%。但4℃组10浓度兔疫保护力降为 88,9%,是效价开始下降的标志还是偶然现象?有待进一步试验证明。保存于室温的冻 于苗效价下降较快,保存两个月(春季),效价即呈下降趋势,10-3浓度兔疫保护力下 降为80%,保存6个月(春、夏季)效价明显下降,10-度免疫保护力只剩333% 27

《珠 江水产 》 总 l9期 1995．10． 表 2 温 苗 和珠 千苗 的 安 全 性 试 验 显 症 鱼 成 活 率 疫 苗 批 号 疫苗浓 度 试验 鱼／ 尾数 尾 数 ( ) — — l00 lO O l0O 湿 哲 1 号 10一‘ i0 O 1O0 l0—0 10 O 100 100 10 O 1O0 湿 苗 2 号 10—0 10 0 1O0 l0—0 10 O 10O 100 10 O 100 湿 苗 3 号 10— l0 O 100 — lO0 10 O 100 10—1 l0 O 1O0 冻 干 苗89— 1号 10— l0 O 10O 10—0 10 O 100 100 10 O 1O0 冻 千苗 89— 2号 10—0 l0 O 1O0 1O 浓度O．1毫升／尾剂 量免 疫保护力 均 为100 (表 4 )。 3、保存 期 同一批细胞 培养弱毒冻干苗 保存于室温 、 4℃和一20℃三种不 同温度 半年后 的试验 结 初步 显示，细 胞培养 弱毒 冻千苗保 存于一 2O℃和 4℃6／卜月 ，效价不变 10" ～ lO 浓度 注射免 疫草鱼，免 疫保 护力 均保 持 100 但 4℃组 10 浓度 免 疫保护力 降为 88．9 ，是 效价开始下 降的标志还是 偶然 现象?有 待进 一步 试验证 明。保存于室温 的冻 千 苗效价 下降较快，保存两个月 (春季 )，效价即呈下降趋 势，10 浓度 免疫保 护力 下 降 为8O ，保 存 6个月 (春、夏季 )效价 明显 下 降 ， 10 浓度 免疫 保 护力 只 剩33．3 <袭 5 )。 27 维普资讯 http://www.cqvip.com