第2卷第3期 V2,M3 20056月 South China fisheries fierce ,20 综述 草鱼病毒性出血病研究进屐 ,文六 中山大学生命科学院,广东广50 要:草鱼出血病是严重图扰着草鱼养殖业发展约-大疾病。根近几十年来于谈病的进最,就本色出 止病病原的生物学特性,、不同发现味之间的比较,子生物学究以及疾病的防治等方面进行综合评述,结 了草鱼出血病的研究现状及研究中待解快的问题,并提出了该领后的重点研究方向为进-步深人开 对该病的防治研究供参考,以提高草鱼养殖的生产率 关键嗣:草鱼出血病:呀畅肠孤病:分子生物学,病害防治 中分2号:8:1.41际订码:魔:63006-6 WANG Fanghua, LI Anxing Abstract: Gras car hemorhagic diseas is a sve ises ta fect the as car breding I the past several decades, progess chemical and ultra-structural characteristis o CRV, the molecular biogy researh drance, the cument strategis oa diagnosis and productivity of rs cap breding 草倒(ae是一种草食性 鱼类,烔养成本低,莽殖地城广,是我国淡水养鱼的要 草鱼出血病的行病学和病原研究 品种,其产量的占谈水速产量0%但生病害草鱼出血病流行于湖北、广东广面、江西江苏 多顽其中以草出血病最甚,给业来巨大的损、建,上,河南、河刘北,川等省、市,自区 失,因草鱼出病是*号究中的个重要课愿的接美),值的主庄状是口上下烦顶 近十年来,着现付计生物技术在全类病喜研究领部眼運明围、主,及鳍条基部充血,有联球突出 射,中国技作有对草维出血病喜的研究除鱼的成,可肌肉呈点状或状充,出,重 和以识他食来深人,得了很多突性的进,进步时全机肉红色壁充,但仍有性内天食 加深了人时于该认识本文赶仔综合评述,以物:肠系、周脂、螈,龜薰、乐,,肾也有出血 期为进+步深人开联对该的伤所先供参或血丝,数以状定名为草出t,截出童部位 不同可将该标的症状分为3类型:红肌肉型、红红鳃 :2060145第:200 作者简介:王方华(182-,男,士究生,从事水生经济动物病原于丝物呀究::scm 通讯作者李安,18ahm
第 2卷第3期 2006年 6月 南 方 水 产 South China Fisheries Science Vol. 2， Jun.， No. 3 2006 ·综述 · 草鱼病毒性出血病研究进展 王方华，李安兴 (中山大学生命科学学院，广东广州510275) 摘要:草鱼出血病是严重困扰着草鱼养殖业发展的一大疾病。根据近几十年来对于该病研究的进展，就草鱼出 血病病原的生物学特性、不同发现株之间的比较、分子生物学研究以及疾病的防治等方面进行综合评述，总结 了草鱼出血病的研究现状及研究中巫待解决的问题，并提出了该领域以后的重点研究方向。为进一步深入开展 对该病的防治研究提供参考，以提高草鱼养殖的生产率。 关键词:草鱼出血病;呼肠孤病毒;分子生物学;病害防治 中图分类号:S941.41十1 文献标识码:A 文章编号:1673 -2227一 (2006) 03 -0066 -06 Advances in research of hemorrhage of grass carp WANG Fanghua，Ll Anxing (The School of Life Science, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510275，China) Abstract; Grass carp hemorrhagic disease is a severe disease that afect the grass carp breeding. In the past several decades, progress has been made in the research of grass carp hemorrhagic disease in China The most important advances about GCRV including the biochemical and ultra-structural characteristics of GCRV，the molecular biology research advance, the current strategies on diagnosis and control of GCRV. Here we review these progress and put forward the questions we should resolve in the future, hoping to enhance the productivity of grass carp breeding. Key words; hemorrhage of grass carp; Aquareovirus; molecular biology;disease prevention 草鱼 (Ctenopharyngodon idellus C et V)是一种草食性 鱼类，饲养成本低，养殖地域广，是我国淡水养鱼的主要 品种，其产量约占淡水养殖总产量的20%。但草鱼病害 多，而其中以草鱼出血病最甚，给养殖业带来巨大的损 失川，因此草鱼出血病是我国水产研究中的一个重要课题。 近十年来，随着现代分子生物学技术在鱼类病毒研究领域 的广泛应用，中国的科技工作者对草鱼出血病病毒的研究 和认识也愈来愈深人，取得了很多突破性的进展，进一步 加深了人们对于该病的认识。本文对此进行综合评述，以 期为进一步深人开展对于该病的防治研究提供参考。 1 草鱼出血病的流行病学和病原研究 草鱼出血病流行于湖北、广东、广西、江西、江苏、 浙江、福建、上海、河南、河北、四川等省、市、自治区 的主要养鱼地区。病鱼的主要症状是口腔、上下领、头顶 部、眼眶周围、鳃盖、鳃及鳍条基部充血，有时眼球突出; 剥除鱼的皮肤，可见肌肉呈点状或块状充血、出血，严重 时全身肌肉呈鲜红色;肠壁充血，但仍有韧性，肠内无食 物;肠系膜、周围脂肪、缥、胆囊、肝、脾、肾也有出血 点或血丝，故以症状定名为草鱼出血症。根据出血部位的 不同可将该病的症状分为 3种类型:红肌肉型、红鳍红鳃 .收稿日期: 作者简介: 通讯作者 : 2006-01-04;修回日期: 王方华 李安兴 ， (1982一) E-mail ，男， 1&58@ 2006-01-10 硕士研究生，从事水生经济动物病原分子生物学研究。E-mail: sdzbwlh@ 163. com zsu. edu. cn
第3期 王方华等:草鱼病毒性出血病研究进展 67 主型和肠炎型。 蛋的形式存在,不含脂类9N温度(6 鱼出血病的发病季节长,每年6月下淘至9月胺是有一定的稳定性,但反复抹配会对病毒感染力有较大影闻 主要流行季节,高峰在8月,1求温5.30最为流行,航对2氯仿、乙等有机溶刘有一定的抗性,酸(: 死亡率高,高密黄同养的值种池危害更甚,含发生养的y39(:1)0不最这,完整病幸在氧化中的浮 草鱼全军瘦没。人工感染健莱草鱼,从感染到发病死约力密度约13yd。在蔗糖中浮度135 454-070,其病程有潜第期、前趋期和发另外,用蛋白酶或類酸处理(CRX,病滴度降有 展期3个阶段 巽在期年,腿样擎注到联有13组隐鸡养和特性 鱼病鱼,(4年开始怀疑它可能是种航忙疾病。0mt(并增猫和传代产生合体状 喜等用分病的方法从鱼组得到A说感染草,越数已建起多32该的1 获得型出血状并在单层细中传代繁柱,才迁式系。病复在,能形成温格排列在体 定草鱼出春是由病喜起其根播病的形态和理化细培中最2-感2即开 特性,将其定名为草鱼场(1:p2,14.2h大量增瓶,使细产生典型的病浮变化 0N,)病喜求属水生呼备8属(4h0,减直2m5d达到最 是中国分离的第种鱼类病0能染草鱼外￥,病的最鸡0后逐平缓于病邮 还能感染青麦楼鱼、布氏餐条和等,并能使这几单到机理、式范围及病的检测有商系的 鱼发生出血病症状而死亡,尤其是有死亡率高达 00该联的计观13不同地区分离的比较研究 主朋,能、鼻内支双有3前我道了多对该的分高各含 在另,王树坚等首报道了出血病鱼组织电 株的特行了册究道,时于各之间 硏究中发现了2种病毒願粒,一种是呼肠减病毒,另-种 的差异比较尚见有系统的报道。而就相关的分离抹进 是23m大的精精到是请传进的 RM病,后为单0N0这2系分,)进-建支病请的系化树提参 分别感草可孩不同的发麻吗肠喜比分离线性的0出同分萬妹 主要导致“出血型症状,另-种病毒(经初步鉴定属 杭原蛋白或基之间的主别,可为下一步亚单位疫苗和基 于小科援要导出生,的新楼生体,从而出保车美商的 转果时也爆不同状编职天能对有鸡〔保点 于隼小N解我单东的惠及用8种有魔保有分的 病的关系,未见有进-步的报道 对不同地区分离株的比较有较大的实历意义,应加大对这 2呼肠孤病毒的生物学特性研究进晨 方面研究力,补在该病李研所究中的空 2l病毒综构研究 31不同毒株力间核酸分子量的比较 近来,随最电使技术和计算三重鸡方法的2喜慧计子见表,从表中可以看出 丞步用,对于病毒的三维结构更糖的午正爱步0N间其基组油N段组成不 聂开,联近方等该分的集重同的,请总分子美不大,酯各片 与材克蛋台件果:N多层计量有排单间它们的基围图AE图 包图核中层号外克层20个楼1普中包可反来于这不同刚 B对称列的体构成外克美是在5次比的哥充可描这水生呼图孩病不成多 轴上出现三聚体R区,中体单位,的个标准另-步探时些不同基因片段解的 内克品1单成#特场美第,可以为进弄清组成该航请编构杯不 等成付内衣克8.过优0F完蛋我的美￥ 整献进电分,51日31不同病细鸡特性项性的较 组分(Wm分于量在3438:2间 现建立起多株对0N2感的编速(系,0不 22GN的理化特性呀究 同分离株对胞的感染性方面存在一定的差别葬 N接针质线总成,还含有少坐类,3等18219
第 3期 王方华等:草鱼病毒性出血病研究进展 盖型和肠炎型。 、 ‘草鱼出血病的发病季节长，每年 6月下旬至9月底是 主要流行季节，高峰在 8月，在水温 25一30℃最为流行， 死亡率高，高密度饲养的鱼种池危害更甚，常发生养殖的 草鱼全军覆没。人工感染健康草鱼，从感染到发病死亡约 需4一15 d，一般7一10 d，其病程有潜伏期、前趋期和发 展期 3个阶段。 早在1953年，倪达书等「’]就注意到具有出血症状的草 鱼病鱼。1954年秋开始怀疑它可能是一种病毒性疾病。陈 燕0等用分离病毒的方法从病鱼组织得到的滤液感染草鱼， 获得典型的出血症状并能在单层细胞中传代繁殖，才正式 确定草鱼出血病是由病毒引起。其根据病毒的形态和理化 特性，将其定名为草鱼呼肠孤病毒 (Reovirus of,grass carp GCRV)，该病毒隶属水生呼肠孤病毒属 (助uareoviridae) , 是中国分离的第一种鱼类病毒〔’〕。GCRV除能感染草鱼外， 还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏餐条和鳃等，并能使这几种 鱼发生出血病症状而死亡，尤其是稀有峋螂死亡率高达 100%。电镜观察患病鱼的组织切片发现，在其肝脏、心 脏、肌肉、肾脏、脾、鳃和肠道内都发现有病毒粒子的存 在。另外，毛树坚等川曾报道了从出血病病鱼组织的电镜 研究中发现了2种病毒颗粒，一种是呼肠孤病毒，另一种 是20 -30 nm大小的病毒。经病毒的核酸分析，前者是双 股RNA病毒，后者为单股 RNA病毒，并且用这2种病毒 分别感染健康草鱼，可导致不同的发病症状:呼肠孤病毒 主要导致 “肠出血型症状” ，另一种病毒 (经初步鉴定属 于小RNA病毒科)主要导致 “肌肉出血型”出血病。此 结果同时也初步解释了出现不同症状出血病的原因。但关 于草鱼小RNA病毒导致草鱼出血病的病理机制以及病原和 病症的关系，未见有进一步的报道。 2 呼肠孤病毒的生物学特性研究进展 2.1 病毒结构研究 近年来，随着低温电镜技术和计算机三维重构方法的 逐步应用，对于病毒的三维结构更精细的研究工作正逐步 展开，最近方勤等〔4]对该病毒分辨率达到17埃的三维重构 与衣壳蛋白特性研究。结果表明:GCRV颗粒呈多层排列， 包括RNA核心与内壳层、中间层与外壳层。由200个按T =13对称排列的三聚体构成外衣壳。其典型特征是在 5次 轴上出现三聚体缺失凹陷区，暴露出中间层三聚体亚单位， 内壳层由120个单体构成，按T二1排列。结构特点与呼肠 孤病毒科成员内衣壳特征相一致。通过对纯化的GCRV完 整颗粒进行电泳分析，揭示成熟的病毒含有7种衣壳蛋白 组分 (VP1一VP7 )。分子量在34一138 kDa之间。 2.2 GCRV的理化特性研究 GCRV主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量的糖类， 以糖蛋白的形式存在，不含脂类[’〕。GCRV对温度 (5690 ) 有一定的稳定性，但反复冻融会对病毒感染力有较大影响， 病毒对氯仿、乙醚等有机溶剂有一定的抗性，对酸 (pH二 3)、碱 (pH二10)处理不敏感，完整病毒在氯化艳中的浮 力密度约1. 36 g " mL-' 。在蔗糖中浮力密度为1.305 g-m-3, 另外，用胰蛋白酶或精氨酸处理 GCRV，病毒滴度都略有 上升:‘丁。 2.3 细胞培养和感染特性 GCRV能感染培养细胞并增殖和传代，产生合胞体状 细胞病变效应 (CPE)。现已建立起多株对GCRV敏感的细 胞系川。病毒复制部位在胞浆，能形成晶格状排列，在体 外细胞培养中最佳增殖温度为2890，一般感染12 h后即开 始增殖，24一72 h大量增殖，使细胞产生典型的病理变化 (CPE)，形成直径约为2 mm的空斑}&'. 5 d左右达到最大 增殖，此时病毒的滴度最高，以后逐渐平缓。关于病毒的 致病机理、宿主范围及病毒的检测曾有系统的综述!9一川。 3 不同地区分离株的比较研究 目前已经报道了许多对于该病的分离株，并对各分离 株的特性分别进行了研究报道〔12一”」，但对于各分离株之间 的差异比较尚未见有系统的报道。而就相关的分离株进行 比较研究，有助于认识该病毒的遗传差异与进化、病毒的 区系分布等，为进一步构建该病毒的系统进化树提供参考。 同时通过比较各分离株免疫原性的差异，找出不同分离株 抗原蛋白或基因之间的差别，可为下一步亚单位疫苗和基 因疫苗的制作提供一些依据，从而能制备出保护率更高的 并能对所有GCRV病毒分离株进行免疫保护的疫苗，解决 目前一种疫苗不能保护鱼抵抗所有分离毒株的难题。因此 对不同地区分离株的比较有较大的实际意义，应加大对这 方面的研究力度，弥补在该病毒研究中的空缺。 3.1 不同毒株之间核酸分子A的比较 各毒株之间核酸分子量比较见表 1。从表中可以看出， GCRV不同分离株其基因组都由11个dsRNA片段组成，不 同的毒株之间，病毒基因组的总分子量差异不大，而各片 段分子量有所差异〔14,17]。这一点从它们的基因组PAGE图 谱中也可反映出来[’“〕。而对于这些不同毒株间基因组序列 比对的研究可作为描述水生呼肠孤病毒属不同成员多样性 的一个标准。另外进一步探讨这些不同基因片段所编码的 蛋白之间的差异，可以为进一步弄清组成该病毒结构的不 同蛋白及其所执行的功能差异奠定基础。 3.2 不同病毒株细胞感染特性和致病性的比较 现已建立起多株对GCRV敏感的细胞株 (系)， 但不 同分离株对细胞株的感染性方面存在一定的差别。李军 等〔”〕比较了GCRV861和GCRV873 2毒株的组织培养特性
南方水产 表1N不同地区分离病毒基因片段分子量大小比较 Tab 1 Comparison of the molealar weight of GCRV 总分理量 1 SI 2 5. S 5 MI MCN9:027.113160918055所 09(长)1225218131088010815A4将 0892:521012131080850403016 0m(37121:82125101418116090852 发现0780感0草鱼音班组0K8CK细胞,进行了0N各基因片段的字到分折。该成果将RN 8341,养细大部分裂解,:+观美型的细断同源性进化研究及各基片段新所编鸡的蛋白 病变效应(0),78感08和C0质结构功能哥究美定良好的基础 ,续供至⑩代也末明的0E另外,在新究中还42GRN体内与体外转录和翻泽呀究 发现,RF染细的能其感染鱼体的毒力并不都C基国因的转录和过程都是在宿主胞质中 是致,031.染,对鱼体的毒完成肉,病毒技酸可穿过核上的中空打状物释放到宿主 力却较0N8则恰反32,方勤等对细细质中:近年来研:8N核含有 低蛋保存的3草鱼减毫088鸡化中的-条装技合成EN 089满9行细毒该鸡的最适活温度是28,日能保持长的反应时 感特的果,低前3株在间在60队A各段全 长时间其详有所低0定g0,传节段度饭反比,BM合要所子浓度话 代后,毒力逐渐升高并于孩,并有结果表明不同装的上有别于明场减麻的其 地区分离病毒的胞该染特性是有所不同的,其中南它成,这是于它们各的所应不同的宿4 地区分的9则性,2一结果与南保预9国间体付转录 地区高的发肯死亡宰也是相台的 为早2期,早努转录是在病毒感染细后4开始的, 81后开始宠期转,转录产物aM的大小和数日大体上 病毒的分子生物学研究进展 与病毒基因的致早期转是NH转录以初始感 的病毒dRN为模板进行的转录:晚期转录则是以子代病 41病毒基因克隆与文库构建研究 基因际组为慎板进行的转录,二者没有本质上的差别, 自193年首次分离F以来,今已有十多年的历 是转录模板的来原不同。 史。由0CRN含1条双分段EMA基因以及其32骗 方等2进行了该病R聚合基园保守区重组 不含购(尾特低,得其基因文支建+041射能区片列在原核8中的表达哥究, 的及性:E选日前最的文多到1上维球该 明阻合成倒该法均周计单数后年基含区外 进行相天种属序列的月及填的分以获得化,此了含保区N￥含像的 物到,从面构建类病新队文9都基图,0食该都在联 库由(8N评场病请联新,在无法同的表过水平及表达产物的生物学,根对酶的功 源序列比的情况下,采用机引物法:0N合成不线观,在BN病喜周同期转录调节翻泽中, 失为一种育单可行的策略。等用方法,)址:R53时于楼N解0N模板 扩特得到了第9般等方等2是至关重要的果3NM合酶特 在原有随机引物法的基础,通过进行一系列到条件比较,性分析提供(了依,并为进-步傅特测定与特性分析模莫 采用微克级模板,成功地建了0N23、定了基础。 .S,,9001N女库并用所构建的文库日前,)未见到天关0N体内的报道但是对
南 方 水 产 第 2卷 表1 GCRV不同地区分离株病毒基因片段分子A大小比较 Tab. 1 Comparison of the molecular weight of GCRV 病毒株 基因组片段/kb fragment of genome 总分子量 isolate Ll U L3 Ml M2 M3 Sl S2 S3. S4 S5 MV MGCRV-875(武汉南湖株)[141 GCRV-861(武汉东西湖株)〔”〕 GCRV-873(湖南邵阳株)is] GCRV-991(湖南长沙株)[161 GCRV-854(湖北仙桃株)[”] GCRV-D2(未知株)[15] 2.75 2.47 2.26 1.52 2.85 2.70 2.65 1.30 3. 10 2. 70 2. 33 1.34 2.61 2.55 2.28 1.39 2.45 2.28 2.24 1.50 2.48 2.47 2.26 1.52 .40 .25 0.60 0.75 15.06 16.28 .25 0.57 .34 0.58 15.46 14.48 .42 .40 1.38 1.06 0.91 0.89 1.20 1.04 0.95 0.89 1. 21 0.87 0.82 0.71 1. 27 0.89 0.81 0.71 1.30 1.00 0.80 0.55 1.38 1.30 1.06 0.91 0.54 0.89 0.55 0.70 0.55 0.55 0.30 0.60 14.06 15.52 发现 GCRV873株感染草鱼肾脏组织 CIK和 GCK细胞， 28℃培养3 -4 d后，培养细胞大部分裂解，出现典型的细 胞病变效应 (CPE)，而GCRV861株感染 CIK和 GCK细 胞，连续传至 10代也未见明显的CPE。另外，在研究中还 发现，GCRV感染细胞的能力与其感染鱼体的毒力并不都 是一致的，GCRV873对培养细胞感染力强，但对鱼体的毒 力却较弱。而GCRV861株则恰相反[16,19-20]。方勤等[21〕对 低温保存的3株草鱼呼肠孤病毒GCRV873, GCRV875, GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒 感染特性的研究。结果发现，低温保存的前 3株病毒株在 长时间保存后其滴度有所降低，但仍有一定感染性。经传 代培养后，毒力逐渐升高并趋于稳定，并有结果表明不同 地区分离株病毒的细胞感染特性是有所不同的，其中湖南 地区分离的873, 991毒株感染特性最强。这一结果与湖南 地区高的发病死亡率也是相吻合的。 4 病毒的分子生物学研究进展 4.1 病毒基因克隆与文库构建研究 自1983年首次分离GCRV以来，迄今已有十多年的历 史。由于GCRV含11条双链分段 RNA基因组以及其3’端 不含poly( A)尾的特性，使得其基因组文库的构建具有一定 的难度及复杂性。虽然目前最为普遍的cDNA文库构建多 采用RT-PCR合成。DNA，但该方法均需借助计算机数据库 进行相关种属序列的同源性及保守区域的分析，以获得 RT-PCR的引物序列，从而构建同类病毒新毒株的cDNA文 库。由于GCRV为呼肠孤病毒科新属新种，在无法进行同 源序列比较的情况下，采用随机引物法引导cDNA合成不 失为一种简单、可行的策略。LI等〔22]用此方法，通过PCR 扩增得到了GCRV861株第6, 9节段部分序列。方勤等〔”] 在原有随机引物法的基础上，通过进行一系列条件比较， 采用微克级模板，成功地构建了GCRV-RNA LI, L2, L3 , M6,，、S9, S10, Sil的cDNA文库。并用所构建的文库 进行了GCRV各基因片段的序列分析。该成果将为 GCRV 以后的同源性比较、进化研究及各基因片段所编码的蛋白 质结构与功能研究奠定良好的基础。 4.2 GCRV体内与体外转录和翻译研究 GCRV基因组的转录和翻译过程都是在宿主细胞质中 完成的，病毒核酸可穿过核心上的中空钉状物释放到宿主 细胞的细胞质中。近年来的研究表明:GCRV核心内含有 RNA转录酶，可催化 dsRNA中的一条链转录合成 mRNA, 该酶的最适酶活温度是 28'C，且能保持较长的反应时 间[24[。在体外转录条件下，双链RNA各节段是全长转录， 各节段长度成反比，并且 RNA聚合酶需要低离子浓度活 化，GCRV转录酶的上述特征，有别于呼肠孤病毒科的其 它成员，这是由于它们各自所适应不同的宿主结构的缘故。 张保焰和柯丽华〔25]研究还发现，GCRV基因组的体内转录 分为早晚2期，早期转录是在病毒感染细胞后4h开始的， 8h后开始晚期转录，转录产物 mRNA的大小和数目大体上 与病毒基因组的一致。早期转录是 RNA转录酶以初始感染 的病毒dsRNA为模板进行的转录;晚期转录则是以子代病 毒基因组为模板进行的转录，二者没有本质上的差别，只 是转录模板的来源不同。 方勤等[ 26〕进行了该病毒RNA聚合酶基因保守区重组 子 (GCRV-RdRp)功能区序列在原核细胞中的表达研究， 并得到高效表达的融合蛋白，最近又在此基础上继续对该 聚合酶基因含保守区的5‘与3’末端序列进行了体外表达与 纯化研究，由此构建了含保守区GCRV RNA聚合酶的N端 与C端部分基因的重组表达质粒，以确定该基因在原核细 胞的表达水平及表达产物的生物学特性。根据对该酶的功 能研究发现，在 RNA病毒复制周期的转录调节与翻译中， 5’与3’末端序列对于双链 RNA解旋与单链 RNA模板的结合 才是至关重要的[”]。上述研究结果为GCRV RNA聚合酶特 性分析提供了依据，并为进一步酶特性测定与特性分析奠 定了基础。 目前，尚未见到关于 GCRV体内翻译的报道。但是对
第3期 王方华等草鱼病喜性出血病研究进展 于CRN在体外译的研究结果表明:草鱼出血病穿透功能 RNA的一条进有m8N4的性质,可在体外进行翻译 其梨泽产物为1条多欣链,与病李的结多欣是-致的, 5草鱼出血病的防治研究进 限.织5精1单鱼出止病的疫黄防沿究 在好子上有美2这体外计物可1幸鱼出上锦是种病李性航危害大来 构多的成热间产轨,在宿主组内配程中地当年草死率般3.%,最高可6 要进-步的修饰加工 8%。疫预防是该病最有效的防治方法之一。因此疫 43病毒基因组结构研究 苗对该的防治意义重大。对于草鱼出血病毒疫 草值(P9由制大经织天话造、减幸活度、重单位疫苗 1个A片段组议,不同的斜解车到图的总第酸,在的吗天安足多 美不大(50,各片段分量有新法的请,大量(常是必须)风可 ,数分量大小、1个可32较大片段呢同或全身的反应,苗不能进(MH0类抗 u1.B等段(.0)8小片段薏,不能有数:0并所获得的免 S..s.S.清等”0R8￥图是至的,须发前减喜较由子在 究,首次发现该麻喜基因外存在损生于优的致航性,0漫过召国复联性的潜在,活段 喜基型到付,+从中送出2条数性产还可造成染,全生产过程来的在有物 进行了序列分折,0定了其性质,其只是基质图在成本生产技术上要求高分外,上述2 图钱,爆基想核是经切、重话并错包最种淡值的士要点是需要冷*保存,这既增加成本又影 人前单衣克而成,英台身属性快定其至基配组中引了响支态,影在发中家相使,重 众多预没有的信息,使之成为新究淡度单位值封备度,本高美来技术量高 制,装过程以及调控信息的有和工具 因此也没有得到推广应用。而众所周知,理想的疫苗应具 44病毒蛋白功能研究 备的特有:安全,廉价,热稳定性好、含有多种具有保 等”)病毒基因所编码的蛋白功能进行了详细的#用的原,最好是次口服即可生数。目萌常规疫 描述:()病毒核衣克18,分别由基因段没有一个能完全满足上进标准因此基因疫苗应运而士。 3和编码,为孩心克的要成分,它们在病毒的转录基因疫苗与传统疫苗相比有-2明显优点,主要表现在以 与复制及病毒核衣克形成中起着重要的作用。W至蛋白序下几个方面:()基天苗接种后,抗原蛋白在宿主细胞 列具有核酸结合位点,)外还买有解款酶和BM三酸内表达,1加工处理过程与原的自然染类似,抗原呈递 酶AP活话性,其主要参病转过中基国组〔链的过程也相同,而可以导机体产生细和体液,度:(2) 解散化的能量供应,但项的发离不开7的抗原基因在体内存在时间比较长,不断新表达抗原蛋白,持 帮助,其在病V棱克构象形成中具有+分重要的功能。5给免安系统提供刺,因而能够激机体产生较强被 月外统还发观1%有55结合第+(2)薛钉持久的答;(3)可以将包含不同抗原基因的质粒混 状物突起,W蛋白五体蛋白为订呼场减2基图进行联接:(4)质粒载体没有免我变原性,可以反复 片没编吗,已实蛋与外克蛋白W和以及使用。总之基因疫首以其抗原性生蛋、保护时间长、效造 内衣壳和12有很强的该合作用与相联系:序列及方、输方便而越来越受到人们的重。成为 结持分析表明:W蛋白具有乌酸转移和2种甲基化种全新的变成 活,与mEN5未端的甲基化有关,(3)微量核组就草鱼出血病的致病呼肠孩病毒来说,现在我们已经 升W和网4,分别出基国片段1M节段所编玛、得到了其病毒时全部基因片段,并建立了相应的基因文库 W为RN合,谈蛋白位于内克层5次欢对称轴道孔2基因表达计的图库等>计N单个多务进 溺处,参新生MN的起始合成1N蛋白的用可行了系性究,并出1免疫原性强的多饭 为病毒复制中的-种调节蛋白,在病毒转录复过程中段,这明单个多知抗原能刘(机体中和抗体的产生 物同W共同定NP衡活性,、(4)航外衣克结构蛋而我们已经知道了编吗这个多的基因序列,因此完全可 日M、N编码的病蛋白和团构成请外衣克组以通过将这段芹列号载体结合制成基因安苗来免疫革鱼 W和蛋白果有介导病喜进人寄主胞质的别外,逦可将不同地区发现的喜抹中免原性强的多默 功能,此外Ⅳ逐可走行构象的变,其作用是保证漠穿联制成联合免疫,以提商草色对不同毒求的抗性。相 透,病薛粒子V果有同7蛋白通过构象变化行使膜这将是含有意并且实用价值的研究内容。可为度苗
第 3期 王方华等:草鱼病毒性出血病研究进展 于GCRV在体外翻译的研究结果表明:草鱼出血病病毒 dsRNA的一条链具有 mRNA的性质，可在体外进行翻译， 其翻译产物为 11条多肤链，与病毒的结构多肤是一致的， 只是片段 S2, S3, S5编码的多肤与病毒衣壳中的结构多肤 在分子量上有所差异{281。推测这些体外翻译产物可能为结 构多肤的非成熟中间产物，在宿主细胞内装配过程中还需 要进一步的修饰加工。 4.3 病毒基因组结构研究 草鱼呼肠孤病毒 (Grass carp reovirus GCRV)基因组由 11个dsRN A片段组成〔11,291，不同的毒株间病毒基因组的总 分子量差异不大 (约15x1护Da)，而各片段分子量有所差 异，按分子量大小，11个片段可分为 3组，即较大片段 (L1 , 12, L3 )、中等片段 (Ml, M2, M3)和较小片段 (S1,S2,S3,S4,S5)。邱涛等〔30〕通过对GCRV873基因 组研究，首次发现该病毒基因组外存在缺损性干扰颗粒的 病毒亚基因组分，并从中筛选出2条缺损性干扰颗粒cDNA 进行了序列分析，确定了其性质，因为其基因组只是亚基 因片段，为原基因组核酸片段经剪切、重排并被错误包裹 人病毒衣壳而形成，其自身属性决定其亚基因组中携带了 众多正常病毒颗粒所没有的信息，使之成为研究该病毒复 制、装配过程以及调控信息的有利工具。 4.4 病毒蛋白功能研究 方勤等f”一对病毒基因所编码的蛋白功能进行了详细的 描述:(1)病毒核衣壳组分VP3和VP6，分别由基因片段 L3和S2编码，为核心衣壳的主要成分，它们在病毒的转录 与复制及病毒核衣壳形成中起着重要的作用。V P3蛋白序 列具有核昔酸结合位点，另外还具有解旋酶和RNA三磷酸 酶/ATP酶活性，其主要参与病毒转录过程中基因组负链的 解旋与帽化的能量供应，但VP3功能的发挥离不开VP6的 帮助，其在病毒VP3核壳构象形成中具有十分重要的功能。 另外研究还发现 VP6有弱的dsRNA结合能力。(2)病毒钉 状物突起 VP1, VP1蛋白五聚体蛋白为呼肠孤病毒 L2基因 片段编码，已证实VPl蛋白与外衣壳蛋白VP7和VP5以及 内衣壳VP3和V P2有很强的亲合作用与相互联系。序列及 结构分析表明:VPl蛋白具有鸟昔酸转移酶和2种甲基化 酶活性，与mRNA 5‘末端的甲基化有关。(3)微量核心组 分 VP2和 VP4，分别由基因片段 L1和 M1节段所编码。 VP2为RNA聚合酶，该蛋白位于内壳层5次对称轴通道孔 洞处，参与新生 mRNA的起始合成。VP4蛋白的作用可能 为病毒复制中的一种调节蛋白，在病毒转录与复制过程中 协同VP3共同决定NTP酶活性。 (4)病毒外衣壳结构蛋 白，Mi、S4编码的病毒蛋白VP5和VP7构成病毒外衣壳组 分，VP5和VIY7蛋白具有介导病毒粒子进人寄主细胞质的 功能，此外 VP5还可进行构象的改变，其作用是保证膜穿 透。病毒粒子VP7具有协同VP5蛋白通过构象变化行使膜 穿透功能。 5 草鱼出血病的防治研究进展 5.1 草鱼出血病的疫苗防治研究 草鱼出血病是一种病毒性鱼病，危害很大，感染此病 后，当年草鱼死亡率一般为30%一50%，最高可达60%- 80%。而免疫预防是该病最有效的防治方法之一。因此疫 苗研制对该病的防治意义重大。对于草鱼出血病毒疫苗的 研制大致经历了组织灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗 等阶段，但都存在一定的缺陷[323。组织灭活疫苗须含足够 的病毒才能引起免疫应答，而大剂量 (常是必须的)又可 引起局部或全身的反应。该疫苗不能进人 MHCI类抗原呈 递途径，因此不能有效的诱导 CTL反应，并且所获得的免 疫性一般是短暂的，须激发注射。而减毒活疫苗由于存在 致病性、刺激性过强和回复致病性的潜在危险，而且活疫 苗生产还可能造成污染，含有生产过程带来的潜在有毒物 质，因此在成本和生产技术上要求比较高。另外，上述2 种疫苗的主要缺点是需要冷冻保存，这样既增加成本又影 响有效寿命，尤其是影响其在发展中国家的推广使用。亚 单位疫苗由于制备过程复杂，成本高，要求技术含量高， 因此也没有得到推广应用。而众所周知，理想的疫苗应具 备的特征有:安全、廉价、热稳定性好、含有多种具有保 护作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前常规疫 苗没有一个能完全满足上述标准。因此基因疫苗应运而生。 基因疫苗与传统疫苗相比有一些明显优点，主要表现在以 下几个方面:(1)基因疫苗接种后，抗原蛋白在宿主细胞 内表达，加工处理过程与病原的自然感染类似，抗原呈递 过程也相同，因而可以诱导机体产生细胞和体液免疫;(2) 抗原基因在体内存在时间比较长，不断表达抗原蛋白，持 续给免疫系统提供刺激，因而能够刺激机体产生较强和较 持久的免疫应答;(3)可以将包含不同抗原基因的质粒混 合进行联合免疫;(4)质粒载体没有免疫原性，可以反复 使用。总之，基因疫苗以其抗原性强、保护时间长、改造 方便、制备和运输方便而越来越受到人们的重视。成为一 种全新的免疫方式[”;。 就草鱼出血病的致病呼肠孤病毒来说，现在我们已经 得到了其病毒的全部基因片段，并建立了相应的基因文库 及基因表达多肤的图谱。王炜等[34〕曾对GCRV单个多肤进 行了免疫原性研究，并筛选出VP6为免疫原性强的多肤片 段，这说明单个多肤作为抗原能刺激机体中和抗体的产生。 而我们已经知道了编码这个多肤的基因序列，因此完全可 以通过将这段序列与载体结合制成基因疫苗来免疫草鱼。 另外，还可将不同地区发现的毒株中免疫原性强的多肤片 段制成联合免疫疫苗，以提高草鱼对不同毒株的抗性。相 信这将是非常有意义并且实用价值的研究内容。可为疫苗
南方水产 究方面开有一条新的思路。但由于基因饺苗的发展刚细病变抑制法联定了病幸诱导前后草鱼外周血中干狱 处于起始阶段,对于基因疫苗在色体内的作用和代谢机制的活性变化,结果表明经毒诱导的草鱼血请中出现明显 还不完全清楚,其便捷实用的使用方法和适宜剂量也需要的千状素抗病毒活低,并计素话性因子进行了理化性 实验的深(研究外,对于基变苗中所用抗原基因6(:08话防是过号合 的分离技标还像不成热,抗原表达控元件的优有待成证状素来实观,类千素究入仅为千北 于步的索。但可以肯定,未来更多的效安全使素的分进化和比免变学等基分究提供资料,有重 用方便的基国疫制备和大规模生产,4将能够促进我要的用配,而且在鱼病中有广间的应用前景 国草鱼养殖的发展 特别是通过草鱼于素研究有可能月我国水产殖中的草 52菲鱼出血病的中草药防治 色出血病治开新的途径 中草药具有天然、商效幸面件用小、抗药性着、近年来,国学者采用化学合成法或基因工程法建 资源丰富以及性能多样化等优点,在防治鱼病中,了兼随机狱库,研究蛋白质之的分子识别、与底物的结合 有药性和性外,还具有提高水产动物生产性能和用料原抗体相件用,成的快有 利朋摔的功效。因此应用中草药5治鱼病越来受到人们潜力大的技术,广泛应用于分子识有关饭城,如 的关注,并特选出许多在生产应用中之有单方、抗生素,抑制,小分子药物没计,重组变苗 验方3)在分及预战草鱼出血中应用的最多的中设计及病李高亲和力的杭体信治及免疫,由于 药大太等人技术要的值0用前,1项 分草鱼出经的上,过反复,用￥日、具大潜力的病毒)路8来受到重视,冰 太黄生根、有、等十几种中单药淘成方8￥甲队魔库中单预魅 球止值款,用于草出址,查海果表,异性结合的短取子,并能有的中和病阻精 有车在9以:右08:是中草药在第这的是了技在体外简选裤 草鱼出血病中银好的应用例子。 制剂可影性,并为高效杭病毒短联制剂的及办分子抗病 中草蛋杰航方面有+定的在炼读的计打 应用中也存在许多问题,集中表现在以下几个方面:1() 朝魔不球节、产方法等不月铁效 一种中草药,共有效成分含量差异很大,有时同样的配方 l]毛乇坚,建忘,杭錡,等草鱼出血病铈原联究水 却效不同。(2)加工艺原始,日前中草药的加工大多 产学,991 用大,口性也,不利于规模化生产应眼应采取.9围1 进的生产工艺,对中单练走取着制,使其黄量中科续水性生所所单鱼编病面粉 化,系列化、专用型方发展(4)对用中草药的药、究]879:31 理方面研究不足,对其有效成分难以确认,使用的剂量4旗草呼病革的三维构衣壳蛋白特性(国 没有严格的标家准。因此应加强在这方面的研究,如强对中806:13 草药迸行提纯和治疗机理方面的研究,克分台淫开我国延王球,丽华等拿出血病的蛋白椭特的多 的中单药资源,0补在中药究上的)使中草药航09154 在防治鱼病方面发挥其应有的作用。 6】曾令兵,袁明雄草鱼出血病喜高滴度培养方法物研究 53草鱼出血病的其它防治方法研究 淡水,0,53(4:44 章怀等8用外原DN5处加,e2(1(藏建苏续将车装 文库的构建(水生特,0:11 肝脏的总DNH以精子作载体处理草鱼受精,获得了数批 8丁清泉,余芬,王学,等草鱼出病鱼壬要官的 经外DNH处理的草鱼群体,并证明该看体在自然殖条 切片观察及感染力的比较(1水产学很,9,1 件下显示出一定的抗草鱼出血病的症状。￥当人工感染时, 其31:8倍付12,,蒋新,至,等就用取型技术测草值 鱼芬续间1-24.其具体机尚待进-究 出血病的究小水产学,1901:61 素是至发观的最想的种病生物性10年,,用合反接 物质,是一种主要细胞调节因子,具有抗病抗种和色击病鱼组]89,1 免疫周节等功1日前研究较为活,邵建等采用12:-
南 方 水 产 第 2卷 的研究方面开拓一条新的思路。但由于基因疫苗的发展刚 处于起始阶段，对于基因疫苗在鱼体内的作用和代谢机制 还不完全清楚，其便捷实用的使用方法和适宜剂量也需要 实验的深人研究。另外，对于基因疫苗中所用的抗原基因 的分离技术还很不成熟，抗原表达控制元件的优选也有待 于进一步的探索。但可以肯定，未来更多的高效安全、使 用方便的基因疫苗的制备和大规模生产，必将能够促进我 国草鱼养殖业的发展。 5.2 草鱼出血病的中草药防治 中草药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著、 资源丰富以及性能多样化等优点，在防治鱼病中，除了兼 有药性和营养性外，还具有提高水产动物生产性能和饲料 利用率的功效。因此应用中草药防治鱼病越来越受到人们 的关注，并总结筛选出许多在生产应用中行之有效的单方、 验方[”一’61。在治疗及预防草鱼出血病中应用的最多的中草 药有:大黄、黄柏、黄等、大蒜等。袁良萃[ 37〕在总结前人 治疗草鱼出血病经验的基础上，经过反复实践，利用当归、 大黄、板兰根、赤芍、虎仗等十几种中草药剂制成方剂 “景珠牌止血散” ，用于防治草鱼出血病，调查结果表明， 有效率在95%以上，治愈率占90%以上。是中草药在防治 草鱼出血病中很好的应用例子。 中草药虽然在防治鱼病方面有一定的功效，但在实际 应用中也存在许多问题，集中表现在以下几个方面:(1) 药材质量不稳定，由于季节、产地、炮制方法等不同，同 一种中草药，其有效成分含量差异很大，有时同样的配方 却疗效不同。(2)加工工艺原始，目前中草药的加工大多 以原药粉碎或切碎煎熬，其配方多为粗制型产品，剂量使 用偏大，适口性也差，不利于规模化生产、应用。应采取 先进的生产工艺，对中草药进行提取、精制，使其向微量 化、系列化、专用型方向发展。(4)对渔用中草药的药效、 药理方面研究不足，对其有效成分难以确认，使用的剂量 没有严格的标准。因此应加强在这方面的研究，加强对中 草药进行提纯和治疗机理方面的研究 ，充分合理开发我国 的中草药资源，以弥补在中草药研究上的空缺。使中草药 在防治鱼病方面发挥其应有的作用。 5.3 草鱼出血病的其它防治方法研究 章怀云等〔38]采用外源DNA处理方法，将鲤鱼精液、 肝脏的总 DNA以精子作载体处理草鱼受精卵，获得了数批 经外源DNA处理的草鱼群体，并证明该群体在自然养殖条 件下显示出一定的抗草鱼出血病的症状。当人工感染时， 其抗病力比普通鱼强3.98 -5.89倍。潜伏期长1-2d，死 鱼持续时间短 1-2d。其具体机制尚待进一步研究。 干扰素是至今发现的最为理想的一种抗病毒生物活性 物质，是一种主要细胞调节因子，具有抗病毒、抗肿瘤和 免疫调节等功能〔391。目前研究较为活跃，邵建忠等{[40〕采用 细胞病变抑制法测定了病毒诱导前后草鱼外周血中干扰素 的活性变化，结果表明经病毒诱导的草鱼血清中出现明显 的干扰素抗病毒活性，并对干扰素活性因子进行了理化性 质的研究。GCRV激活寄主抗病毒防御机制是通过诱导合 成和分泌干扰素来实现的，对鱼类干扰素研究不仅为干扰 素的分子进化和比较免疫学等基础研究提供资料，具有重 要的理论意义，而且在鱼病防治中有广阔的应用前景〔1410 特别是通过草鱼干扰素研究有可能为我国水产养殖中的草 鱼出血病防治开辟新的途径。 近年来，国外学者采用化学合成法或基因工程法构建 随机肤库，研究蛋白质之间的分子识别、酶与底物的结合、 抗原与抗体的相互作用，并使之成为一门新的快速有效、 潜力巨大的技术，广泛应用于与分子识别有关的领域，如: 抗生素筛选、酶抑制剂筛选、小分子药物设计、重组疫苗 设计及病毒高亲和力的抗体、肿瘤治疗及免疫治疗，由于 肤库技术具有如此重要的理论价值和应用前景，作为一项 具有极大潜力的抗病毒新策略，越来越受到重视。王冰 等〔411报道了从随机肤库中筛选出与草鱼出血病病毒颗粒特 异性结合的短肤分子，并能有效的中和病毒、阻止病毒感 染。这一新的途径提示了应用肤库技术在体外筛选抗病毒 制剂的可能性，并为高效抗病毒短肤制剂的及小分子抗病 毒药物的设计打下基础。 参考文献: [1〕毛树坚，邵建忠，杭绮，等.草鱼出血病的病原研究 [Jl.水 产学报，1989, 13 (1):1一4. [2]倪达书.我国鱼病学研究现状及其发展前景 「il.现代渔业信 息，1994, 9 (3):1一4. [3]中国科学院水生生物研究所三室病毒组.草鱼出血病病原的研 究 [il.水生生物学集刊，1978, 6 (3):321一329. [4〕方勤.草鱼呼肠孤病毒的三维结构与衣壳蛋白特性 【Jl.中国 科学，2005，35 (3):231一237. [5〕陈延，王炜，柯丽华，等.草鱼出血病病毒的糖蛋白和结构多 肤的抗原性 [il.病毒学报，1992, 3(1):57一61. [6l曾令兵，袁明雄.草鱼出血病病毒高滴度培养方法的研究 [il.淡水渔业，2000, 30 (4):40一41. [7]张义兵，石耀华，桂建芳.鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA 文库的构建[Jl·水生生物学报，200争，27 (2):113一118. [8]丁清泉，余兰芬，王学兰，等.草鱼出血病病鱼主要器官的超 薄切片观察及感染力的比较 〔Jl.水产学报，1990, 14 (1 ); 66一69. [9]邵建忠，项黎新，李亚南，等.应用Dot一ELISA技术检测草鱼 出血病病毒的研究 [1l.水产学报，1996, 20 (1); 6一11. [10〕李军，王铁辉，周立冉，等.应用逆转录聚合酶链反应直接 检测草鱼出血病病鱼组织的研究 〔Jl.水产学报，1997, 21 (2):175一179