《草鱼出血病》草鱼出血病病毒的研究进展

维普资讯hpw.qvi. 第30卷第4期 海洋与湖沼 Vol.30 No.4 1999年7月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA July, 1999 综述 45-453 草鱼出血病病毒的研究进展S43.112 李军王铁辉陆仁后陈宏溪 (中国科学院水生生物研究所武汉430072) 提要根据80--90年代中国关于草鱼出血病病毒研究的进展就草鱼出血病病毒的发现、形 态结构特征理化特性、基因组结构及其所编码的多肽基因组的转录和翻译过程病毒的繁 殖动态体外细胞培养特性病毒对鱼体的致病机理和宿主范围草鱼出血病的诊断和防治等 问题进行综合评述,总结概括了草鱼出血病病毒的研究现状以及研究中需要亟待解决的问 题并提出该领域以后的重点研究方向 y 关键词草鱼出血病病毒水生动物呼肠孤病毒研究进展 学科分类号945.1 草鱼出血病病毒隶属水生呼肠孤病毒属(Aquareoviridae)是中国分离的第一种鱼类 病毒,目前已经报道了10多个分离株该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼 Ctenopharyngodon idellus)在鱼种阶段发生出血病,死亡率高达90%以上,给水产养殖业 造成巨大损失。近20年来,随着鱼类病毒学的不断发展以及现代分子生物学技术在鱼类 病毒研究领域的广泛应用,中国的科技工作者对草鱼出血病毒(GCHV)的研究和认识也 愈来愈深人,取得了很多突破性的进展,丰富了鱼类病毒学的知识,尤其是进一步加深了 人们对于水生呼肠孤病毒特殊性的认识。本文对此进行综合评述以期为进一步深人开 展GCHV以及其它有关水生呼肠孤病毒的研究提供参考 1GCH的发现 关于草鱼出血病的研究最早始于本世纪50年代但正式对其病原体进行分离研究则 始于70年代末期, 由于抗菌素和磺胺类药物治疗无效,同时采用细菌学方法分离病原并 进行感染实验,不能使感染鱼发生出血病死亡,因此怀疑病原可能是病毒(湖北省水生生 物研究所三室1977)。后来用分离病毒的方法从病鱼组织得到的滤液感染草鱼,复制出 典型的出血病症状,并通过电镜直接观察到了病毒颗粒,证实了草鱼出血病的病原为病毒 (中国科学院水生生物研究所三室病毒组,1978,180)。通过对其形态结构和理化特性的 进一步研究,定名为草鱼呼肠孤病毒( Reovirus of Grass Carp,gcr)(陈燕新等, 1983)中国科学院武汉病毒研究所等(1983,1984b)也从患出血病的草鱼中分离到一株 类似的病毒,定名为鱼呼肠孤病毒(Fish Reovirus.RV)后来又有一些关于草鱼出血病 国家“八五”攻课题85722号李军,男、出生于1968年12月、讲师、现为香港中文大学生物系博士生 E-mail:hjum@cuhk edu hk 收稿日期:1997-07-18,收修改稿日期:199B07-23

第 3O卷 第 4期 I999年 7月 海 洋 与 湖 沼 OCEANOL0GIA ET LIM NOLOGIA SINICA VoJ．3O No．4 July， 1999 综 述 0 一 ～ 章弓鱼出血病病毒的研究进展．一 112- ／ 李 军 王铁 辉 陆仁后 陈宏溪 (中国科学 院水生 生物研究所 武汉 430072 提 要 根据 8O一90年代 中 国关 于草 鱼出 血病病 毒 研究 的进展 ，就草 鱼 出血病 病 毒 的发现 、形 态 结 构特 征 、理 化 特 性、基 固组 结 构及 其 所编 码 的多 肽、基 目组 的转 录和 翻 译过 程 ，病 毒 的繁 殖 动志 、体外 细胞 培养 特性 ，病毒 对 鱼体 的致 病机 理和 宿 主范 围 ．草 鱼出 血病 的 诊断和 防 治等 问题 进 行 综 台 评述 ，总 结 概括 了草 鱼 出 血 病 病毒 的研 究现 状 以及 研究 中需 要 亟 待 解 决 的 问 研 究进 展 草鱼 出血病病 毒隶属水生 呼肠孤病毒 属 (勘 uareoviridae)，是 中国分离 的第一种鱼类 病 毒 ，目 前 已经 报 道 了 l0多 个 分 离 株 ， 该 病 毒 主 要 引 起 中 国 淡 水 养 殖 主 要 品 种 草 鱼 (Ctenopharyngodon 如 ，，w)在 鱼 种 阶段 发生 出血 病 ，死 亡 率 高达 90％ 以上 ，给 水 产 养 殖 业 造成 巨大 损 失 。近 20年 来 ，随着 鱼 类 病 毒 学 的不 断发 展 以 及 现 代 分 子 生 物学 技 术 在 鱼 类 病 毒 研 究 领 域 的 广 泛 应 用 ，中 国 的 科 技 工 作 者 对 草 鱼 出血 病 毒 (G0 Ⅳ )的 研 究 和 认 识 也 愈来 愈深 人 ，取 得 了很 多 突 破 性 的 进 展 ，丰 富 了鱼 类 病 毒 学 的 知 识 ，尤 其 是 进 一 步 加 深 了 人 们 对 于 水 生 呼 肠 孤 病 毒 特 殊性 的认 识 。 本 文 对 此进 行 综 合 评 述 ，以 期 为 进 ～ 步 深 人 开 展 GCHV以及其它有 关水生 呼肠孤病毒 的研究提供 参考 l GcHv的发 现 关 于草 鱼 出 血病 的研 究 最 早始 于本 世 纪 5O年 代 。但 正 式 对其 病 原 体 进 行 分 离研 究 则 始 于 70年 代 束期 ，由于 抗 菌 素 和 磺 胺 类 药 物 治 疗 无 效 同 时 采 用 细 菌学 方 法 分 离 病 原 并 进行感 染实验 ，不 能使感染鱼发生 出血病死亡 ，因此 ，怀疑病 原可能是病毒 (湖北 省水 生生 物研 究 所 三 室 ，1977)。后 来 ，用 分 离 病 毒 的方 法 从 病 鱼 组织 得 到 的 滤 液 感 染 草 鱼 ，复 制 出 典 型 的出血病症状 ，并通过 电镜直接观察到 了病毒 颗粒 ，证 实了草鱼 出血病 的病 原为病毒 (中国科 学 皖 水 生 生物 研 究 所 三 室 病 毒 组 ，l978，1980)。 通过 对 其 形 态 结 构 和 理 化 特性 的 进 一 步 研 究 ，定 名 为 草 鱼 呼 肠 孤 病 毒 (Reovirus of Glass Carp． GCRV)(陈 燕 新 等 ， 1983)。 中 国科 学 院 武 汉 病 毒 研 究 所 等 (1983，1984b)也 从 患 出血 病 的 草 鱼 中分 离 到 一 株 类 似 的病 毒 ，定 名 为 鱼 呼 肠 孤 病 毒 (Fish Reovirus，FIW )，后来 又有 一 些 关 于 草 鱼 出血 病 · 国家 八 五 攻关 课题，857220902号。李 军 ，男，出生 于 I968年 I2B ，讲 师，现 为香港 中文大学 生物 系博士 生 E-1nmI：111rI1@cuhkedu．hk 收穑 日期 ： 1997~)7—18，收修改稿 日期 ： 1998q)7—23 维普资讯 http://www.cqvip.com

446 海洋与湖沼 30卷 类似的病毒分离株的报道(毛树坚等,1988,1989;柯丽华等,1990;王炜等,1990;曾令兵 等、1991.1992王铁辉等,993,1994)。现在习惯统称为草鱼出血病病毒( Hemorrhagic Virus of( Grass Carp、GCHv)(王铁辉等,1995) 2GCHv的形态结构特征 王炜等(1990)对GCHV873毒株进行了电镜观察,发现病毒颗粒呈53:2对称的正廿 面体,双层衣壳外径分别为72±3m和50±2nm;外层衣壳厚123±0.4m,内层衣壳厚 7.2±0.7nm;外层衣壳由92个中空型子粒组成,其中有12个五邻体和80个六邻体,结构 亚单位总数为6.0±04mm;六邻体直径为12.6±0.4mm,中心孔径为7.5±0.4m;衣壳三 角形面边长为42.5m,每边共有4个子粒,GCHV其它毒株均有类似的结构,但报道的病 毒颗粒大小有较大的差异,直径范围在55—80nm(陈燕新等,1983;中国科学院武汉病毒 研究所等,1984a;毛树坚等,1989a;柯丽华等、1990)。这可能是因为各春株大小的确存在 差异,也可能是由于实验误差造成的 另外,毛树坚等(1989b)报道,从忠出血病草鱼病变组织中观察到直径分别为70nm和 2nm左右的两种病毒颗粒,并经分离纯化获得病毒,通过形态学观察、致病性分析、核酸 定性测定,以及在鱼类细胞中的增殖特性研究,证实两者均为草鱼出血病的病原,并认为 前者为草鱼呼肠孤病毒,后者为草鱼小核糖核酸病毒。关于草鱼小核糖核酸病毒导致草 鱼出血病的病理机制以及病原和病症的关系,尚需进一步的探讨(邵健忠等,1990,1992) 电镜下还可看到GCHV的内层核衣壳及所附着的中空圆柱形钉状物,它们位于正廿 面体的12个顶点上,同五邻体子粒的位置一致,长度不及外层衣壳的厚度,不能伸到完整 病毒的外表面,其功能可能与复制时病毒核酸的释放有关,是病毒基因组片段的释放通道 (王炜等,1990)。 3GCHV的化学组成及理化特性 GCHV主要由蛋白质和核酸组成,还含有少量的糖类,以糖蛋白的形成存在,不含脂 类(陈延等,1992),完整病毒在氯化铯中的浮力密度约为1.36g/ml(柯丽华等,1990) GCHV对温度有一定的稳定性,但反复冻融会对病毒感染力有较大影响,病毒对氯仿、乙 醚等有机溶剂有一定的抗性,对酸(pH=3)碱(pH=10)处理不敏感(陈燕新等,1983;张 念慈等、1986),另外.用胰凝乳蛋白酶和酸性溶液处理GCHV病毒滴度都略有上升(曾 令兵等,1992)。 4GCHV的基因组及其所编码的多肽 GCHV基因组由11个 dsRNa(双链核糖核酸)片段组成,不同的毒株之间,病毒基因 组的总分子量差异不大(约15×10D),而各片段分子量有所差异。按分子量大小,11个 片段可分为三组,即较大片段LL2L、)、中等片段(M,M2M)和小片段(S1S2S3S S),见表1 柯丽华等(1992)对GHV-873完整病毒颗粒及其双层衣壳的多肽组成研究结果显 示,组成核病毒颗粒的结构多肽链有11条按其分子量大小分别为VP130(VP表示病毒多 肽,数据为分子量,单位为kd,即130kd,下同)、VPl15、VP100、vP90,VP80、VP73、VP67 VP50、VP43、VP36和P27。其中VP130、VP115.VP67、VP36、VP27为主要成分,这与国 外报道的鱼类水生呼肠孤病毒的多肽组成基本相同( Winton et a,1987)。进一步的研究

海 洋 与 湖 沼 类 似 的病 毒 分 离 株 的 报 道 (毛树 坚 等 ，1988，l989a；柯 丽 华 等 ，1990；王 炜 等 ，1990；曾令 兵 等 ，l991．1992；王铁 辉 等 ，l993，l994)。现在 习 惯 统称 为草 鱼 出 血病 病 毒 (Hemorrhagic VirusofGrassCarp GCHV)(王铁 辉 等 ，1995)。 2 GCHV 的形态 结构 特征 王 炜 等 (1990)对 GCI~r873毒 株 进 行 了 电镜 观 察 ，发 现病 毒 颗 粒 呈 5：3：2对 称 的 正 廿 面体 ，双层衣壳．外径分别 为 72±3nm和 5O±2nm；外层 衣壳厚 l23±O．4nm，内层衣壳厚 72±O．7nm；外 层 衣 壳 由 92个 中 空 型 子 粒 组 成 ，其 中有 12个 五 邻 体 和 8O个 六 邻 体 ，结 构 亚单位 总数为 6．0±O4nm；六邻体直径 为 12．6±O．4nm，中心孔径 为 7．5±O．4nm；衣 壳三 角 形 面 边 长 为 42．5nm，每 边共 有 4个 子 粒 GCHV其 它 毒 株 均 有 类 似 的结 构 ，但 报 道 的 病 毒 颗 粒 大 小 有 较 大 的差 异 ，直 径 范 围 在 55- 80nm (陈 燕 新 等 ，1983；中 国 科 学 院 武 汉 病 毒 研 究 所 等 ，l984a；毛 树 坚 等 ，l989a；柯 丽 华 等 ，1990)。这 可 能 是 因为 各 毒 株 大 小 的 确 存 在 差 异 ，也 可能 是 由 于 实 验 误 差 造 成 的 另 外 ，毛树 坚 等 (1989b)报 道 ，从 患 出 血 病 草 鱼 病 变 组 织 中观 察到 直 径 分 别 为 70nm 和 20nm 左 右 的 两 种 病 毒 颗 粒 ，并 经 分 离 纯 化 获得 病 毒 通 过 形 态 学 观 察、致 病 性 分 析 、核 酸 定 性 测 定 ， 及 在 鱼 类 细 胞 中 的增 殖 特 性 研 究 ，证 实 两 者 均 为 草 鱼 出 血 病 的 病 原 ，并 认 为 前者为草鱼 呼肠孤病 毒 ，后者 为草 鱼小 核糖核酸病 毒。关于草鱼小 核糖 核酸病 毒导致草 鱼 出 血 病 的病 理机 制 以 及 病 原 和 病 症 的 关 系 ，尚 需进 一 步 的探 讨 (邵 健 忠 等 ，1990，1992) 电 镜 下 还 可 看 到 GCHV 的 内层 核 衣 壳 及 所 附 着 的 中 空 圆 柱 形 钉 状 物 ，它 们 位 于 正 廿 面体的 12个顶点 上，同五邻 体子 粒的位置 一致 ，长度 不及外层衣壳 的厚度，不 能伸到 完整 病 毒 的 外 表 面 ，其 功能 可 能 与复 制 时病 毒 核 酸 的 释放 有 关 ，是 病 毒 基 因组 片 段 的释 放 通 道 (王 炜 等 ，l990) 3 GcHv的化 学组 成及 理 化特 性 GCHV主要 由蛋 白质和核 酸组成 ，还宙有 少量的糖 类，以糖蛋 白的形 成存在 ，不含脂 类 (陈 延 等 ，1992) 完 整 病 毒 在 氯 化 铯 中 的 浮 力 密 度 约 为 1．36g／m1(柯 丽 华 等 ，1990) GCHV对温度有 一定 的稳定性 ，但反复冻融会 对病毒感染 力有较大影 响 病 毒对氧 仿、乙 醚等 有机溶剂有一定 的抗性 ，对酸 (pH ：3)、碱 (pH： 10)处理不敏感 (陈燕新等 ，1983；张 念慈等 ，1986) 另外 ，用胰凝乳蛋 白酶和酸性溶 液处理 GCHV，病毒滴 度都 略有上 升 (曾 令 兵 等 ，1992)。 4 GCHV 的基 因组及 其 所编 码 的 多肽 GCHV 基 因组 由 11个 dsRNA(双 链 核 糖 核 酸)片 段 组 成 ，不 同 的 毒 椿 之 间 ，病 毒 基 因 组 的总 分 子 量 差 异 不 大 (约 15× 1OD)，而 各 片 段 分 子 量 有 所 差 异 。 按 分 子 量 大 小 ，l】个 片段 可 分 为 三 组 ，即 较 大 片 段 (L．L 、L )、中 等 片 段 (M 、M 、M )和 小 片 段 (S、s，、S、S Ss)，见 表 1 柯 丽 华 等 (1992)对 GcHv一873完 整 病 毒 颗 粒 及 其 双 层 衣 壳 的 多 肽 组 成 研 究 结 果 显 示，组成核 病毒颗 粒的结构多肽链有 ll条 ，按其分子量大小分别 为 VPI30(VP表示病毒多 肽 ，数 据 为 分 子 量 ，单 位 为 kd，即 130kd，下 同)、VPI15、VP100、VP90、VP80、VP73、VP67、 VP50、VP43VP36和 VP27 其 中 VP130 VPI15、VP67、VP36、VP27为 主要 成 分 ，这 与 国 外报道 的鱼类 水生 呼肠孤病 毒 的多肽 组成基本 相同 (Winton etat,1987)。进 一步的研究 维普资讯 http://www.cqvip.com

期 李牢等:草鱼出血病病毒的研究进展 44 表1GCHV和4种水生动物呼肠孤病赛分子最大小的比较 Tab. I Comparison of the mole\ ular weight of GChv and four other aquareovruses 基因组片段(kb 总分子量 病毒株 M S3 CHD22.482472261.521401351301060.910890.60t5.52 武汉南湖株”2752472.261.521401.381060910.890.000.5 570.551546 RCHv-86112852.702.6513015120 0.750.7016.28 GCH-8542452282.241.50142 1000800550.540.3}14.06 302301901.701 CS240-402301.801701.50080.K50604b31522 Gv2502402201,601501400400U660.400.3514.71 GRv242,402.301.001.501300.900880.610.410401470 文献来源:1)陈燕新等(99∵,2王炜等(99,3柯丽华等(9)4)李军等(199k)、5曾令兵等1991).表 中后4株均引自 Winton等(1978 表明,内层核衣壳由VP30,VP1l5、VP100、VP90,VP80和VP36等6种多肽组成,可见余 下的ⅴP73,ⅴP67,VP50、VP43和 结构多眩 VP27为外层衣壳所特有。通过对 RNA片段 编码多肽 VPL vP130 GCHV873毒株基因组及其所编码 VEIlS 的多肽链的研究表明:基因组片段 YPI00 LL:L3M1M和S分别编码病 毒核心衣壳的6种多肽,即VP130 VP15、VP100、P90、VP80和 VPSO VP36,片段M和S分别编码病毒 二A VP3 外层衣壳的结构多肽VP3和 VP67。片段S、S,分别编码分子量 VP67 为52kd和4lkd的多肽链;片段S Sy 编码分子量分别为29kd和195kd 的两种多肽链,说明S可能有两个 yP27 VP29 翻译起始位点(王炜等,1994),见 vP195 图1.GCHV873基因组共编码12 条多肽链.其中除片段SS,和S。图GCHV873基因组片段及其所编码的多肽和病毒结构多肽 编码的多肽链与病毒衣壳中的结Fg1 The RNA fragments and their encoded peptdes,mnd 丑、新帐T套 构多肽链在分子量上有所差异外 其它多肽链大小都是一致的。推测片段S,S和S,编码的这些多肽链可能为结构多肽的 非成熟中间产物.需要在宿主细胞内通过后加工造成分子量的增大或减小,抑或为非结构 陈燕新.991.草鱼出血病病毒RNA基因组的分析,鱼类病害研究,13(11.-5

4期 李 军等 ：草 鱼 出血病 病毒 的研 究进 展 447 文献来 源： 』)陈燕薪 等 (1991) 2J工炜等 (I99O)j)柯 丽华等 (1990)，41李 军等 (1998)，5J曾令兵 等 (I991】。表 中后4株均引 白Wlmon-~ (1978)。 表 明 ，内层 核 衣 壳 由 VP]30 VPI15 下 的 VP73、VP67 VP50、VP43和 VP27为 外 层 衣 壳 所 特 有 。 通 过 对 GCHv873毒 株 基 因组 及 其 所 编 码 的 多 肽 链 的 研 究 表 明 ：基 因 组 片 段 L，、L、．L 、M 、M 和 S．分 别 编 码 病 毒 核 心 衣 壳 的 6种多 肽 ，即 VPI30． VPI15、 VP100、 VP90、 VPS0和 VP36；片 段 M ，和 S．分 别 编 码 病 毒 外 层 衣 壳 的 结 构 多 肽 VP73和 VP67。 片 段 S．S分 别 编 码 分 子 量 为 52kd和 41kd的多 肽链 ；片 段 S 编 码 分 子 量 分 别 为 29kd和 19．5kd 的 两 种 多 肽 链 ，说 明 S 可能 有 两 个 翻 译 起 始 位 点 (王 炜 等 ，l994)，见 图 l。GCHv873基 因 组 共 编 码 12 条 多 肽 链 ，其 中除 片 段 S 、S 和 S 编 码 的 多 肽 链 与 病 毒 衣 壳 中 的 结 构 多 肽 链 在 分 子 量 上 有 所 差 异 外 ， VP100、vPg0、VPS0和 VP36等 6种 多 肽 组 成 ，可 见 余 结 掏 多肽 VPl30 ·--一 VPlI5 一 VP【00 一 VPg0 ·-一 VP80 一 VP73 一 VP67 VP50 v1'43 VP36 RNA片段 编码多肽 —一 vP】30 —一 VPll5 一 V P_00 M ～ VPg0 M ，—-一 ·—一 VPSO M j。。。—— ·--一 VP73 S 。。—— 。’一 VP67 S2 — — 。 一 VP52 S， — — --一 VP4】 s| — — 一 VP36 Sj ．．一 ．．一 VP29 V P19 5 图 l GCHV873基 因组片段 及其 所编码 的多 肽和病 毒结 构多肚 ． 】 The RNA fragm ents and their encoded peptides，and structuralpep desin GCHV873 其它 多肽链大小都 是一致的。推测 片段 S、S和 S 编码 的这些多肽链可 能为结构多肽的 非成 熟 中 间产 物 ，需 要 在 宿 主 细 胞 内通 过 后 加 工 造 成 分 子 量 的增 大 或 减 小 ，抑 或 为 非 结 构 陈燕新 一1991 草鱼 出血病 病毒 RNA基 因组 的分 析 ．鱼类病 害研究 ，13(I1：l一5 维普资讯 http://www.cqvip.com

洋与湖沼 3卷 多肽,有待于进一步深入研究 另外关于GHⅴ的基因克隆与序列分析方面的研究工作才刚刚起步,wang等 (1994)在国内率先克隆了BCHV基因组的M和S,片断,并对已克隆的病毒基因组片段进 行了序列分析,进一步的工作正在进行中 5草鱼出血病病毒基因组的转录和翻译 关于GHⅤ在宿主细胞内的复制过程,特别是基因组的转录和翻译还知之甚少。近 年来的研究表明:GCHV核心内含有RNA转录酶,可催化dRNA中的一条链转录合成 mRNA,该酶在28℃时的反应活性最高且能保持较长的时间(柯丽华等.1992黄倢等 1992)。在体外转录条件下,RNA转录酶需要低离子浓度活化其机制可能是低离子浓 度溶液处理,使病毒粒子外层衣壳子粒松散脱落,暴露出核心上的RNA转录酶活性基 因,更利于催化 dsrna转录合成mRNA,GCIV转录酶的上述特征、有别于呼肠孤病毒 科的其它成员,这是由于它们各自所适应不同的宿主的结构(黄倢等,192:张保焰等 1993) 张保焰等(1993)研究还发现,GCHV基因组的体内转录分为早晚两期,早期转录是在病毒 感染细胞后4h开始的,8h后开始晚期转录。转录产物mRNA的大小和数目大体上与病毒基因 组的一致。早期转录是RNA转录酶以初始感染的病毒 dsRNA为模板进行的转录,晚期转录则 是以子代病毒基因组为模板进行的转录、二者没有本质上的差别,只是转录模板的来源不同。 GCHV基因组的转录和翻译过程都是在宿主细胞质中完成的,病毒核酸可穿过核心上的中空 钉状物释放到宿主细胞的细胞质中,通过对人工释放病毒基因组的电子显微镜观察,往往可 以看到三种情形,RNA双链一端与核心衣壳相连,构战类似反应核心的形态;有些RNA双链 似乎与核心上的钉状物相连接;还有的在细胞质中游离存在。这可能是释放中的病毒基因组 所处的阶段不同所致 目前、尚未见到关于GCHV体内翻译的报道。但是对GCHv873毒株体外翻译的研究果 表明(柯丽华等,1992):草鱼出血病病毒 dsrNA的一条链具有mRNA的性质.可在体外进行 翻译其翻译产物为条多肽链,与病毒的结构多肽是一致的,只是片段S2S3和S编码的 多肽与病毒衣壳中的结构多肽在分子量上有所差异。推测这些体外翻译产物可能为结构多 肽的非成熟中间产物,在宿主细胞内装配过程中还需要进一步的修饰加工,这有待于进一 研究 草鱼出血病病毒的繁殖动态及细胞培养特性 GHV在鱼类细胞中的增殖过程,目前尚无详细报道,初步研究结果表明,GCHV可 能通过细胞吞噬作用进人宿主细胞,在细胞质中完成RNA的复制然后,随着RNA及其 蛋白质的合成,集中到细胞核附近的被称为毒浆结构的区域病毒在此结构中装配并发育 成熟随宿主细胞的迸裂而释放出来,重新感染其它正常细胞(毛树坚等,1989a)。GCHV 能感染培养细胞并增殖和传代,产生合胞体状细胞病变效应( cytopathic effect, CPE)(陈 燕新等,1986;方勤等,1989)。GCHV在体外培养细胞中的最适增殖温度为28℃,一般感 染12h后即开始增殖.24-72h大量增殖,培养细胞出现典型的CPE,5d左右达到最大增 1)陈燕新,李正秋,1986.草魚呼肠孤病毒的高体培养及超微病变,鱼病简讯.2

海 洋 与 湖 沼 多 肽 ，有 待 于进 一 步 深 入 研 究 。 另 外 ，关 于 GCHV 的 基 因 克 隆 与 序 列 分 析 方 面 的 研 究 工 作 才 刚 刚 起 步 ，W ang等 (1994)在 国 内率 先 克 隆 了 BCHV 基 因组 的 M 和 s 片 断 ，并 对 已克 隆 的病 毒 基 因 组 片 段 进 行 了序 列 分 析 ，进 一 步 的 工作 正 在 进 行 中 。 5 草 鱼 出血 病病 毒 基 因组 的转 录和 翻 译 关 于 GCHV 在 宿 主细 胞 内 的 复 制 过 程 ，特 别 是 基 因 组 的 转 录 和 翻 译 还 知 之 甚 少 近 年 来 的 研 究 表 明 ：GCHV 核 心 内 含 有 RNA 转 录 酶 ，可 催 化 dsRNA 中 的 一 条 链 转 录 合 成 mRNA，该 酶在 28℃时 的反 应活性 最高且 能保 持 较 长的 时间 (柯 丽华等 ，l992；黄健 等 ． 1992)。 在 体 外 转 录 条 件 下 ，RNA 转 录 酶 需 要 低 离 子 浓 度 活 化 ，其 机 制 可 能 是 低 离 子 浓 度 溶 液 处 理 ，使 病 毒 粒 子 外 层 衣 壳 子 粒 松 散 脱 落 ，暴 露 出 核 心 上 的 RNA 转 录 酶 活性 基 因 ，更 利 于催 化 dsRNA 转 录 合 成 n3RNA CK2HV 转 录 酶 的 上 述 特 征 ，有 别 于 呼肠 孤 病 毒 科 的 其它 成员 ，这是 由于 它们 各 自所 适 应 不 同的 宿 主的 结 构 (黄健 等 ，1992：张保焰等， 1993)。 张保 焰等 (1993)研究 还 发现 ，GCHV基 因组 的体 内转 录分 为早 晚 两期 ，早期 转 录是在 病毒 感 染 细胞 后 4h开始 的 ，8h后 开始 晚期 转 录。转 录产物 mRNA的大 小 和数 目大体 上 与病 毒基 因 组 的一致 早期 转 录是 RNA转 录酶 以初 始感 染 的病 毒 dsRNA为模 板进 行的 转录 ；晚 期转 录则 是 以子代 病 毒 基 因组 为模 板 进 行 的转 录 ，二者 投 有本 质 上 的差 别 ，只是 转 录模 板 的来 源 不 同 GCHV 基 因组 的转 录 和 翻译 过 程都是 在宿 主细 胞 质 中完 成 的 ，病 毒 核 酸 可穿过 桉 li,上的 中空 钉 状 物释 放 到 宿主 细 胞 的细 胞 质 中 通 过 对人 _[释 放病 毒基 因组 的 电子显 微镜 观 察 ，往往 可 以 看 到三种 情形 ，：lhNA 双链 一端 与核心 衣壳相 连 ，构 成类 似反 应桉 心 的形态 有 些 RNA 双链 似 乎 与核 心上 的钉状 物相 连 接 ；还 有 的在 细 胞 质 中游 离存 在 。这 可 能是 释 放 中的病 毒 基 因组 所处 的 阶段不 同所 盈 目前 ，尚未见 到 关 于 GCHV体 内翻译 的 报道 。但是 对 GCHV873毒 株 体外 翻 译 的 研究 果 表 明 (柯 丽 华 等 ，1992)：草鱼 出血 病病 毒 dsRNA 的 一条 链 具 有 mRNA 的性 质 ，可 在体 外 进 行 翻译 ，其 翻 译 产 物 为 ll条 多 肽 链 ，与病 毒 的结 构 多肽 是 一 致 的 ，只是 片段 s s，和 s编 码 的 多肽 与病 毒衣 壳 中 的结 构 多肽 在 分 子 量 上 有所 差 异 。推 测 这些 体 外 翻 译 产 物可 能 为结 构 多 肽 的 非成 熟 中间 产 物 ，在 宿 主 细胞 内装 配 过 程 中还 需要 进一 步 的 修 饰加 工 ，这有 待 于进 一 步 研 究 。 6 草鱼出血病病毒的繁殖动态及细胞培养特性 GCHV 在 鱼 类 细 胞 中 的增 殖 过 程 ，目前 尚 无 详 细 报 道 ，初 步研 究 结 果 表 明 ，GCHV可 能 通 过 细 胞 吞 噬 作 用 进 八 宿 主 细 胞 ，在 细 胞 质 中 完 成 RNA 的 复 制 ，然 后 ，随 着 RNA 及 其 蛋 白质的合成 ，集 中到细胞核 附近的被称为毒浆结构 的 区域 ，病 毒在 此结构 中装配并发育 成 熟 ，随宿 主 细 胞 的 进 裂 而 释 放 出来 ，重 新 感 染 其 它 正 常细 胞 (毛树 坚 等 ，1989a)。CK2HV 能感 染 培 养 细 胞 并 增 殖 和 传 代 ，产 生 合 胞 体 状 细 胞 病 变 效 应 (cytopathie effect,CPE)(陈 燕 新 等 ，1986”；方 勤 等 ，1989) CK2HV 在 体 外 培 养 细 胞 中的 最 适 增 殖 温 度 为 28℃ ，一 般 感 染 12h后 即 开 始 增 殖 ，24— 72h大 量 增 殖 ，培 养 细 胞 出 现 典 型 的 CPE，5d左 右 达 到 最 大 增 )陈 燕新 李正祉 ．1986．草鱼 呼肟 孤病毒 的 离体 培养皿 超微病 变 鱼 病茼 讯 ．2 】一2 维普资讯 http://www.cqvip.com

李军等:草鱼出血病病毒的研究进展 殖,此时病毒的滴度最高,以后逐渐趋于平缓(曾令兵等、1993 现已建立起多株对GCHⅤ敏感的细胞系/株(表2)。对于野生毒株,一开始对培养 细胞的感染力较弱,往往没有CPE,盲传吒代甚至十几代后,病毒感染力随传代逐渐增 强、才出现明显而稳定的 CPE. GCHⅣⅤ感染细胞,有的毒株可感染单层培养细胞产生 CPE而有的毒株不产生CPE但能在培养细胞中复制(李军等,1998),GCHV感染细胞 的能力与其感染鱼体的毒力并不都是一致的:其一,有的毒株(如GCHV873)对培养细胞 的感染力较强,但是对鱼体的毒力却较弱;有的毒株恰恰相反(如GCHv861)(李军等 对草鱼出血病病毒敏感的细胞系 Tah. 2 Sensitve cell hnes to Grass Carp of Haemorrhage Virus zC-79 草鱼呦端组织张念慈等(19861 CF-84 草鱼鳍条组织王迎喜等(198611 草鱼肾脏组织左文功等(1984) 草鱼囊胚组织Wang等(1993) CCK-8 草鱼肾脏组织邓初夏等(1985) 稀有鯽囊胚组织王铁辉u1995) GCCF-2 草鱼尾鳍组织魏彦章等(1987) GAB-80 鲫鱼胚胎组织陈敏容等(1985) GCG 草鱼卵巢组织陈蕪新等(y86)2 BCC 团头鲂尾蜱组织邓初夏等(985 1)王迎喜、1%86.草鱼呼肠孤病毒( Reovirus)感染鳍条细胞株、鱼病简讯,4:2-5 )阵燕新,李正秋,198,草鱼呼畅孤病毒的离体培养及超微病变,鱼病简讯2:1-2 1998)其二,GCHV对培养细胞的特异性往住较对鱼体的特异性差,例如,GCHV不能感 染团头鲂但能感染其组织细胞系BCC(邓初夏等.1985) 7草鱼出血病病毒的致病机理及宿主范围 围草鱼鱼种感染GCHV后,在潜伏期和发展期,鱼体红血球、血浆总蛋白、血和尿素 氮明显减少,病鱼乳酸脱氢酶(SLDH)同功酶紊乱。在某些感染鱼中,SLDH明显多出 条区带(朱心玲等,1987)。在出血病流行期间,其它血液学指标也有相似的变化,如:血 清钾含量增加,钙含量减少;病鱼白细胞和淋巴细胞百分率降低,单核细胞和中性粒细胞 百分率增高,各脏器小血管内皮广泛受损,引起弥散性血管内凝血并形成微血栓,耗去 大量凝血因子,引起出血,使循环血量大为减少,由于微血栓形成和血液淤带,阻闭了局 部的微循环,使正常代谢发生障碍.导致脏器组织病变(郑崇德等,1986 组织病理学研究结果表明,病毒能在草鱼血管及微血管内皮细胞、脾网状细胞、肾、 肠道等组织中复制.而在肝脏、肌肉和鳃未发现病毒颗粒(中国科学院水生生物研究所三 室病毒组.1980;丁清泉等、1990)。但是王铁辉等(1993)在研究感染出血病的稀有餉鲫 的细胞病理中发现,鳃是GCV侵袭的主要组织,并认为也可能是GCHV感染草鱼及其 它鱼类的主要人侵途径。另外,毛树坚等(1988)通过电镜也有关于在病鱼的肌内等组织 中观察到GCH颗粒的报道,李军等(1997应用 RT-PCR技术对人工感染的草鱼出血 病病鱼的不同组织进行了检测,结果显示,肝脏、肾脏和肠道的扩增条带较亮,肌肉和鳃 次之,睥脏最弱。说明前几种组织中GCHⅣV含量较高。邰鄙健忠等(1996)应用 Dof--ELISA 技术对患出血病草鱼的不同组织进行检测.也得到类似的结果,都说明肝脏中含有较多 的病毒颗粒,证实肝脏也是GCHV侵染的主要器官.这同以往电镜观察结果不一致,其 原因可能是其它组织中的病毒颗粒释放到血液中,随血液循环抵达这些器官并在这些组

4 期 李 军 等 ：草鱼 出血 病病 毒 的研 究 进展 殖 ，此 时病 毒的滴 度最高 ，以后逐渐 趋于 平缓 (曾令兵等 ，1993)。 现 已建 立起 多 株 对 GCHV 敏 感 的 细 胞 系 ／株 (表 2)。 对 于 野 生 毒 株 ，一 开 始 对 培 养 细 胞 的 感 染 力 较 弱 ，往 往 没 有 CPE，盲传 几 代 甚 至 十 几 代 后 ，病 毒 感 染 力 随 传 代 逐 渐 增 强 ，才 出 现 明 显 而 稳 定 的 CPE。 GCHv感 染 细 胞 ，有 的 毒 株 可 感 染 单 层 培 养 细 胞 产 生 CPE，而有 的毒株 不产 生 CPE但能 在培养 细胞 中复 制 (李军 等，l998) GCHV 感染 细胞 的 能 力 与其 感 染 鱼 体 的 毒 力 并 不 都 是 一 致 的 ：其 一 ，有 的毒 株 (如 GCHV873)对 培 养 细 胞 的感 染 力 较强 ，但是 对鱼 体 的 毒力 却较 弱 ；有 的 毒株恰 恰 相 反 (如 GCHV861)(李 军等 ， 表2 对草 鱼出血 病病 毒敏 赔的 细胞 系 Tab2 Settsitive celllines to Grass Carp of Haem orrhagic v irus 细胞 系 组 织 来源 文 献 细胞 系 组织 来源 文 寿} zC_19O】 草鱼 吻端组 织 张念 慈等 (】986) CF-84 草鱼鳍 条组织 壬迎 喜 等 (1986)” CIK 草鱼 肾脏 组织 左支 功等 (1984】 GCB 草鱼 囊胚组 织 Wang~ (】993) CCK-84 草鱼 肾脏 组织 邓初 夏等 (1985) GRE 稀有鲫 囊胚组 织 王铁 辉 【1995) GCCY~2 草鱼尾 晴组 织 魏 彦 章等 【I987j GAB 8O 鲫 鱼胚胎 组织 陈敏奢等 (1985】 GCO 草 鱼卵 巢组 织 陈燕 新等 (1986) BCC 团头鲔 尾鳍组 织 邓 韧夏等 【I985) 1) 王 迎 喜 ，】986．草 鱼 呼 肠 孤 病 毒 (Reovirus)感 染 鳍 条 蛔 胞 株 ，量 腑 伺 讯 ，4：2- 5 2)陈燕新 ，李 正秋 ．1986 草鱼 呼肠 孤病 毒的 离体培养 厦超诱 病变 鱼病 简讯 ，2 I- 2 1998)；其 二 ，GCHV 对 培 养 细 胞 的 特 异 性 往 往 较 对 鱼 体 的 特 异 性 差 ，例 如 ，GCHV 不 能 感 染 团 头 鲂 但 能感 染 其 组 织 细 胞 系 BCC(邓 初 夏 等 ，1985)。 7 草 鱼出血病 病毒的致病机理及宿主范围 围草鱼 鱼种感 染 GCHV后 ，在 潜伏期和 发展期 ，鱼 体红血球 、血浆 总蛋 白、血 和尿素 氮 明显减 少 ，病 鱼乳 酸脱氢 酶 (sLDH)同功酶紊 乱。在某 些感 染鱼 中，SLDH明显多 出一 条 区带 (朱心 玲等 ，1987)。 在 出血 病流 行期 间 ，其它血 液 学指标 也有相 似 的变化 ，如 ：血 清钾含 量增加 ，钙含量 减少 ；病鱼 白细 胞和淋 巴细胞 百分 率降低 ，单核 细胞和 中性粒 细胞 百 分 率 增 高 各 脏 器 小 血 管 内 皮 广 泛 受 损 ，引 起 弥 散 性 血 管 内 凝 血 并 形 成 微 血 栓 ，耗 去 大 量 凝 血 因 子 ，引 起 出 血 ，使 循 环 血 量 大 为 减 少 ，由 于 微 血 栓 形 成 和 血 液 淤 带 ，阻 闭 了 局 部的微循 环，使 正常代谢 发生 障碍，导致脏 器组 织病变 (郑崇德等 ，1986)。 组 织 病 理 学 研 究 结 果 表 明 ，病 毒 能 在 草 鱼 血 管 及 微 血 管 内 皮 细 胞 、脾 网状 细 胞 、肾 、 肠 道等组织 中复制 ，而在肝 脏、肌 肉和鳃未 发现病 毒颗粒 (中 国科学 院水生 生物 研究所 三 室病毒 组，l980；丁清泉 等 ，1990)。但是 王铁辉 等 (1993)在 研究 感染 出血 病的稀有 壹句鲫 的细胞病理 中发现 ，鳃是 GCHV侵袭 的主要 组织 ，并认 为也可 能是 GCHV感染 草鱼及其 它鱼 类的主要人 侵途径 。另外 ，毛树坚 等 (1988)通 过 电镜也 有关于在病鱼 的肌 内等组织 中观 察 到 GCH~ 颗 粒 的 报 道 李 军 等 (1997)应 用 RT—PCR技 术 对 人 工 感 染 的 草 鱼 出血 病 病 鱼 的 不 同 组 织 进 行 了 检 测 结 果 显 示 ，肝 脏 、肾 脏 和 肠 道 的 扩增 条 带 较 亮 ，肌 肉和 鳃 次 之 ，脾 脏 最 弱 。说 明 前 几 种 组 织 中 GCHV 含 量 较 高 。邵 健 忠 等 (1996)应 用 Dot-ELISA 技 术 对 患 出 血 病 草 鱼 的 不 同 组 织 进 行 检 测 ，也 得 到 类 似 的 结 果 ，都 说 明肝 脏 中 含 有 较 多 的病 毒颗 粒 证 实肝脏也是 GCHV侵染 的主要器官 。这 同以往 电镜观察结 果不一致 ，其 原 因 可 能 是 其 它 组织 中 的病 毒 颗 粒 释 放 到 血 液 中 ，随血 液 循 环抵 达 这 些 器 官 并 在 这 些 组 维普资讯 http://www.cqvip.com