Chapter7 Protein的分离、纯化和表征 、 Protein的酸碱性质 ) Protein的两性解离大 1、主链上两个末端aNH2和 a - CooH的解离 2、侧链上基团的解离 (二) Protein的等电点(PI)电 l、定义:使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等,即净电 荷为零时的溶液的pH值称为PI( isoelectric point) 电泳分离 2、当pH值>PI时,蛋白质带负电荷 正极移动 当pH值<PI时,蛋白质带正电荷 负极移动 当pH值=PI时,蛋白质带净电荷为零 不移动 3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质
Chapter7 Protein的分离、纯化和表征 一、Protein的酸碱性质 （一）Protein的两性解离★ 1、主链上两个末端α—NH2和α—COOH的解离 2、侧链上基团的解离 （二）Protein的等电点（PI） 1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电 荷为零时的溶液的pH值称为PI(isoelectric point). 2、当pH值> PI 时，蛋白质带负电荷 当pH值<PI 时，蛋白质带正电荷 当pH值=PI 时，蛋白质带净电荷为零 3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质 电泳分离 正极移动 负极移动 不移动 电泳
二、 Protein的高分子性质 1、稳定性因素(29页):(1)胶体性质(丁达尔现象、布郎运动); (2)形成水化膜;(3)双电离层 2、通透性:不易透过半透膜,可用透析的方法将蛋白质分子与其它 小分子物质分离,纯化蛋白质。 3、沉降系数(S):蛋白质在一定的溶剂中,经超速离心沉降,单 位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数,它表示沉 降分子的大小特性。 、 Protein的变性与复性 1、定义:蛋白质在一定的理化因素的影响下,三维构象破坏,理化 性质发生改变和生物学活性丧失,叫变性作用( denaturation)。其本质是 高级结构破坏、一级结构不变。 蛋白质的复性:消除理化因素的影响,生物活性恢复或部分恢复 加热凝固变性不可逆。 2、意义:生产和保存蛋白制品;消毒;提纯等应用
二、Protein的高分子性质 1、稳定性因素（299页）：（1）胶体性质（丁达尔现象、布郎运动）； （2）形成水化膜；（3）双电离层 2、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它 小分子物质分离，纯化蛋白质。 3、沉降系数（S）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单 位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数，它表示沉 降分子的大小特性。 三、Protein的变性与复性 1、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化 性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（denaturation)。其本质是 高级结构破坏、一级结构不变。 蛋白质的复性：消除理化因素的影响，生物活性恢复或部分恢复。 加热凝固变性不可逆。 2、意义：生产和保存蛋白制品；消毒；提纯等应用
四、 Protein的沉淀( precipitation) 沉淀蛋白质的方法有 (一)盐溶盐析:中式盐,如硫酸铵,(降低蛋白质与水的亲和力); (二)有机溶剂沉淀法:甲醇、乙醇、丙酮等(破坏蛋白质胶粒上的水化层); (三)重金属盐沉淀法:产生重金属蛋白盐沉淀; (四)生物碱试剂和某些酸类沉淀法:鞣酸、苦味酸、硝酸等 (五)加热变性沉淀法 五、 Protein的颜色反应 (一)茚三酮反应:在pH5~7的溶液中,与茚三酮共热可产生蓝紫色物 质,用于蛋白质的定性和定量。 (二)双缩脲反应:与双缩脲试剂(即碱性铜溶液)反应生成紫红色络 合物,只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或 蛋白质水解程度的测定。 (三)酚试剂反应:与酚试剂(磷钼酸磷钨酸化合物)作用生成蓝 色物质,再用比色法定性和定量,其灵敏度比双缩脲反应高100倍
四、Protein的沉淀（precipitation) 沉淀蛋白质的方法有 （一）盐溶盐析：中式盐，如硫酸铵，（降低蛋白质与水的亲和力）； （二）有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（破坏蛋白质胶粒上的水化层 ）； （三）重金属盐沉淀法：产生重金属蛋白盐沉淀； （四）生物碱试剂和某些酸类沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等 （五）加热变性沉淀法 五、Protein的颜色反应 （一）茚三酮反应：在pH5~7的溶液中，与茚三酮共热可产生蓝紫色物 质，用于蛋白质的定性和定量。 （二）双缩脲反应：与双缩脲试剂（即碱性铜溶液）反应生成紫红色络 合物，只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或 蛋白质水解程度的测定。 （三）酚试剂反应：与酚试剂（磷钼酸—磷钨酸化合物）作用生成蓝 色物质，再用比色法定性和定量，其灵敏度比双缩脲反应高100倍
六、 Protein吸收光谱的特点 Phe、Tyr、Trp具有吸收紫外光的能力,最大的吸收峰为280mm处 此外,蛋白质分子中的肽键可引起200~220nm的最大光吸收,可用于蛋 白质的定性和定量。 七、 Protein分子的免疫学特性 免疫球蛋白的结构和功能◆
六、Protein吸收光谱的特点 Phe、Tyr、Trp 具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰为280nm处， 此外，蛋白质分子中的肽键可引起200~220nm的最大光吸收，可用于蛋 白质的定性和定量。 七、Protein分子的免疫学特性 免疫球蛋白的结构和功能◆
八、 Protein的分离纯化及鉴定 (一) Protein的提取(300) 1、选材: 2、破碎:常用的方法有硏磨法、超声波法、冻融法和酶解法等机械破碎法。 3、提取: (二) Protein的分离纯化 1、盐析法:中性盐分级沉淀法,常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由 于所带的电荷和水化程度不同,盐析时所需的盐的浓度也不相同,因而可以 将不同的蛋白质加以分离 2、等电点沉淀法:净电荷为零,分子之间的静电排斥力最小,因而容易聚集 形成沉淀。该法适用于在等电点p稳定的蛋白质。 3、有机溶剂沉淀法:甲醇、乙醇、丙酮等(保持低温),破坏蛋白质 的水化层,使蛋白质的溶解度降低而沉淀
八、 Protein的分离纯化及鉴定 （一）Protein的提取（300页） 1、选材： 2、破碎：常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等机械破碎法。 3、提取： （二）Protein的分离纯化 1、盐析法：中性盐分级沉淀法，常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由 于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以 将不同的蛋白质加以分离。 2、等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集 形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。 3、有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质 的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀