高效液相色谱HPLC培调教程高效液相色谱HPLC培训教程（经典）I.概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相（mobilephase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法（Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法（HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60o年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（HighPressureLiquidChromatography，HPLC）。又因分析速度快而称为高速液相色谱法（HighSpeedLiquid Chromatography，HSLP）。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。高速-流速为0.1~10.0ml/min。高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在1530min，有些样品甚至在5min内即可完成分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法（GC)和液相色谱法（LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法（GSC)和气液色谱法（GLC），其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法（LSC)和液液色谱法（LLC。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法（AC）、分配色谱法（DC）、离子交换色谱法（IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤（GFC）、凝胶渗透色谱法（GPC）和亲和色谱法，此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1.液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附一解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度510μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。2.液液色谱法第1页共18页来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html
高效液相色谱 HPLC 培训教程 第 1 页 共 18 页 来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html 高效液相色谱 HPLC 培训教程（经典） I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与 固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在 1906 年研究用碳酸钙分离植物色 素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层 色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称 为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代 后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而 均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱 法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色 谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC 的特点和优点 HPLC 有以下特点： 高压-压力可达 150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2 以上。 高速-流速为 0.1~10.0 ml/min。 高效-可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100 种。 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快-通常分析一个样品在 15~30 min，有些样品甚至在 5 min 内即可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高-紫外检测器可达 0.01ng，荧光和电化学检测器可达 0.1pg。 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分 离挥发性化合物。GC 根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其 中以 GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC 同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它 以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用 CO2），因其扩散系数 大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法 (EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反 相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不 同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒 度 5~10μm。适用于分离分子量 200~1000 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型 化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2．液液色谱法
高效液相色谱HPLC培调教程使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的情性：流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与睛基键合相）：流动相为相对非极性的蔬水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙睛、异内醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（28），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.510范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低低～中中～高流动相极性组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3.离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4.离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基漠化铵、四丁基铵磷酸盐。第2页共18页来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html
高效液相色谱 HPLC 培训教程 第 2 页 共 18 页 来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离 原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平 衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担 体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存 在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在 已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如 C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法 (RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶 剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组 分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基 酸类等）。 反相色谱法 一般用非极性固定相（如 C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异 丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性 较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的 80% 左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品 或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH 值。 但需要注意的是，C18 和 C8 使用的 pH 值通常为 2.5~7.5（2~8），太高的 pH 值会使硅胶 溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在 pH 1.5~10 范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固 定相）。 3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳 环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分 在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的 离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组 分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的 pH 值和离子强度影响。 pH 值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离 子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子 形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主 要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外 高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐
高效液相色谱HPLC培调教程离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙睛-水，水中加入310mmo1/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。5.排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。II.基本概念和理论一、基本概念和术语1.色谱图和峰参数色谱图（chromatogram）一样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线（elutionprofile)。基线(baseline)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音（noise）--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移（drift）--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。色谱峰（peak）--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰（tailingpeak)。前者少见。拖尾因子（tailingfactor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetryfactor）或不对称因子（asymmetryfactor）。《中国药典》规定T应为0.951.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。峰底-基线上峰的起点至终点的距离。峰高（peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。峰宽（peakwidth，w)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4o半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2=2.355o标准偏差（standarddeviation，o）-正态分布曲线x=土1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。α小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，α大，峰形胖、柱效低。峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。2.定性参数（保留值）死时间（deadtime，to）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积（deadvolume，V）一由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V=F×t。（F为流速）保留时间(retentiontime，t)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积（retentionvolume，V）--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。V=F×ts调整保留时间（adjustedretentiontime，tr)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reducedretentiontime）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t只决定于组分的性质，因此，t（或t）可用于定性。t=t一t。调整保留体积（adjustedretentionvolume，v）--扣除死体积后的保留体积。第3页共18页来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html
高效液相色谱 HPLC 培训教程 第 3 页 共 18 页 来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html 离子对色谱法常用 ODS 柱（即 C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入 3~10 mmol/L 的离子对试剂，在一定的 pH 值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、 浓度、流动相组成及其 pH 值、离子强度有关。 5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合 物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它 利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化 合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 II．基本概念和理论 一、基本概念和术语 1．色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱 流出曲线(elution profile)。 基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出 曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动 相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量 的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 色谱峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。 正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯 Gauss 曲线）。不对称色谱峰有两种：前延 峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定 T 应为 0.95~1.05。T＜0.95 为前延峰，T＞1.05 为拖尾峰。 峰底-基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ 标准偏差（standard deviation，σ)-正态分布曲线 x＝±1 时（拐点）的峰宽之半。正 常峰的拐点在峰高的 0.607 倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程 度。σ 小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ 大，峰形胖、柱效低。 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 2．定性参数（保留值） 死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。 在反相 HPLC 中可用苯磺酸钠来测定死时间。 死体积(dead volume，V0)-由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。 它包括 4 部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、 柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有 Vm 参与色谱平衡过程，其它 3 部分只起 峰扩展作用。为防止峰扩展，这 3 部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F 为流速） 保留时间(retention time，tR)-从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 保留体积(retention volume，VR)-从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶 剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR 调整保留时间(adjusted retention time，t'R)-扣除死时间后的保留时间。也称折合保 留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定 于组分的性质，因此，t'R（或 tR）可用于定性。t'R＝tR－t0 调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)-扣除死体积后的保留体积
高效液相色谱HPLC培调教程3.柱效参数理论塔板数（theoreticalplatenumber，N)--用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用调整保留时间（tR）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）。理论塔板高度（theoreticalplateheight，H)--每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。4.相平衡参数分配系数（distributioncoefficient，K)--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。容量因子（capacityfactor，k）--化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k=0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t=0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tr、t.较Vs、V易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。选择性因子（selectivityfactor，a）--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。a又称为相对保留时间（《美国药典》）。要使两组分得到分离，必须使α丰1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。5.分离参数分离度(resolution，R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R=。当W,=W时，R=。当R=1时，称为4o分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R=1.5时，称为60分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。第4页共18页来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html
高效液相色谱 HPLC 培训教程 第 4 页 共 18 页 来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html 3．柱效参数 理论塔板数(theoretical plate number，N)-用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱 效）。 N 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和 流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗 脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是 对稍有拖尾的峰。 N 与柱长成正比，柱越长，N 越大。用 N 表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱 长为 1 米时的理论塔板数。（一般 HPLC 柱的 N 在 1000 以上。） 若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N 有效或 Neff)。 理论塔板高度(theoretical plate height，H)-每单位柱长的方差。实际应用时往往用 柱长 L 和理论塔板数计算。 4．相平衡参数 分配系数(distribution coefficient，K)-在一定温度下，化合物在两相间达到分配平 衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同 的色谱分离机制中，K 有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性 系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。 在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs、Cm 很小)时，K 只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得 到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K 减小，这时色谱峰为拖尾峰； 而有时随着溶质浓度增大，K 也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样 量，使组分在柱内浓度降低，K 恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中 K 值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K 值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易 分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在 HPLC 中，固定相确定后，K 主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相 的组成配比及 pH 值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。 容量因子(capacity factor，k)-化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中 的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。 容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分保 留时间（t0）的几倍。k＝0 时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0； k 越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。 容量因子与分配系数的不同点是：K 取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而 与体积 Vs、Vm 无关；k 除了与性质及温度有关外，还与 Vs、Vm 有关。由于 t'R、t0较 Vs、 Vm 易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。 选择性因子(selectivity factor，α)-相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α 又 称为相对保留时间（《美国药典》）。 要使两组分得到分离，必须使 α≠1。α 与化合物在固定相和流动相中的分配性质、 柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α 的大小表示两组分在两 相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。 5．分离参数 分离度(resolution，R)-相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表 示相邻两峰的分离程度。R＝。当 W1＝W2时，R＝。当 R＝1 时，称为 4σ 分离，两峰基本 分离，裸露峰面积为 95.4%，内侧峰基重叠约 2%。R＝1.5 时，称为 6σ 分离，裸露峰面 积为 99.7%。R≥1.5 称为完全分离
高效液相色谱HPLC培调教程中国药典规定R应大于1.5。提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α=1时，R一0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些。二、塔板理论1.塔板理论的基本假设塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。2.色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）由色谱流出曲线方程可知：当t=t时，浓度C有极大值。Cmax就是色谱峰的峰高。因此：①当实验条件一定时（即一定），峰高h与组分的量C。（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时，越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。由流出曲线方程对V（O~）求积分，即得出色谱峰面积A。可见A相当于组分进样量Co，因此是常用的定量参数。把Cmax=h和Wh/2=2.355α代入上式，即得A=1.064×Wh/2Xh，此为正常峰的峰面积计算公式。三、速率理论（又称随机模型理论）1.液相色谱速率方程1956年荷兰学者VanDeemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论一一速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。后来Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）：2.影响柱效的因素1）涡流扩散（eddydiffusion）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2入dp，dp为填料直径，入为填充不规则因子，填充越不均匀入越大。HPLC常用填料粒度一般为310μm，最好35μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀（入大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，入越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，A=0。2）分子扩散（moleculardiffusion）。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u2yDm/u。u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-410-5，因第5页共18页来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html
高效液相色谱 HPLC 培训教程 第 5 页 共 18 页 来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html 中国药典规定 R 应大于 1.5。 提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时 间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当 α＝1 时，R ＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改 变流动相的组成及 pH 值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。③改变容量因子。这常常是提 高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于 0 时，R 也趋于 0； k2增大，R 也增大。但 k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离 度和检测灵敏度。一般 k2在 1~10 范围内，最好为 2~5，窄径柱可更小些。 二、塔板理论 1．塔板理论的基本假设 塔板理论是 Martin 和 Synger 首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏 塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分 配平衡过程。塔板理论的基本假设为： 1） 色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很 快达到分配平衡。 2） 样品加在第 0 号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。 3） 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。 4） 在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。 虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡； 组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功 地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。 2．色谱流出曲线方程及定量参数（峰高 h 和峰面积 A） 由色谱流出曲线方程可知：当 t＝tR时，浓度 C 有极大值。Cmax 就是色谱峰的峰高。 因此：①当实验条件一定时（即 σ 一定），峰高 h 与组分的量 C0（进样量）成正比，所 以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时，σ 越小（柱效越高），峰高越高， 因此提高柱效能提高 HPLC 分析的灵敏度。 由流出曲线方程对 V(0~∞)求积分，即得出色谱峰面积 A。可见 A 相当于组分进样量 C0，因此是常用的定量参数。把 Cmax＝h 和 Wh/2＝2.355σ 代入上式，即得 A＝ 1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。 三、速率理论（又称随机模型理论） 1．液相色谱速率方程 1956 年荷兰学者 Van Deemter 等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动 力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。它把色谱过程看作一个动 态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。 后来 Giddings 和 Snyder 等人在 Van Deemter 方程（后称气相色谱速率方程）的基础 上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即 Giddings 方程）. 2．影响柱效的因素 1）涡流扩散（eddy diffusion）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱 中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项 A＝2λdp，dp 为填料直径，λ 为填充不规则 因子，填充越不均匀 λ 越大。HPLC 常用填料粒度一般为 3~10μm，最好 3~5μm，粒度分 布 RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀（λ 大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近 球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ 越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有 助于提高柱效。毛细管无填料，A＝0。 2）分子扩散（molecular diffusion）。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在 浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项 B/u＝2γDm/u。u 为流动相线速度， 分子在柱内的滞留时间越长（u 小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。 Dm 为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的 Dm 很小，通常仅为气相的 10-4~10-5，因