高效液相色谱HPLC培调教程此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。Y是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。Y一般在0.6~0.7左右，毛细管柱的Y=1。3）传质阻抗（masstransferresistance）。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。①流动相传质阻抗Hm=Cmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。②静态流动相传质阻抗Hsm=Csmd2pu/Dm，Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比。因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。③固定相传质阻抗Hs=Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。③较小的检测器死体积。3.柱外效应速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即：02=02柱内十02柱外+02其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用”零死体积接头”连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应<VR/。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积≤VR/2。柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k<2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小。III.HPLC系统HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极第6页共18页来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html
高效液相色谱 HPLC 培训教程 第 6 页 共 18 页 来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html 此在 HPLC 中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。γ 是考虑到填料的存在使溶 质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对 Dm 进行校正。γ 一般在 0.6~0.7 左右，毛细管柱的 γ＝1。 3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固 定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的 过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非 平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项 Cu 又分为三项。 ①流动相传质阻抗 Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm 为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边 缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未 来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。 ②静态流动相传质阻抗 Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm 为常数。这是由于溶质分子进入处于 固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm 对峰展宽的影响在整个 传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速 率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。 Hm 和 Hsm 都与固定相的粒径平方 d2p 成正比，与扩散系数 Dm 成反比。因此应采用低 粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大 Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气 泡，因此一般采用室温。 ③固定相传质阻抗 Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs 为常数，df 为固定液的液 膜厚度，Ds 为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中 Hs 与 df 的平方成正比，在吸 附色谱中 Hs 与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或 解吸速度慢的吸附色谱中，Hs 才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时 Hs 可以 忽略。 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时 间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖 尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u 作图，则有一最佳线速度 uopt，在此线 速度时，H 最小。一般在液相色谱中，uopt 很小（大约 0.03~0.1mm/s），在这样的线速 度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在 1mm/s 的条件下操作。⑤较小的检测器死体 积。 3．柱外效应 速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效 应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即： σ2＝σ2柱内＋σ2柱外＋σ2其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测 池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外 死体积，如使用"零死体积接头"连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应 尽可能小。研究表明柱外死体积之和应＜VR/。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部 位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积≤VR/2。 柱外效应的直观标志是容量因子 k 小的组分（如 k＜2）峰形拖尾和峰宽增加得更为 明显；k 大的组分影响不显著。由于 HPLC 的特殊条件，当柱子本身效率越高（N 越大）， 柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典 LC 中则影响相对较小。 III．HPLC 系统 HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。 其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自 动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化 仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。 最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的 峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从 单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极
高效液相色谱HPLC培调教程管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。一、输液泵1.泵的构造和性能输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应<0.5%，这对定性定量的准确性至关重要：②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min；③输出压力高，一般应能达到150300kg/cm；④液缸容积小；③密封性能好，耐腐蚀。泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1m1，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱：改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响：泵压可达400kg/cm。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1%左右，串联泵为0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。2.泵的使用和维护注意事项为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Mi11ipore滤膜（0.2µ；m或0.45µ；m）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。③流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡泵就无法正常工作。如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障：①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。②压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mo1/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。3.梯度洗脱第7页共18页来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html
高效液相色谱 HPLC 培训教程 第 7 页 共 18 页 来源：http://blog.nnsky.com/blog_view_200090.html 管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代之的 是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。 目前常见的 HPLC 仪生产厂家国外有 Waters 公司、Agilent 公司（原 HP 公司）、岛 津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。 一、输液泵 1．泵的构造和性能 输液泵是 HPLC 系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量 和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其 RSD 应＜0.5%，这对定性 定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在 0.1~10 ml/min 范围内连续可调，制 备型应能达到 100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到 150~300kg/cm2 ；④液缸容积小； ⑤密封性能好，耐腐蚀。 泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射 泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两 种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。 柱塞往复泵的液缸容积小，可至 0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再 循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达 400kg/cm2 。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方 式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD 为 0.1%左右，串联泵 为 0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。 2．泵的使用和维护注意事项 为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、 缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏， 而常用的方法是滤过，可采用 Millipore 滤膜（0.2µm 或 0.45µm）等滤器。 泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在 停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚 至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏 密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利 于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。 ③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体 或密封环，最终产生漏液。 ④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏 液。 ⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡， 泵就无法正常工作。 如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障： ①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀， 使泵在较大流量（如 5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个 50ml 针筒在泵出口处 帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。 ②压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单 向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微 生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如 4mol/L 硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。 ③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有 泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。 3．梯度洗脱