食品安全学实验指导 宁 喜 斌 2007 年 4 月 5 ※<前言> 随着生活水平的提高，消费者对食品安全问题越来越重视。社会对食品安全的专 门人才数量和质量都在增加，在此背景下国内许多高校都成立了食品质量与安全 专业。《食品安全学》作为该专业的一们核心课程，不但要求学生掌握坚实的食 品安全理论知识，也要求学生具备扎实的实践技能，因此，我们组织了相关人员 编写这本实验指导，供同学们参考。 本实验指导由宁喜斌，丛健，张慧，窦勇，王璐华完成。 鉴于水平有限，以及时间较紧，书中的错误不可避免，希望使用者能够给予批评 指正，以便我们能够及时进行修正
食品安全学实验指导 宁 喜 斌 2007 年 4 月 5 ※<前言> 随着生活水平的提高，消费者对食品安全问题越来越重视。社会对食品安全的专 门人才数量和质量都在增加，在此背景下国内许多高校都成立了食品质量与安全 专业。《食品安全学》作为该专业的一们核心课程，不但要求学生掌握坚实的食 品安全理论知识，也要求学生具备扎实的实践技能，因此，我们组织了相关人员 编写这本实验指导，供同学们参考。 本实验指导由宁喜斌，丛健，张慧，窦勇，王璐华完成。 鉴于水平有限，以及时间较紧，书中的错误不可避免，希望使用者能够给予批评 指正，以便我们能够及时进行修正
编 者 2007 年 4 月 5 ※<目录> 实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验 实验二 食品中沙门氏菌的检验 实验三 酶联免疫吸附试验（ELISA） 实验四 PCR 技术快速检测副溶血弧菌 实验五 3M 大肠杆菌和大肠菌群快速检验 实验六 对硫磷在苹果中残留的分析方法 实验七 食品中药残的快速检测 5 ※<实验一> 实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验 一、 实验目的 学习食品中金黄色葡萄球菌的基本检验方法。 二、 基本原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、 肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致 病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产 生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品， 就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险， 检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素， 使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性 金黄色葡萄球菌的重要指标。 三、 设备和材料
编 者 2007 年 4 月 5 ※<目录> 实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验 实验二 食品中沙门氏菌的检验 实验三 酶联免疫吸附试验（ELISA） 实验四 PCR 技术快速检测副溶血弧菌 实验五 3M 大肠杆菌和大肠菌群快速检验 实验六 对硫磷在苹果中残留的分析方法 实验七 食品中药残的快速检测 5 ※<实验一> 实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验 一、 实验目的 学习食品中金黄色葡萄球菌的基本检验方法。 二、 基本原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、 肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致 病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产 生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品， 就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险， 检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素， 使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性 金黄色葡萄球菌的重要指标。 三、 设备和材料
实验器材：显微镜、恒温培养箱（37℃）、冰箱、移液管（1mL、5 mL 、10mL）、 试管（15×150mm）、锥形瓶（250mL、100mL）、培养皿、L 型涂布棒、酒精 灯、接种环、试管架、试管篓、灭菌锅、小试管（3×50mm） 实验材料：污染牛奶等。 四、 培养基和试剂 胰酪胨大豆肉汤、血琼脂平板、Baird－Prker 琼脂平板、营养肉汤、0.85％灭菌 生理盐水、兔血浆、革兰氏染色剂 五、 操作步骤 1. 检样处理： 吸取 25mL 液体样品，加入 225mL 灭菌生理盐水，置均质器中制成混悬液。 2. 增菌培养 1) 增菌及分离培养： 吸取 5mL 上述混悬液，接种于胰酪胨大豆肉汤 50mL 培养基内，置 36±1℃温箱 培养 24h，转种血平板和 Baird－Parker 平板，36±1℃培养 24h，挑取金黄色葡萄 球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 2) 形态观察： 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌 体较小，直径约为 0.5～1μm。 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊 生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面 光滑，周围有溶血圈。在 Baird－Parker 平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径 为 2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一 透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似 菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型 菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 3) 血浆凝固酶实验 吸取 1∶4 新鲜兔血浆 0.5mL，放入小试管中，再加入培养 24h 的金黄色葡萄球 菌肉浸液肉汤培养物 0.5mL，振荡摇匀，放 36±1℃温箱内，每半小时观察一次， 观察 6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 3. 直接计数方法 1) 吸取上述 1：10 混悬液，进行 5 倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同 浓度的稀释液 1mL，分别加入三块 Baird－Parker 平板，每个平板接种量分别为 0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌 L 棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将 平板放在 36±1℃温箱 1h，等水分蒸发后反转平皿置 36±1℃温箱培养。 2) 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选 1 个菌落，接种血 琼脂平板，36±1℃24h 培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养 法。 3) 菌落计数： 将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除 以 5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数
实验器材：显微镜、恒温培养箱（37℃）、冰箱、移液管（1mL、5 mL 、10mL）、 试管（15×150mm）、锥形瓶（250mL、100mL）、培养皿、L 型涂布棒、酒精 灯、接种环、试管架、试管篓、灭菌锅、小试管（3×50mm） 实验材料：污染牛奶等。 四、 培养基和试剂 胰酪胨大豆肉汤、血琼脂平板、Baird－Prker 琼脂平板、营养肉汤、0.85％灭菌 生理盐水、兔血浆、革兰氏染色剂 五、 操作步骤 1. 检样处理： 吸取 25mL 液体样品，加入 225mL 灭菌生理盐水，置均质器中制成混悬液。 2. 增菌培养 1) 增菌及分离培养： 吸取 5mL 上述混悬液，接种于胰酪胨大豆肉汤 50mL 培养基内，置 36±1℃温箱 培养 24h，转种血平板和 Baird－Parker 平板，36±1℃培养 24h，挑取金黄色葡萄 球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 2) 形态观察： 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌 体较小，直径约为 0.5～1μm。 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊 生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面 光滑，周围有溶血圈。在 Baird－Parker 平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径 为 2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一 透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似 菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型 菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 3) 血浆凝固酶实验 吸取 1∶4 新鲜兔血浆 0.5mL，放入小试管中，再加入培养 24h 的金黄色葡萄球 菌肉浸液肉汤培养物 0.5mL，振荡摇匀，放 36±1℃温箱内，每半小时观察一次， 观察 6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 3. 直接计数方法 1) 吸取上述 1：10 混悬液，进行 5 倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同 浓度的稀释液 1mL，分别加入三块 Baird－Parker 平板，每个平板接种量分别为 0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌 L 棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将 平板放在 36±1℃温箱 1h，等水分蒸发后反转平皿置 36±1℃温箱培养。 2) 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选 1 个菌落，接种血 琼脂平板，36±1℃24h 培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养 法。 3) 菌落计数： 将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除 以 5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数
六、 实验报告 1．鉴别牛奶中是否含有金黄色葡萄球菌。 2．对牛奶中含有的金黄色葡萄球菌进行计数。 5 ※<实验二> 实验二 食品中沙门氏菌的检验 一、 实验目的 学习食品中沙门氏菌的基本检测方法。 二、 基本原理 沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病 原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。沙门氏菌可通过 人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节， 特别是以动物、脏器为原料的食品污染机率较高。受到污染的食品，不仅直接影 响食用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些食品必须检查沙门 氏菌。 食品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时 须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。沙门氏菌在各种 选择性培养基上的菌落形态不同，这可以作为辨别沙门氏菌的一个简单方法，在 实际工作中，我们还要配合生化实验以及血清学实验来作准确的鉴定。 三、 设备和材料 实验器材：恒温培养箱（37℃、42℃）、显微镜、广口瓶（500mL）、移液管（10mL）、 锥形瓶（250mL）、培养皿、酒精灯、试管架、试管篓、灭菌锅 实验材料：污染牛奶等、沙门氏菌株 四、 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铋琼脂、 DHL 琼脂、HE 琼脂、WS 琼脂、SS 琼脂 五、 操作步骤 1. 前增菌和增菌： 吸取检样 25mL，加在装有 225mL 缓冲蛋白胨水的 500mL 广口瓶内，于 37℃培 养 4h，移取 10mL，转种于 100mL 氯化镁孔雀绿增菌液内，于 42℃培养 18～24h。 同时，另取 10mL，转种于 100mL 亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于 37℃培养 18～ 24h。 2. 分离 取增菌液 1 环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个 DHL 琼脂平板、HE 琼 脂平板、WS 和 SS 琼脂平板。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于
六、 实验报告 1．鉴别牛奶中是否含有金黄色葡萄球菌。 2．对牛奶中含有的金黄色葡萄球菌进行计数。 5 ※<实验二> 实验二 食品中沙门氏菌的检验 一、 实验目的 学习食品中沙门氏菌的基本检测方法。 二、 基本原理 沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病 原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。沙门氏菌可通过 人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节， 特别是以动物、脏器为原料的食品污染机率较高。受到污染的食品，不仅直接影 响食用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些食品必须检查沙门 氏菌。 食品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时 须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。沙门氏菌在各种 选择性培养基上的菌落形态不同，这可以作为辨别沙门氏菌的一个简单方法，在 实际工作中，我们还要配合生化实验以及血清学实验来作准确的鉴定。 三、 设备和材料 实验器材：恒温培养箱（37℃、42℃）、显微镜、广口瓶（500mL）、移液管（10mL）、 锥形瓶（250mL）、培养皿、酒精灯、试管架、试管篓、灭菌锅 实验材料：污染牛奶等、沙门氏菌株 四、 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铋琼脂、 DHL 琼脂、HE 琼脂、WS 琼脂、SS 琼脂 五、 操作步骤 1. 前增菌和增菌： 吸取检样 25mL，加在装有 225mL 缓冲蛋白胨水的 500mL 广口瓶内，于 37℃培 养 4h，移取 10mL，转种于 100mL 氯化镁孔雀绿增菌液内，于 42℃培养 18～24h。 同时，另取 10mL，转种于 100mL 亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于 37℃培养 18～ 24h。 2. 分离 取增菌液 1 环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个 DHL 琼脂平板、HE 琼 脂平板、WS 和 SS 琼脂平板。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于
36±1℃分别培养 18～24h(亚硫酸铋琼脂、DHL、HE、WS、SS) 或 40～48h(BS)， 观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个 平板上的菌落特征见表 1。 表 1 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ（即亚利 桑那菌） 亚硫酸铋琼脂 产硫化氢菌落为黑色有金属光 泽、棕褐色或灰色，菌落周围 培养基可呈黑色或棕色；有些 菌株不产生硫化氢，形成灰绿 色的菌落，周围培养基不变 黑色有金属光泽 DHL 琼脂 无色半透明，产硫化氢菌落中 心带黑色或几乎全黑色 乳糖迟缓阳性或阴 性的菌株与沙门氏 菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ相同；乳糖阳性的 菌株为粉红色，中心 带黑色 HE 琼脂 WS 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫 化氢，菌落中心黑色或几乎全 黑色 乳糖阳性的菌株为 黄色，中心黑色或几 乎全黑色；乳糖迟缓 阳性或阴性的菌株 为蓝绿色或蓝色，中 心黑色或几乎全黑 色 SS 琼脂 无色半透明，产硫化氢菌株有 的菌落中心带黑色，但不如以 上培养基明显 乳糖迟缓阳性或阴 性的菌株，与沙门氏 菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ相同；乳糖阳性的 菌株为粉红色，中心 黑色，但中心无黑色 形成时与大肠艾希 氏菌不能区分 六、 实验报告 1. 辨别牛奶污染菌株是否为沙门氏菌株。 2. 辨别污染牛奶的沙门氏菌株的属群。 5 ※<实验三>
36±1℃分别培养 18～24h(亚硫酸铋琼脂、DHL、HE、WS、SS) 或 40～48h(BS)， 观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个 平板上的菌落特征见表 1。 表 1 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ（即亚利 桑那菌） 亚硫酸铋琼脂 产硫化氢菌落为黑色有金属光 泽、棕褐色或灰色，菌落周围 培养基可呈黑色或棕色；有些 菌株不产生硫化氢，形成灰绿 色的菌落，周围培养基不变 黑色有金属光泽 DHL 琼脂 无色半透明，产硫化氢菌落中 心带黑色或几乎全黑色 乳糖迟缓阳性或阴 性的菌株与沙门氏 菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ相同；乳糖阳性的 菌株为粉红色，中心 带黑色 HE 琼脂 WS 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫 化氢，菌落中心黑色或几乎全 黑色 乳糖阳性的菌株为 黄色，中心黑色或几 乎全黑色；乳糖迟缓 阳性或阴性的菌株 为蓝绿色或蓝色，中 心黑色或几乎全黑 色 SS 琼脂 无色半透明，产硫化氢菌株有 的菌落中心带黑色，但不如以 上培养基明显 乳糖迟缓阳性或阴 性的菌株，与沙门氏 菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、 Ⅵ相同；乳糖阳性的 菌株为粉红色，中心 黑色，但中心无黑色 形成时与大肠艾希 氏菌不能区分 六、 实验报告 1. 辨别牛奶污染菌株是否为沙门氏菌株。 2. 辨别污染牛奶的沙门氏菌株的属群。 5 ※<实验三>