代谢工程主要步骤 ·鉴定目标代谢途径涉及的酶（特别是限速酶）： 取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如 定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点 (增强活性或稳定性、解除反馈抑制等)： ◆将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节 元件一起克隆进目标生物； 使调节元件的作用及培育条件最优化
代谢工程主要步骤 鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶); 取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如 定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点 (增强活性或稳定性、解除反馈抑制等)； 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节 元件一起克隆进目标生物； 使调节元件的作用及培育条件最优化
1.5载体-受体系统及克隆表达 的研究 1.5.1受体的获得 ◆ 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌 K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出 的基础产率较高的菌株。 ◆ 大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善， 利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将 蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。 ·棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统 研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得 利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体 菌是尚待解决的问题
1.5 载体-受体系统及克隆表达 的研究 1.5.1 受体的获得 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌 K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出 的基础产率较高的菌株。 大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善， 利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将 蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。 棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统 研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得 利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体 菌是尚待解决的问题
1.5.2 载体的构建 。 有效的载体需要有在受体菌中可启动的复 制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小 质粒中获得； 载体所需的筛选标记及外源基因插入的多 克隆位点，可从常用的克隆载体中获得
1.5.2 载体的构建 有效的载体需要有在受体菌中可启动的复 制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小 质粒中获得； 载体所需的筛选标记及外源基因插入的多 克隆位点，可从常用的克隆载体中获得
1.5.3 基因转移手段 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它 不适用。 ◆ 通常采用的方法有：原生质体转化、转导，电转 化，接合转移。 ◆ 原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受 到原生质体再生条件的局限，效率不高； ◆ 电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它 的转化效率可达到原生质体转化法的100~1000倍。 ◆ 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的 转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于 稳定遗传
1.5.3 基因转移手段 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它 不适用。 通常采用的方法有：原生质体转化、转导，电转 化，接合转移。 原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受 到原生质体再生条件的局限，效率不高； 电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它 的转化效率可达到原生质体转化法的100～1000倍。 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的 转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于 稳定遗传
二、 氨基酸发酵的代谢控制 控制发酵的条件 ·控制细胞渗透性 ◆控制旁路代谢 ◆降低反馈作用物的浓度 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 ◆促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成
二、氨基酸发酵的代谢控制 控制发酵的条件 控制细胞渗透性 控制旁路代谢 降低反馈作用物的浓度 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成