2.涂布平板法(spread plate■ethod). 由于将含菊材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感南的死亡，而且采用稀释倒平板 法也会使一些严格好氧菌因被周定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯 种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝周后，将 一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经 培养后排取单个南落（图-4）。 3.平板划线法(streak plate■ethod) 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的 连续划线（图25），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的 话，微生物能一 一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 4.稀释摇管法(dilution shake culture method) 用固体培养基分离亚格厌氧南有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通 常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。 对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物。纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法讲行，它是稀释倒到平板 法的一种变通形式”。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将 待分离的材料用这些试管讲行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体无 蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间（图2-6）。进行单菌 落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡一石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹 入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。 三、用液体培养基分离纯培养 对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很 好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物 和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。 通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释 的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生 物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到 纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中， 大多数（一般应超过95%）表现为不生长。 四、单细胞（孢子）分离 稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很多微生 物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培 养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较 大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细南则较难。 对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小 微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用品 微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传 动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得 纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释 0
10 2. 涂布平板法（spread plate method） 由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板 法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯 种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将 一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经 培养后挑取单个菌落（图 2-4）。 3. 平板划线法（streak plate method） 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的 连续划线（图 2-5），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的 话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 4. 稀释摇管法（dilution shake culture method） 用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通 常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。 对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板 法的一种变通形式* 。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在 50℃左右，将 待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石 蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间（图 2-6）。进行单菌 落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡-石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹 入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。 三、用液体培养基分离纯培养 对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很 好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物 和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。 通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释 的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生 物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到 纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中， 大多数（一般应超过 95%）表现为不生长。 四、单细胞（孢子）分离 稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很多微生 物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培 养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较 大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。 对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小 微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显 微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传 动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得 纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释
后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法 对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。 五、选释培养分离 没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基 都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其它被抑制。如果某种微生物的 生长需要是己知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的 微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通 过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为洗择培养分离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离 寻找有用的微生物。在自然界中，除了极特殊的情况外，在大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成 的，因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生 物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如，若某处的土壤中 的微生物数量在10时，必须稀释到106才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅 为10，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物 的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或 造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对 它进行纯培养分离。 1.利用选择平板进行直接分离 主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产 生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制各培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪 素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以 减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰：再如，要分离高温菌，可在高温条件进行培养：要分离 某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离：有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在 琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移 动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行， 得到纯培养物 2.富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物 旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物 富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、D 紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。图2-7描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化 合物对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzyl acid)的微生物的实验过程。首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源 的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的士壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透 明的培液会变得浑浊，说明己有大量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该 过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中将大大提高，将培养液涂布于以对羟基 茉甲酸为难一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能隆解对羟甚苯甲酸的微生物。状取 部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯耳 酸的培差基中生长，而在沿有对羟基苯甲酸的培养基中表现为沿有牛长，说明通讨该宫生程序的确得到了 欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过 稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物
11 后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法 对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。 五、选择培养分离 没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基 都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其它被抑制。如果某种微生物的 生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的 微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通 过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离、 寻找有用的微生物。在自然界中，除了极特殊的情况外，在大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成 的，因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生 物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如，若某处的土壤中 的微生物数量在 108 时，必须稀释到 10-6 才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅 为 102~3，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物 的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或 造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对 它进行纯培养分离。 1. 利用选择平板进行直接分离 主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产 生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪 素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以 减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰；再如，要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离 某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在 琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移 动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行， 得到纯培养物。 2. 富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物 旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。 富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、 紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。图 2-7 描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化 合物对羟基苯甲酸（-hydroxybenzyl acid）的微生物的实验过程。首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源 的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透 明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该 过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中将大大提高，将培养液涂布于以对羟基 苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一 部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲 酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长，说明通过该富集程序的确得到了 欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过 稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物
富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于 从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的 有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环 境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。 六、二元培养物 分离的日的通常是要得到纯培养。然而，在有些情识下这是做不到的或是很难作到的。但可用二元培 养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为 混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为 二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有 一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培 养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。 在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物 和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。 这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制各纯培养的培养基很闲难、很费事」 七、微生物的保藏技术 通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其 它微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的 顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重 要意义，许多国家都设有相应的菌种保藏机构，例如，中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM),中国典型 培养物保藏中心(CCIcC),美国典型菌种保藏中心(ATCC),美国的“北部地区研究实验室”(NRRL) 荷兰的霉菌中心保藏所(CBS),英国的国家典型菌种保藏中心(NCTC)以及日本的大阪发酵研究所(IFO) 等。国际微生物学联合会(IAS)还专门设立了世界菌种保藏联合会(WFGC),用计算机储存世界上各保 藏机构提供的菌种数据资料，可以通过国际互联网查询和索取，进行微生物菌种的交流、研究和使用。 生物的生长一般都需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，微生物也不例外。菌种保藏就是根据 菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如利用培养基或宿主 对微生物菌株进行连续移种，或改变其所处的环境条件，例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，令 菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存，有的可 保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。 1.传代培养保藏 传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常用的有琼脂斜面、半固体 琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针对不同的菌种而选择使用适宜的培养基，并在规定 的时间内进行移种，以免由于菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失微生物菌种。在琼脂斜面上保 藏微生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数周。一般来说，通过降低培养 物的代谢或防止培养基干燥，可延长传代保藏的保存时间。例如在茵株生长良好后，改用橡皮塞封口或在 培养基表面覆盖液体石蜡，并放置低温保存：将一些菌的菌苔直接刮入蒸馏水或其它缓冲液后，密封置4℃ 保存，也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效果，这种方法有时也被称为悬液保藏法。 由于南种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株 的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在一般情况下，在实验室里除了采用传代法对常用的 菌种进行保存外，还必须根据条件采用其它方法，特别是对那些需要长期保存的菌种更是如此。 12
12 富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于 从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的 有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环 境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。 六、二元培养物 分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很难作到的。但可用二元培 养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为 混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为 二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有 一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培 养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。 在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物 和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。 这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。 七、微生物的保藏技术 通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其 它微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的 顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重 要意义，许多国家都设有相应的菌种保藏机构，例如，中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），中国典型 培养物保藏中心（CCTCC），美国典型菌种保藏中心（ATCC），美国的“北部地区研究实验室”（NRRL）， 荷兰的霉菌中心保藏所（CBS），英国的国家典型菌种保藏中心（NCTC）以及日本的大阪发酵研究所（IFO） 等。国际微生物学联合会（IAMS）还专门设立了世界菌种保藏联合会（WFGC），用计算机储存世界上各保 藏机构提供的菌种数据资料，可以通过国际互联网查询和索取，进行微生物菌种的交流、研究和使用。 生物的生长一般都需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，微生物也不例外。菌种保藏就是根据 菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如利用培养基或宿主 对微生物菌株进行连续移种，或改变其所处的环境条件，例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，令 菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存，有的可 保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。 1. 传代培养保藏 传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常用的有琼脂斜面、半固体 琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针对不同的菌种而选择使用适宜的培养基，并在规定 的时间内进行移种，以免由于菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失微生物菌种。在琼脂斜面上保 藏微生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数周。一般来说，通过降低培养 物的代谢或防止培养基干燥，可延长传代保藏的保存时间。例如在菌株生长良好后，改用橡皮塞封口或在 培养基表面覆盖液体石蜡，并放置低温保存；将一些菌的菌苔直接刮入蒸馏水或其它缓冲液后，密封置 4℃ 保存，也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效果，这种方法有时也被称为悬液保藏法。 由于菌种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株 的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在一般情况下，在实验室里除了采用传代法对常用的 菌种进行保存外，还必须根据条件采用其它方法，特别是对那些需要长期保存的菌种更是如此
2.冷冻保藏 将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生物都能通过冷冻进行保存， 细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因与低温会使细胞内的水 分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因产生的冰晶 小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的捞 伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5m01/L左右的甘油或二甲亚枫可透入细胞 并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞：大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡略烷酮(PVP) 国不能诱入细胞，但可通讨与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采用冷族法保藏菌种时 一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。 一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氢保藏可达到一196℃。因 此，从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等方面来看，该方法在迄今使用的各种微生物保藏方 法中是较理想的一种。但液氮保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应，冰箱 保藏使用更为普遍。例如在各种基因工程手册中，一般都推荐在一70℃低温冰箱中保存菌株或细胞的某些 特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如经诱导建立了感受态的细胞。在没有低温冰箱的条件下，也可 利用一2030℃的普通冰箱保存菌种。但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内， 常会由于冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结品，而对菌体形成强烈的损伤。因此 采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种。 3。干燥保藏法 水份对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干操，尤其是深度干操是微生物保藏技术中另 项经常采用的手段。 沙土管保存和冷冻直空保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。前者主要适用于产孢子的微生物， 如芽孢杆菌、放线菌等。一般将菌种接种斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬液，加入 无菌的沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便 易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。 冷冻真空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过冰的升华作用除去 水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低 温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细 胞受损伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安瓿管的保存、邮寄、使 用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普崩，也是最重要的微生物保藏方法，大多数专业的荣 种保藏机构均采用此法作为主要的微生物保存手段。 除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微 生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明 对所有的微生物均盾宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现 有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏， 以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失， 第二节显微镜和显微技术 绝大多数微生物的大小都远远低于肉明的观察极限，因此，一般必须借助显微培放大系统的作用才能 看到到它们的个体形态和内部构造。除了放大外，决定显微观察效果的还有二个重要的因素，即分辨率和 反差。分辨率是指能辨别两点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程度，它们与显微镜的 13
13 2. 冷冻保藏 将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生物都能通过冷冻进行保存， 细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因与低温会使细胞内的水 分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因产生的冰晶 小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的损 伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5 mol / L 左右的甘油或二甲亚枫可透入细胞， 并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 虽不能透入细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采用冷冻法保藏菌种时， 一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。 一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氮保藏可达到—196℃。因 此，从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等方面来看，该方法在迄今使用的各种微生物保藏方 法中是较理想的一种。但液氮保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应，冰箱 保藏使用更为普遍。例如在各种基因工程手册中，一般都推荐在—70℃低温冰箱中保存菌株或细胞的某些 特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如经诱导建立了感受态的细胞。在没有低温冰箱的条件下，也可 利用—20~30℃的普通冰箱保存菌种。但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内， 常会由于冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结晶，而对菌体形成强烈的损伤。因此 采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种。 3. 干燥保藏法 水份对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另 一项经常采用的手段。 沙土管保存和冷冻真空保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。前者主要适用于产孢子的微生物， 如芽孢杆菌、放线菌等。一般将菌种接种斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬液，加入 无菌的沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便 易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。 冷冻真空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过冰的升华作用除去 水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低 温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细 胞受损伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安瓿管的保存、邮寄、使 用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，大多数专业的菌 种保藏机构均采用此法作为主要的微生物保存手段。 除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微 生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明 对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现 有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏， 以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 第二节 显微镜和显微技术 绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察极限，因此，一般必须借助显微镜放大系统的作用才能 看到到它们的个体形态和内部构造。除了放大外，决定显微观察效果的还有二个重要的因素，即分辨率和 反差。分辨率是指能辨别两点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程度，它们与显微镜的
自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显 微技术。而现代的显微技术，不仅仅是观察物体的形态、结构，而且发展到对物体的组成成分定性和定量 特别是与计算科学技术的结合出现的图象分析、模拟仿真等技术，为探索微生物的奥秘增添了强大武器 一、显意镜的种类及原理 1.普通光学显微镜 现代普通光学显微镜利用日镜和物镜两组诱镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微倍。它们由机 械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜座、支架、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本 组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统由物镜、 目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。 一般的显微镜都可配置多种可互换的 光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。 对任何显微镜来说，分辨率是决定其观察效果的最重要指标。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率 受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 分辨率（最小可分辨距离）=0.5入 nsin 式中)为所用光源波长：日为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离（图28）：n为玻片 与物镜间介质的折射率，显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质，例如空气(n=1.0)、水(1.33)、 香柏油(n-l.2)等。nsin0也被表示为数值孔径值(Numerical Aperture,NA),它是决定物镜性能的最重 要指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（入=450m)作为光源时在油镜下可以达到其最大分辨率， 0.18m(表21)。由于肉眼的正常分辨能力一般为0.25mm左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍 数只能达到1,000-1,500倍，在此基础上进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。 2.喷视野显微 明视野显微镜的的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的， 不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由 样品反射或折射后再进入物镜（图29），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看 不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可 以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小 于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察生活细菌的 运动性」 3.相差显微健 光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光 学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部 分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随者光程的增加或 减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜 配备有特殊的光学装置一一环状光用和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉 的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反 差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察 到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构，是显微技术 的一大突破，为此，其发明人F,Zernike获得了1953年的诺贝尔奖
14 自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显 微技术。而现代的显微技术，不仅仅是观察物体的形态、结构，而且发展到对物体的组成成分定性和定量， 特别是与计算科学技术的结合出现的图象分析、模拟仿真等技术，为探索微生物的奥秘增添了强大武器。 一、显微镜的种类及原理 1. 普通光学显微镜 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机 械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜座、支架、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的基本 组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统由物镜、 目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都可配置多种可互换的 光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。 对任何显微镜来说，分辨率是决定其观察效果的最重要指标。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率 受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 式中为所用光源波长；为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离（图 2-8）；n 为玻片 与物镜间介质的折射率，显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质，例如空气（n=1.0）、水（n=1.33）、 香柏油（n=1.52）等。n sin也被表示为数值孔径值（Numerical Aperture，NA），它是决定物镜性能的最重 要指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（=450nm）作为光源时在油镜下可以达到其最大分辨率， 0.18 m（表 2-1）。由于肉眼的正常分辨能力一般为 0.25 mm 左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍 数只能达到 1,000~1,500 倍，在此基础上进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。 2. 暗视野显微镜 明视野显微镜的的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的， 不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由 样品反射或折射后再进入物镜（图 2-9），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在白天看 不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可 以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察微粒的尺寸小 于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于观察生活细菌的 运动性。 3. 相差显微镜 光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光 学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部 分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或 减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜 配备有特殊的光学装置——环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉 的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反 差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察 到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构，是显微技术 的一大突破，为此，其发明人 F. Zernike 获得了 1953 年的诺贝尔奖