2,4-D可用少量1 mol NaOH溶解后,再加水定容到一定浓度 将Kt和BA先溶于少量1mol的HCl中再加水定容 将玉米素先溶于少量95%的酒精中,再加热水到一定浓度。 配制好的母液瓶上应分别贴上标签,注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量 、培养基的配制 按表用量筒移取大量元素母液100m,用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液10mi、铁盐母液 l0ml、有机物母液10ml,均置人1000ml定容瓶中,若不加任何激素,则为MSo培养基;若需加激 素按配方移取激素母液即可。 将已装母液的定容瓶用蒸馏水或自来水定容到1000ml,取1/3左右倒人小铝锅中加热。同时,称 好3鸲g蔗糖,称琼脂丝7g(或琼脂粉),也倾人小铝锅中,边加热边搅拌,防止糊底。旺火煮开,再 用文火加热,直至琼脂全部融化即清澈见底为度。(若用琼脂粉,应加入100m左右的液体培养基, 并搅拌均匀)。然后再倾人定容 瓶余下的液体培养基,摇晃均匀即可 培养基配好后,要调整pH值。用0.1M的NaOH或HCI液调成5.8pH值左右。在培养基配方不 大变动的情况下可用经验法。可以将连续三次测定所加入的酸或碱液的平均值作为以后调整的用量 值。调后注意一定要摇动均匀,还要注意酸或碱液不要放置时间太久。 三、培养基的分装与灭菌 培养基合成后要趁热分装,100ml的容器约装入30-40ml培 养基,即1L培养基约装35瓶左右。太多则浪费培养基,太少不易接种和影响生长。但要根据培养 对象来决定。如果培养时间较长时,应适当多装培养基,生根等短期培养时,可适当少加培养基 分装时不要把培养基弄到管壁上,以免日后污染。装后用封口材料包上瓶口,扎口后,写上培养基 种类,准备灭菌。注意不能放置时间过长,以免产生污染。 培养基用高压灭菌。打开锅盖,加水至水位线。把已装好培养基的三角瓶,连同蒸馏水及接种用具 等放人锅筒内,装时不要过分倾斜培养基,以免弄到瓶口上或流出。然后盖上锅盖,对角旋紧螺丝, 接通电源加热,当升至0.05MPa时,打开放气阀放气,回"0,后关闭放气阀。当气压上升到0.10MPa 时,保压灭菌20mn,到时停止加热。当气压回"0"后打开锅盖,取出培养基,放于平台上冷凝。灭 好的培养基不要放置时间太长,最多不能超过1周。 第三节培养基的选择 在建立一个新的实验体系时,为了能研制出一种适合的培养基,最好先由一种已被广泛使用的基本 培养基(如MS培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验,对这种培养基做了某些定性 和定量的小变动之后,即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基,选择最佳培养基。常用试验 方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等
2，4-D 可用少量 1mol NaOH 溶解后，再加水定容到一定浓度。 将 Kt 和 BA 先溶于少量 1mol 的 HCI 中再加水定容。 将玉米素先溶于少量 95％的酒精中，再加热水到一定浓度。 配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配 1L 培养基时应取的量。 二、培养基的配制 按表用量筒移取大量元素母液 100ml，用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液 10mi、铁盐母液 10ml、有机物母液 10ml，均置人 1000ml 定容瓶中，若不加任何激素，则为 MSo 培养基；若需加激 素按配方移取激素母液即可。 将已装母液的定容瓶用蒸馏水或自来水定容到 1000ml，取 1／3 左右倒人小铝锅中加热。同时，称 好 30g 蔗糖，称琼脂丝 7g(或琼脂粉)，也倾人小铝锅中，边加热边搅拌，防止糊底。旺火煮开，再 用文火加热，直至琼脂全部融化即清澈见底为度。(若用琼脂粉，应加入 100ml 左右的液体培养基， 并搅拌均匀)。然后再倾人定容 瓶余下的液体培养基，摇晃均匀即可。 培养基配好后，要调整 pH 值。用 0．1M 的 NaOH 或 HCl 液调成 5．8pH 值左右。在培养基配方不 大变动的情况下可用经验法。可以将连续三次测定所加入的酸或碱液的平均值作为以后调整的用量 值。调后注意一定要摇动均匀，还要注意酸或碱液不要放置时间太久。 三、培养基的分装与灭菌 培养基合成后要趁热分装，100ml 的容器约装入 30-40ml 培 养基，即 1L 培养基约装 35 瓶左右。太多则浪费培养基，太少不易接种和影响生长。但要根据培养 对象来决定。如果培养时间较长时，应适当多装培养基，生根等短期培养时，可适当少加培养基。 分装时不要把培养基弄到管壁上，以免日后污染。装后用封口材料包上瓶口，扎口后，写上培养基 种类，准备灭菌。注意不能放置时间过长，以免产生污染。 培养基用高压灭菌。打开锅盖，加水至水位线。把已装好培养基的三角瓶，连同蒸馏水及接种用具 等放人锅筒内，装时不要过分倾斜培养基，以免弄到瓶口上或流出。然后盖上锅盖，对角旋紧螺丝， 接通电源加热，当升至 0．05MPa 时，打开放气阀放气，回"0'，后关闭放气阀。当气压上升到 0．10MPa 时，保压灭菌 20min，到时停止加热。当气压回"0"后打开锅盖，取出培养基，放于平台上冷凝。灭 好的培养基不要放置时间太长，最多不能超过 1 周。 第三节 培养基的选择 在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本 培养基(如 MS 培养基或 B5 培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基做了某些定性 和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。常用试验 方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等
、单因子试验 在单因子试验中,由于培养基中其他成分都维持在一般水平上,所以只变动一个因子,就可以找出 这宁因子对试验的影响和影响的程度。例如MS基本培养基的其他成分和用量都不变,只变动NAA 用量对某一培养物生根的影响,这种只研究一个因素的试 验就是单因子试验 生物学试验不同于物理学或化学试验,最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组 试验组可以有一组或几组,随试验的复杂性而设置,对照组也可能有一组以上。试验中要求对照组 与试验组中的试验个体,即植物组织块或其他培养物,必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方 面,尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子,而不是由于试验材料的不一致导致的。 试验中各处理一般都要设有一定的重复,以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同,大多每 个项目要有4-10瓶,每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。 多因子试验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验,试验可采用完全试验方案,也可 选用正交设计方案,完全试验方案具有均衡完全的特点,各个因子的每个水平都相互搭配,构成了 所有可能的处理组合,如研究NAA和6-BA的最佳浓度组 合,每个因子各设5个浓度水平(0,0.5,2.5,5,10mg/L,这两种因子各种浓度的所有组合, 就构成了一个具有25项处理的试验见表3-3 表3-32种激素5种浓度的实验组合 6-BA(umol)00.52.5510 NAA Hmol) 012345 0.5678910 2.51112131415 51617181920 102122232425 完全试验方案试验因子越多,处理数越多,试验越复杂,消耗的精力、物力越多。为了减少试验处 理,但又能准确全面地获得试验信息,通常采用正交试验。例如,采用正交设计,在使用此表时就 可以安排4个因子,3种水平的试验,一共做9种不同搭配的试验,其结果相当于做了27次种种搭 配的试验。正交试验虽然是多因素搭配在一起的试验,但是在试验结果的分析中,每一种因素所起 的作用却又能够明白无误地表现出来。因此,一次系统的试验结果,就可以把问题分析得淸清楚楚, 用有限的时间取得成倍的收获。在组织培养研究中,可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用 量,如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量 三、逐步添加和逐步排除的试验方法
一、单因子试验 在单因子试验中，由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出 这宁因子对试验的影响和影响的程度。例如 MS 基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动 NAA 用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试 验就是单因子试验。 生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组， 试验组可以有一组或几组，随试验的复杂性而设置，对照组也可能有一组以上。试验中要求对照组 与试验组中的试验个体，即植物组织块或其他培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方 面，尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。 试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多每 个项目要有 4-10 瓶，每瓶至少 3 块培养物或 3 丛小幼苗。 二、多因子试验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可 选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了 所有可能的处理组合，如研究 NAA 和 6-BA 的最佳浓度组 合，每个因子各设 5 个浓度水平(0，0．5，2．5，5，10mg／L)，这两种因子各种浓度的所有组合， 就构成了一个具有 25 项处理的试验见表 3-3。 表 3-3 2 种激素 5 种浓度的实验组合 6-BA（μmol/l）0 0.5 2.5 5 10 NAA（μmol/l） 0 1 2 3 4 5 0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验处 理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表时就 可以安排 4 个因子，3 种水平的试验，一共做 9 种不同搭配的试验，其结果相当于做了 27 次种种搭 配的试验。正交试验虽然是多因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素所起 的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试验结果，就可以把问题分析得清清楚楚， 用有限的时间取得成倍的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用 量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。 三、逐步添加和逐步排除的试验方法
在植物组织分化与再生的研究中,在没有取得可靠的分化与再生之前,往往添加各种有机营养成分, 而在取得了稳定的再生之后,就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功,在逐步减少 时是缩小范围,以便找到最有影响力的因子,或是为了实用上的需要竭力使培养基简化,以降低成 本和利于推广。在寻求最佳激素配比时,也经常用到这种加加减减的简单方法。 四、广谱实验法 在广谱实验法中,把培养基中所有组分分为4大类:无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等) 生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低①)、中(M)、和高(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的 自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。例 如,一个包含中等浓度无机盐,低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的 处理即可表示为MLMH。达到这个阶段,再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的 最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。 本章小结 (1)常用的培养基有:①MS培养基,其特点是无机盐和离子 ②B5培养基,其特点是含有 较低的铵:③ White培养基,其特点是无机盐低,适于生根:④N6培养基,其特点是KN03和(NH4): SO:含量较高,适于花药培养:⑤KM-8P培养基,其特点是有机成分较多,适于原生质体培养。 (2)水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要成分。 3)配制培养基时,为便于保存,提高效率,通常先配制母液。即先配成大量元素10倍液:微量元素 100倍液:铁盐100倍液;有机物500倍液;激素1mg/l倍液 (4)培养基常分装到160ml的三角瓶,含量一般为每瓶30-40ml;高压灭菌时,压力通常为0.1MPa 以上,持续20min。 (5)筛选合适的培养基一般有四种方法,即单因子试验法、多因子试验法、逐步添加和排除法以及广 谱实验法。其中,第一种方法比较简单,第二种方法比较准确,而后两种方法则比较复杂。 复习思考题 (1)目前,常用的培养基种类有哪些?各有什么特点? (2)培养基包括哪些成分?各有什么作用? (3)简要说明MS培养基的基本组成? (4)配制培养基时,为什么要先配母液?如何配制母液? (5)怎样利用母液配制培养基? (6)培养基内加入活性炭的目的是什么?应注意什么问题? (7)配制培养基时,为什么要加入一定量的植物生长物质? (8)怎样进行培养基的高压湿热灭菌? (9)试比较选择培养基时几种方法的优劣? 第四章操作技术
在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分， 而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少 时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成 本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。 四、广谱实验法 在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为 4 大类：无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、 生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3 个浓度。4 类物质各 3 种浓度的 自由组合即构成了一项包括 81 个处理的实验。在这 81 个处理中最好的一个可用 4 个字母表示。例 如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的 处理即可表示为 MLMH。达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的 最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。 本章小结 (1)常用的培养基有：①MS 培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高；②B5 培养基，其特点是含有 较低的铵；③White 培养基，其特点是无机盐低，适于生根；④N6 培养基，其特点是 KN03 和(NH4)： SO：含量较高，适于花药培养；⑤KM-8P 培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养。 (2)水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要成分。 (3)配制培养基时，为便于保存，提高效率，通常先配制母液。即先配成大量元素 10 倍液；微量元素 100 倍液；铁盐 100 倍液；有机物 500 倍液；激素 1mg／l 倍液。 (4)培养基常分装到 160ml 的三角瓶，含量一般为每瓶 30-40ml；高压灭菌时，压力通常为 0．1MPa 以上，持续 20min。 (5)筛选合适的培养基一般有四种方法，即单因子试验法、多因子试验法、逐步添加和排除法以及广 谱实验法。其中，第一种方法比较简单，第二种方法比较准确，而后两种方法则比较复杂。 复习思考题 (1)目前，常用的培养基种类有哪些?各有什么特点? (2)培养基包括哪些成分?各有什么作用? (3)简要说明 MS 培养基的基本组成? (4)配制培养基时，为什么要先配母液?如何配制母液? (5)怎样利用母液配制培养基? (6)培养基内加入活性炭的目的是什么?应注意什么问题? (7)配制培养基时，为什么要加入一定量的植物生长物质? (8)怎样进行培养基的高压湿热灭菌? (9)试比较选择培养基时几种方法的优劣? 第四章 操作技术
目的要求 (1)一般掌握灭菌和消毒的区别: (2)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程 (3)掌握无菌接种的步骤 (4)掌握外植体的培养方法和步骤; (5)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法 (6)掌握试管苗驯化的基本程序 ⑦)般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算法 有了设计良好的实验室和基本设备以后,应当学习组织培养的操作技术。包括灭菌、接种、培养、 驯化等 第一节灭菌和接种 、灭菌( sterilization) 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是:凡是暴露 在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都是有菌的。依此观点,无菌室等未处理的 地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及 与外界相连的内表,如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都 是有菌的。 这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是:极小,肉眼看不见 无处不在,无时不有,无孔不入。在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单,繁殖力极强,条件 适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是:经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的 物体(当然这些方法必须已经证明是有效的),高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触 的组织内部,强酸强碱,化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出:在地球 表面无菌世界要比有菌世界小得多 灭菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物 质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生 危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环 境里和物品上还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿 以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作,就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的,甚至超过微生物的培养要求,这是因为培养基含有 丰富的营养,稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的,必须根据不同的对象采取不同的 切实有效的方法灭菌,才能保证培养时不受杂菌的影响,使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压
目的要求： (1)一般掌握灭菌和消毒的区别； (2)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程； (3)掌握无菌接种的步骤； (4)掌握外植体的培养方法和步骤； (5)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法； (6)掌握试管苗驯化的基本程序； (7)一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算法。 有了设计良好的实验室和基本设备以后，应当学习组织培养的操作技术。包括灭菌、接种、培养、 驯化等。 第一节 灭菌和接种 一、灭菌(sterilization) 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露 在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的 地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及 与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都 是有菌的。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。 无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件 适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的 物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触 的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地球 表面无菌世界要比有菌世界小得多。 灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物 质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生 危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环 境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿， 以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有 丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的 切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压
蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施:化学方法是使用 升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这 些方法和药剂要根据工作中的不伺材料不同目的适当选用。 1.培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸气不能外 溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下,锅内 温度达121℃。在此蒸气温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢 注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法, 但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通电后,待 压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀 关阀再通电后,压力表上升达到0.MPa时,开始计时,维持压力0,1-0.15MPa,20min 按容器大小不同,保压时间有所不同见表4-1。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字,如果容器体 积较大,但是放置的数量很少,也可以减少时间 容器的体积/mL在121℃灭菌所需最少时间/min 20-501 75-15020 250-50025 100030 表4-1培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间 到达保压时间后,即可切断电源,在压力降到0.5MPa,可缓慢放出蒸气,应注意不要使压力降低 太快,以致引起激烈的减压沸腾,使容器中的液体四溢。当压力降到零后,才能开盖,取出培养基, 摆在平台上,以待冷凝。不可久不放气,引起培养基成分变化,以至培养基无法摆斜面。一旦放置 过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气压入,内外压力平衡,盖子便易 开了。 对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种用具,可以延长灭菌时间或提高压力。而 培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意 延长时间 对于一些布制品,如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭菌 高压灭菌前后的培养基,其pH值下降0.2-0.3单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决 于多种因素。在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含 有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的pH值变化幅度较大,甚至可大于2个pH值单位。环境pH 值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响
蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用 升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这 些方法和药剂要根据工作中的不伺材料不同目的适当选用。 1．培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的 24h 内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外 溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在 0．1MPa 的压力下，锅内 温度达 121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法， 但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待 压力上升到 0．05MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 关阀再通电后，压力表上升达到 0．1MPa 时，开始计时，维持压力 0，1~0．15MPa，20min。 按容器大小不同，保压时间有所不同见表 4-1。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体 积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。 容器的体积／mL 在 121℃灭菌所需最少时间／min 20-50 15 75-150 20 250-500 25 1000 30 表 4-1 培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间 到达保压时间后，即可切断电源，在压力降到 0．5MPa，可缓慢放出蒸气，应注意不要使压力降低 太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基， 摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置 过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易 开了。 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而 培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意 延长时间。 ． 对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌 20-30min。 高压灭菌前后的培养基，其 pH 值下降 0．2-0．3 单位。高压后培养基 pH 值的变化方向和幅度取决 于多种因素。在高压灭菌前用碱调高 pH 值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含 有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的 pH 值变化幅度较大，甚至可大于 2 个 pH 值单位。环境 pH 值的变化大于 0．5 单位就有可能产生明显的生理影响