高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内, 高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解,可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值 小于5.5,其水解量更多,培养基中添加0.1%活性炭时,高压下蔗糖水解大大增强,添加1%活 性炭,蔗糖水解率可达5% 为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法: (1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,以便及时采取有效措施 2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用 甘露醇,以IBA代替IAA,控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成 分的影响等 (3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入 (4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48 而96h后又回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。 2.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭 菌。冷却后,立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶,放人95%的酒精,以便插入工具, 3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到160-180-(2的温度来杀死微生物。由于在干热条件下,细菌的营养细胞 的抗热性大为提高,接近芽孢的抗热水平,通常采用170~C持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要 预先洗浄并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌 时应渐进升温,达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍热对流和 穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源 消耗太大,浪费时 4.不耐热的物质采用过滤灭菌 一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通 常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为0.45um以下,当溶液通过滤膜后,细菌的细胞 和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置:液量小 时,可用注射器。使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过滤的液体装入注射 器,推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无菌溶液。 5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌 (1)紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌,细 菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成死亡。紫外线的波长 为200-300nm,其中以260nm.的杀菌能力最强,但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在 8％-20％蔗糖范围内， 高压灭菌后的培养基约升高 0．43 倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使 15％-25％的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值 小于 5．5，其水解量更多，培养基中添加 0．1％活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加 1％活 性炭，蔗糖水解率可达 5％。 为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法： (1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。 (2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用 甘露醇，以 IBA 代替 IAA，控制活性炭的用量(在 0．1％以下)注意 pH 值对高压灭菌下培养基中成 分的影响等。 (3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。 (4)注意高压灭菌后培养基 pH 值的变化及回复动态。如高压灭菌后的 pH 值常由 5．80 升高至 6．48。 而 96h 后又回降至 5．8 左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。 2．用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入 95％的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭 菌。冷却后，立即使用。操作中可采用 250 或 500ml 的广口瓶，放人 95％的酒精，以便插入工具。 3．玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到 160-180~(2 的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞 的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用 170~C 持续 90min 来灭菌。干热灭菌的物品要 预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌 时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和 穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源 消耗太大，浪费时间。 4．不耐热的物质采用过滤灭菌 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通 常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为 0．45um 以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞 和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小 时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射 器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。 5．空间采用紫外线和熏蒸灭菌 (1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细 菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长 为 200-300nm，其中以 260nm．的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只
适于空气和物体表面的灭菌:而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。 (2)熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气 体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭 紧密即可。 化学消毒剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加 菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好 另外,由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。还有消 毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外。 常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按58m1/m3用量,将甲醛置于广口容器中,加5g m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果 不如甲醛。 6,一些物体表面用药剂喷雾灭菌 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用70%的酒精 反复涂擦灭菌,1%-2%的来苏儿溶液以及0.25%-1%的新洁尔灭也可以 7.植物材料表面用消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会 造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上 这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体( explant) 首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。把 材料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时 间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别 有用。 洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物, 除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质-吐温 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70% 酒精、消毒液、无菌水、手表等。用η0%酒精浸10-30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作 用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料, 如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则 可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内 部材料。 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1-2种使用见表4-2。 灭菌剂使用浓度持续时间/min去除的难易效果 次氯酸钙9%,10%5-30易很好
适于空气和物体表面的灭菌；而且要求距照射物以不超过 1．2m 为宜。 (2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气 体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭 紧密即可。 化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加 菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。 另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消 毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按 5-8m1／m3 用量，将甲醛置于广口容器中，加 5g ／m3 高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果 不如甲醛。 6，一些物体表面用药剂喷雾灭菌 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用 70％的酒精 反复涂擦灭菌，1％-2％的来苏儿溶液以及 0．25％-1％的新洁尔灭也可以。 7．植物材料表面用消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会 造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上， 这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体(explant)。 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把 材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时 间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别 有用。 洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物， 除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质-吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70％ 酒精、消毒液、无菌水、手表等。用 70％酒精浸 10-30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作 用，加之 70％酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料， 如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则 可只用 70％酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内 部材料。 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取 1-2 种使用见表 4-2。 灭菌剂 使用浓度 持续时间／min 去除的难易 效果 次氯酸钙 9％，10％ 5-30 易 很好
次氯酸钠2%5-30易很好 氯化汞0.1%,1%5-8较难最好 抗菌素4"50me/L30-60中较好 表4-2常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯 气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的:过氧化氢是分解 中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水涮洗3-4次即可:由于用升 汞液灭菌的材料,难以对升汞残毒较难去除,所以应当用无菌水涮洗8-10次,每次不少于3min,以 尽量去除残毒 灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒人消毒溶液,不时用玻璃棒轻 轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。在快到时间之前1-2min, 开始把消毒液倾人一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒入无菌水,轻搅涮洗。 灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒人无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果,以便改正。 灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌 在灭菌溶液中加吐温-80或 Triton x效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容 易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间 般加入灭菌液的0.5%,即在100m1加入15滴 最后一步是用无菌水涮洗,涮洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,涮洗3-10次左右。无菌 水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用 无菌操作 接种时由于有一个敞口的过程,所以是极易引起污染的时期,这一时期主要由空气中的细菌和工作 人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%-3%的高锰酸钾溶液对设备、 墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外,还可在使用期间用70%的酒精或3% 的来苏儿喷雾,使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行: (1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室,并打开其内紫外灯进行灭菌 (2)在接种前20rain,打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯 3)接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿托鞋等 (4)上工作台后,用酒精棉球擦拭双手,特别是指甲处。然后擦拭工作台面: (5)先用酒精棉球擦拭接种工具,再将镊子和剪子从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养 皿要过火烤干 (6)接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等 )接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌30rain。若连续接种,每5天要大强度灭菌一次
次氯酸钠 2％ 5-30 易 很好 氯化汞 0．1％，1％ 5-8 较难 最好 抗菌素 4"50me／L 30-60 中 较好 表 4-2 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯 气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解 中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗 3-4 次即可；由于用升 汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗 8-10 次，每次不少于 3min，以 尽量去除残毒。 灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒人消毒溶液，不时用玻璃棒轻 轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前 1-2min， 开始把消毒液倾人一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。 灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒人无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。 灭菌液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。 在灭菌溶液中加吐温-80 或 Triton X 效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容 易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间， 一般加入灭菌液的 0．5％，即在 100ml 加入 15 滴。 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次 3min 左右，视采用的消毒液种类，涮洗 3-10 次左右。无菌 水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。 二、无菌操作 接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作 人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用 1％-3％的高锰酸钾溶液对设备、 墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用 70％的酒精或 3％ 的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行： (1)在接种 4h 前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； (2)在接种前 20rain，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面； · (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养 皿要过火烤干； (6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌 30rain。若连续接种，每 5 天要大强度灭菌一次
接种 接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官,经切割或剪裁成小段或小块,放人培养基的过程。以 上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌,现将接种前后的程序连贯地介绍。 (1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗,最后沥去 水分,取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上 (2)材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm 见方的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程 中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染 (3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程是:先解开包口纸 将试管几乎水平拿着,使试管口靠近酒精灯火焰,并将管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒 钟。若用棉塞盖口,可先在管口外面灼烧,去掉棉塞,再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的 外植体送人试管内,轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上,以放1-3块为宜。至于材料 放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外,其他尚无统一要求。放置材料数量现在倾向少放,通过 统计认为:对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜,这样可以节约培养基和大力,一旦培养 物污染可以抛弃。接完种后,将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞,塞好后,包上包口纸,包 口纸里面也要过火 第二节培养和驯化 培养 指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里,使之生长,分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程 1.培养方法 (1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单,易行, 但养分分布不均,生长速度不均衡,并常有褐化中毒现象发生 (2液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少,所以通常需要通过 搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给,采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养,其速度一般 为,50-l0σr/min,这种定期浸没的方法,既能使培养基均一,又能保证氧气的供给。 培养步骤 (1)初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后,最初的几代培养。初代培养时, 常用诱导或分化培养基,即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性 繁殖系包括:茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为:
三、接种 接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放人培养基的过程。以 上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌，现将接种前后的程序连贯地介绍。 (1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去 水分，取出放置在灭过菌的 4 层纱布上或滤纸上。 (2)材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成 0．5cm 见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含 1-2 片幼叶的茎尖大小等。在接种过程 中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 (3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程是：先解开包口纸， 将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒 钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的 外植体送人试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放 1-3 块为宜。至于材料 放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外，其他尚无统一要求。放置材料数量现在倾向少放，通过 统计认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样可以节约培养基和大力，一旦培养 物污染可以抛弃。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包 口纸里面也要过火。 第二节 培养和驯化 一、培养 指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。 1．培养方法 (1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行， 但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。 (2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过 搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般 为，50-100r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 2．培养步骤 (1)初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养时， 常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性 繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为：
1)顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素,可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长,从而形成一个微型的多 枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代,重复芽-苗增殖的 培养,并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上,就能得到可种植到土壤 中去的完整的小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖,如月季、 茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型扦插,它不经过发生愈伤组织而再生,所以是 最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。 适宜这种再生繁殖的植物,在采样时,只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段,其他如种子萌发后 取枝条也可以。 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体 进行接种。在实际操作中,采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养,这样便保证了操作方便 以及容易成活 用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长,有直立向上的茎梢,扩繁时主要用切割茎段法,如香 石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽,形成芽丛 2)不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽,通常首先要经脱分化过程,形成愈伤组织的细胞。然后,经再分化 即由这些分生组织形成器官原基,它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性(这与胚状体不同)。多数 情况下它先形成芽,后形成根 另一种方式是从器官中直接产生不定芽,有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛 福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下,培养基中提供了营养,特别是提供了连续不断植物激 素的供应,使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽 所覆盖。'在许多常规方法中不能无性繁殖的种类,在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生 如柏科,松科,银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽,用百合鳞片的切 块就可大量形成不定鳞茎。 在不定芽培养时,也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物,一般采用芽丛进行繁 殖,如非洲菊、草莓等。 3)体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同,它也通过球形, 鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期 最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生,也可从外植体表面已 分化的细胞中产生,或从悬浮培养的细胞中产生。 4)初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后,其表面开始褐变,有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由 于植物组织中的多酚氧化酶被激活,而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中,会产生醌类物
1)顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多 枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽-苗增殖的 培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤 中去的完整的小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、 茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是 最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。 适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后 取枝条也可以。 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体 进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便 以及容易成活。 用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香 石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。 2)不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化， 即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性(这与胚状体不同)。多数 情况下它先形成芽，后形成根。 另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、 福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激 素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽 所覆盖。'在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生， 如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切 块就可大量形成不定鳞茎。 在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁 殖，如非洲菊、草莓等。 3)体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期， 最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已 分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。 4)初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由 于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物