《组织培养》讲义电子书籍（共十一章）.doc_P11-P15

育进程。如烟草芽的形成以928℃为最好,在12℃以下,33℃以上形成率皆最低不同培养目标采用的培养温度也不同,百合鳞片在30-C以下再的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25t以下的高。桃胚在2-5℃条件进行一定时间的低温处理,有利于提高胚培养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3-5d,可得到无病毒苗。、光照(1ight) 组织培养中光照也是重要的条件之一,主要表现在光强、光质、以及光照时间方面 1.光照强度( l ight intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响,从目前的研究情况看,光照强度对外植体细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说,光照强度较强,幼苗生长的粗壮,而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2.光质 light wave) 光质对愈伤组织诱导,培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养, 8周后,分化出愈伤组织。但在蓝光下培养,几周后才出现愈伤组织,而唐菖蒲子球块接种15d后在蓝光下培养首先出现芽,形成的幼苗生长旺盛,而白光下幼苗纤细 3.光周期(1 igh period) 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养,最常用的周期是16h的光照,&h的黑暗。研究表明,对短日照敏感的品种的器官组织,在短日照下易分化,而在长日照下产生愈伤组织,有时需要暗培养,尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。三、湿度( humidity) 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件,容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量,否则,将使培养基于硬,以致不利于外植体接触或插进培养基,导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况,但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻,也会导致植物生长发育受影响环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发,一般要求70%-80%的相对湿度,常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分,导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高,进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时,易引起棉塞长霉,造成污染四、渗透压( penetrating pressure 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物,因此,而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用,2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用,而5-6个大气压植物生长就会完全停止,6个大气压植物细胞就不能生存。五、pH值不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表2

育进程。如烟草芽的形成以 928℃为最好，在 12℃以下，33℃以上形成率皆最低。不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在 30~C 以下再的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在 25t 以下的高。桃胚在 2-5℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用 35℃处理草莓的茎尖分生组织 3-5d，可得到无病毒苗。二、光照(1ight) 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面： 1．光照强度(1ight intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2．光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养， 8 周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种 15d 后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 3．光周期(1igh period) 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是 16h 的光照，8h 的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。三、湿度(humidity) 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基于硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求 70％-80％的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。四、渗透压(penetrating pressure) 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常 1-2 个大气压对植物生长有促进作用，2 个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而 5-6 个大气压植物生长就会完全停止，6 个大气压植物细胞就不能生存。五、pH 值不同的植物对培养基最适 pH 值的要求也是不同的(表 2-

1)，大多在 5-6．5 左右，一般培养基皆要求 5．8，这基本能适应大多植物培养的需要。表 2-1 不同植物的最适 PH 值最适 pu 值种类最适 PH 值杜鹃 4．0 月季 5．8 越桔 4．5 胡萝、石刁柏 6．0 蚕豆 5．5 桃 7．0 番茄、葡萄 5．7 pH 值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高一些。一般来说当 pH 值高于 6．5 时，培养基全变硬；低于 5 时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低 pH 值(约 0．2-0．3 个 pH 值)因此在配制时常提高 pH 值 0．2-0．3 单位。pH 值大小调整可用 0．1M 的 NaOH 和 0．1M 的 HCI 来调整。lml 的 NaOH 可使 pH 值升高 0．2 单位，lml 的 HCI 可使 pH 值降低 0．2 单位。调节时一定要充分搅拌均匀。六、气体(gas) 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。·培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。复习思考题 (1)因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些分实验室?各分室的作用是什么? (2)常规组织培养时，需要什么设备和器械?怎样使用? (3)组织培养中，pH 值起什么作用?如果 pH 值过高或过低会有什么后果? (4)如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度? 第三章培养基目的要求： (1)一般掌握培养基的种类、特点； (2)掌握基本培养基的配方； (3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量； (4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤； (5)熟练掌握培养基的灭菌方法； (6)一般掌握培养基的筛选办法

培养基 culture medium是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下,不同种植物的组织对营养有不同的要求,甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同,只有满足了它们各自的特殊要求,它们才能很好地生长。因此,没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官,在建立一项新的培养系统时,首先必须找到一合适的培养基,培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中,事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求的不断认识,对已有培养基的改进,或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中,都大大促进了组织培养研究的迅速发展,取得越来越多的成功第一节培养基的种类和成分培养基的种类培养基有许多种类,根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的产生最早是 Sacks(1680)和Knop(1681),他们对绿色植物的成分进行了分析研究,根据植物从土中主要是吸收无机盐营养,设计出了由无机盐组成的 Sacks和Knop溶液,至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基, Wh ite培养基在40年代用得较多,现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基,可以保证培养材料对营养的需要,并能生长快、分化快,且由于浓度高,在配制、消毒过程中某些成分有些出入,也不致影响培养基的离子平衡培养基的名称,一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名,如Whte培养基, Murashige和 Skoog培养基(简称MS培养基),也有对某些成分进行改良称作改良培养基, 目前国际上流行的培养基有几十种,常用的培养基及特点如下 (1MS培养基它是1962年由 Murashige和 Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适,可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高,广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,效果良好。有些培养基是由它演变而来的。 (2B5培养基是1968年由 amberg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B,培养基上生长更适宜,如双子叶植物特别是木本植物。 (3 White培养基是1943年由Whte为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良,称作 White改良培养基,提高了MgSo4:的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低,适于生根培养。 (4N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单, KN03和(NH4):S04含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养 (5)KM-8P培养基它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂,它包括了所有的单糖和维生素,广泛用于原生质融合的培养。常用培养配方见表3-1

培养基 culture medium 是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的改进，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发展，取得越来越多的成功。第一节培养基的种类和成分一、培养基的种类培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的产生最早是 Sacks(1680)和 Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的 Sacks 和 Knop 溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基，White 培养基在 40 年代用得较多，现在还常用。而到 60 和 70 年代则大多采用 MS 等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如 White 培养基，Murashige 和 Skoog 培养基(简称 MS 培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基，目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下： (1)MS 培养基它是 1962 年由 Murashige 和 Skoog 为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。 (2)B5 培养基是 1968 年由 Gamborg 等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在 B，培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 (3)White 培养基是 1943 年由 White 为培养番茄根尖而设计的。1963 年又作了改良，称作 White 改良培养基，提高了 MgSO4：的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。 (4)N6 培养基是 1974 年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单， KN03 和(NH4)：S04 含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 (5)KM-8P 培养基它是 1974 年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。常用培养配方见表 3-1

成分。在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不仅増加养分、提供能量,而且也促进对N的吸收,增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。 θ3K对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时,蛋白质合成增加,维管束纤维组织发达,对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大,一般为1-3mg/L为好。制备培养基时, 常以KCl、KNO,等盐类提供。 (4Mg、S和Ca、Mg是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂:S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgS04·7H20提供。用量为1-3mg/L较为适宜;Ca是构成细胞壁的一种成分,Ca 对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用,常以CaCL·2H20提供 (5)微量元素指小于0.5mmol/L的元素,Fe,B,Mn,Cu,Mo,Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时,它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用在制做培养基时不用Fe2(S04)3和FeCB(因其在pH值5.2 以上,易形成Fe(OH),的不溶性沉淀),而用FeS04·7H20和Na2EDTA结合成螯合物使用。 Cu,Mo,Co等,也是植物组织培养中不可缺少的元素,缺少这些物质会导致生长,发育异常现象。总之,植物必需营养元素可组成结构物质,也可是具有生理活性的物质,如酶、辅酶以及作为酶的活化剂,参与活跃的新陈代谢。此外,在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供应不足时,愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮,会表现出种花色素苷的颜色,不能形成导管:缺铁,细胞停止分裂;缺硫,表现出非常明显的褪绿;缺锰或钼,则影响细胞的伸长 3.有机化合物( organic com pound) 培养基中若只含有大量元素与微量元素,常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类: (1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果糖也是较好的碳源,可支持许多组织很好的生长麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%-3%,常用3%,即配制1L培养基称取30g蔗糖,有时可用2.5%,但在胚培养时采用4%-15%的高浓度,因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看,以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相当,麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同,实验时要根据配方规定按量称取,不能任意取量。高压灭菌时一部分糖发生分解、制定配方时要给予考虑在大规模生产时,可用食用的绵白糖代替 (2)维生素( vItamin)这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动,对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素,但在数量上还明显不足,通常需加入一至数种维生素,以便获得最良好的生长。主要有Ⅴs(盐酸硫胺素)、VD6(盐酸吡哆醇)、vpp(烟酸)VC(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、ⅤB2等。一般用量为0.1-1.Omg

成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对 N 的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有 KH2P04 或 NaH2P04 等。 (3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K 增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为 1-3mg／L 为好。制备培养基时，常以 KCl、KNO，等盐类提供。 (4)Mg、S 和 Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S 是含 S 氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以 MgS04·7H20 提供。用量为 1-3mg／L 较为适宜；Ca 是构成细胞壁的一种成分，Ca 对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以 CaCl2·2H20 提供。 (5)微量元素指小于 0．5mmol／L 的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co 等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用 Fe2(S04)3 和 FeCl3(因其在 pH 值 5．2 以上，易形成 Fe(OH)，的不溶性沉淀)，而用 FeS04·7H20 和 Na2-EDTA 结合成螯合物使用。B， Mn，Zn，Cu，Mo，Co 等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。总之，植物必需营养元素可组成结构物质，也可是具有生理活性的物质，如酶、辅酶以及作为酶的活化剂，参与活跃的新陈代谢。此外，在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长。 3．有机化合物(organic compound) 培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类： (1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在 2％-3％，常用 3％，即配制 1L 培养基称取 30g 蔗糖，有时可用 2．5％，但在胚培养时采用 4％-15％的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时一部分糖发生分解、制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。 (2)维生素(vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有 Vsl(盐酸硫胺素)、VD6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、VC(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、VB2 等。一般用量为 0．1-1．Omg