OO-碱基碱基0H2SO0减基H--5'CHLOHOHOHH核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸H脱氧核苷酸0P0dNTPA,C,GT基O0=0-0=5'HOP-O-00OHz-----碱基S'CHdHOHOH磷酸二酯键βXanHLHddNTPO-A,C,G&T威基O=O=PO=5'HOPC0-OH2-DS'CH基dHOHOH缺少3'羟基阻止了双脱氧核苷酸BYa.磷酸二酯键的形成3'3'HnHL脱氧核糖核苷酸(dNTP）及双脱氧核糖核苷酸(ddNTP12双脱氧核苷酸终止DNA合成
双脱氧核苷酸终止 12 DNA合成 脱氧核糖核苷酸(dNTP) 及双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)
单链模板DNA体系：四种dNTP含引物32P-dNTP.DNA聚合降核苷酸引物*膜版dOGTEddTTPddCTEIdATE&四种核苷酸，dTTPdATP,dGTP.dCTP引物当ddNTP警代dNTP梦入时生成末端终止的DNA链合成立刻终止脱氧赛核苷酸心用同位素标记的双新合成的DNA脱氧核苷酸：ddTTP*,ddATP*ddGTP*ddCTP*DNA聚合酶，引物终止片段用凝胶电泳分离，即可按分子量大小读出碱基序列。Sanger测序法原理图13
13 膜版 四种核苷酸，dTTP, dATP, dGTP,dCTP 用同位素标记的双 脱氧核苷酸： ddTTP * , ddATP * , ddGTP * ,ddCTP * 。 DNA聚合酶，引物 Sanger 测序法原理图 体系： 终止片段用凝胶电泳 分离，即可按分子量 大小 读出碱基序列
U模板TAGCAACT3-5ATCGTTGA引物荧光引物延长和合成阻断标记2告3管1管一双脱氧法原理示意图dATPdATPdATPdATP+ddATPdGTPdGTPdGTP+ddGTPdGTPdCTPdCTPdCTP+ddCTPdCTPdTTP+ddTTPdTTPdTTPdTTP-ATCGTddTATCGTTddG-ATddCATCGTTGddA-ATCGddT-ATCddG-ddA-AddT产物A梦长短排列AATCGTTGddAGATCGTTddG3TATCGTddT电泳后的放射TATCGddT自三影直读团G-ATCddGc-ATddC5TAddTBalduA-ddA
Sanger双脱氧链终止法的特点第一代测序技术的主要优点：测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%。第一代测序技术的主要缺点：测序成本高，通量低等，严重影响其大规模应用。完成一个人类基因组的测序需要3年时间
Sanger 双脱氧链终止法的特点 第一代测序技术的主要优点： 测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%。 第一代测序技术的主要缺点： 测序成本高，通量低等，严重影响其大规模应用。 完成一个人类基因组的测序需要3年时间
第二代测序技术：高通量测序测序流程bDNAfragmentationDNA fragmentation高通量测序：一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序Invivo cloning andamplificationInvitroadaptor ligation又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深Cycle sequencingGeneration ofpolonyarrayGACTAGATACGAGCGTGA..-5'(tempiate)入、细致、全貌的分析.CTGAT(primer)..CTGATC.CTGATCT所以文被称为深度测序SGATA三.CTGATCTAT.CTGATCTATG.CTGATCTATGCPolymerase.CTGATCTATGCTdNTPs-.CTGATCTATGCTCLabeled ddNTPsCTGATCTATGCTCGHigh-throughput SequencingElectrophorsesisCyclic arraysequencingNext Generation Sequencing(>106reads/array)(1 read/capillary)CveletCycle 2Cycle3Deep SequencingTCWhatisbase1?Whatisbase2?Whatisbase3?
第二代测序技术：高通量测序 高通量测序: 一次性对几百万到十亿 条DNA分子进行并行测序， 又称为下一代测序技术， 其使得可对一个物种的 转录组和基因组进行深 入、细致、全貌的分析， 所以又被称为深度测序。 测序流程 • High-throughput Sequencing • Next Generation Sequencing • Deep Sequencing