测序技术的前世今生测序技术的发展历程SingkemolecukRell Dme(SMRT)Heliscope(2009)IR(2008)(1983)DNA双耀型3700Nanopore(1950)(1998)(2008)心期onPGMF1OSR光dUNTP(2010)第一台商用消传卖列自动测序伙(960(1987-1950196019701980199020002010454化鲜毛细营电话(2005)GeXPFuSngerDNADSequencer(2010)(1977)(1996)传物销Solid System(1952)第一台自动(2007)消孕仪(1986)DNAL技水(1974)第一代测序技术（Sanger测序）第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解），在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础原理：ddNTP的3'无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来史断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。dNTPdaNTP双脱氧核苷三磷酸DFFTHEWA1Y
测序技术的前世今生 测序技术的发展历程 第一代测序技术（Sanger 测序） 第一代 DNA 测序技术用的是 1975 年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法 或者是 1976-1977 年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在 2001 年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的 Sanger 法为其测序基础。 原理：ddNTP 的 3’无羟基，其在 DNA 的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中 断 DNA 合成反应，在 4 个 DNA 合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的 ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP 和 ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置 确定待测分子的 DNA 序列
模板TAGCAACT5ATCGTTGA梦荧光引物延长和合成阻断标记2告3号告双脱氧法原理示意图dATPdATPdATPdATP+ddATPdGTPdGTPdGTP+ddGTPdGTPdCTPdCTPdCTP+ddCTPdCTPdTTP+dTTPdTTPdTTPdTTP++★ATCGTddTATCGTTddG-ATCGTTGddA-ATddC-ATCGddT-ATCddG-ddA-AddT→+产坊按长短排列AATCGTTGddAGATCGTTddG34T-ATCGTddTT电泳后的放射-ATCGddT自三影直设园G-ATCddGc-ATddC5TBenfAddTAddA第二代测序技术(NGS)第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。1.illuminaIllumina公司的Solexa和Hiseg是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeg系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：DFF THE A11
第二代测序技术(NGS) 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达 1000bp，准确性高达 99.999%，但其测序成本 高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以 Roche 公司的 454 技术、illumina 公司的 Solexa、Hiseq 技术和 ABI 公司的 Solid 技术为标记的第二 代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确 性，以前完成一个人类基因组的测序需要 3 年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要 1 周，但在 序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有 100bp-150bp。 1. illumina Illumina 公司的 Solexa 和 Hiseq 是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球 75%以上， 以 HiSeq 系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下 4 步：
applyDNAfragmentstoflowcellcluster generation bysolid phasePCR4sequencingbysynthesiswithreversibleterminators(bridge amplification)而价师大8.irstcheedeterminefirstbaBeforatingthistrycyclstrycycle1）构建DNA测序文库DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。2）测序流动槽（flowcell）结构：Flowcell是测序的载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2行column，每行column有60个tail，每个tail经ccD镜头课捕获荧光信号。实特示意图DFF THEMA11
1）构建 DNA 测序文库 DNA 分子用超声波打断成 200bp-500bp 长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。 2）测序流动槽（flowcell） 结构：Flowcell 是测序的载体，课吸附 DNA 文库，每个 flowcell 有 8 条 lane，每个 lane 有 2 行 column，每行 column 有 60 个 tail，每个 tail 经 CCD 镜头课捕获荧光信号
流动精（(Flowcel)每个流动情包折8个冰道（Lane）aneColumn1Column2每条冰道（Lane）包含2列（Column），每列分布多个小区（tile），合计120个*每个流动格书8条冰道，每条泳道有2列·每列有60个小区?每个小区在一次SBS籍环反应中会拍黑4次每个le可以获取一张图片（350X350um）3）成簇（cluster）NGS的核心技术特点，目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到CCD镜头摄取荧光的信号要求。大体原理网上都可查到，在此解答2大难理解之处：咖m-38088s可逆终止荧光dNTPllumina测序核心技术）荧光修饰dNTP可逆合成终止（包括用叠氮基团即起到了可逆终止作用和用不同荧光集团区别碱基信号的功能），是Illumina测序的最核心技术。OFF THE WA11
3）成簇（cluster） NGS 的核心技术特点，目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到 CCD 镜头摄 取荧光的信号要求。大体原理网上都可查到，在此解答 2 大难理解之处： 一．可逆终止荧光 dNTP(Illumina 测序核心技术) 荧光修饰 dNTP 可逆合成终止（包括用叠氮基团即起到了可逆终止作用和用不同荧光集团区 别碱基信号的功能），是 Illumina 测序的最核心技术
NHOC'O-P-O-p-O-Po1.上图是修饰过的dCTP分子结构式，在核苷酸糖基的3'位连一个叠氮基团（红色基团）。这个叠氮基团在链延伸的时侯起到了阻正聚合的作用（理解见下图DNA复制时的5和3的示意图，下一个碱基合上时是：下一个核苷酸的5'P连接到上一个核苷酸的3OH，故如果下一个核苷酸的3'带有叠氮基团而非自然状态下的OH时，下一个核苷酸就无法合上。）PrimrDNA'O-P-0Templatc3DNA0-P-0--0-00oDeoxymucdleosidetriphoephateOH(ATP.OGTP,dCTP,JTTPDNAbut, in this iliustrution,dATP)polymeO-P-0-OH+0mC00InorganicpyrophosphateB,02P,OFIH香核苷一%很核台二楼酸板首三楼级2.叠氮基团有一个特性，就是遇到巯基试剂（例如：二统基丙醇），叠氮基团会发生断裂，并在原来的位置留下一个羟基因此在荧光照相之后可以借此回复3"的-OH状态，以供下一个碱基合上。3.在碱基上，通过连接臂（蓝色基团）连接一个荧光基团。4种dNTP分别连4种不同颜色的荧光基团。测序时，通过识别荧光基团的颜色，就可以判断原来的碱基是哪一种。在dNTPOFF THEMA11
1. 上图是修饰过的 dCTP 分子结构式，在核苷酸糖基的 3'位连一个叠氮基团（红色基团）。这个 叠氮基团在链延伸的时侯起到了阻止聚合的作用（理解见下图 DNA 复制时的 5’和 3’的示意图， 下一个碱基合上时是：下一个核苷酸的 5’P 连接到上一个核苷酸的 3’OH，故如果下一个核苷酸的 3’带有叠氮基团而非自然状态下的 OH 时，下一个核苷酸就无法合上。） 。 2. 叠氮基团有一个特性，就是遇到巯基试剂（例如：二巯基丙醇），叠氮基团会发生断裂， 并在原来的位置留下一个羟基因此在荧光照相之后可以借此回复 3’的-OH 状态，以供下一个碱基 合上。 3. 在碱基上，通过连接臂（蓝色基团）连接一个荧光基团。4 种 dNTP 分别连 4 种不同颜色 的荧光基团。测序时，通过识别荧光基团的颜色，就可以判断原来的碱基是哪一种。在 dNTP