《草鱼出血病》草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的制备及其免疫效果

维普hpwwp.com //o-ll 943、12 第18卷第2期 水产学报 Vol.18,. 1994年6月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA un6,1994 草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的 制备及其免疫效果 许淑英李焕林邓国成姜兰 (珠江水产研究所,广州510380) A 捷要本文报道经筛选的GCHV-841毒株在草鱼吻端成纤维细系(PS中进行 适应性培养,弱毒驯化,细胞培养弱毒疫苗的制备安全性观察,不同稀释度和剂量的免疫保护 率测定及保存试验GCHV-841毒株在PSF细中继代化至53代达到减毒目的。筛选得 59代作毒种制备的细胞弱毒疫苗使用安全。用稀释10~10倍的疫,0.1~0.3毫升/尾 剂量注射草鱼,其免疫保护率均在8%以上生产上使用疫苗的适宜浓度和剂量是稀释103倍 和0.2毫升/尾。冻干疫苗宜保存于4℃以下较合适的保存期是6个月(4℃)和18个月 (20℃) 关键词草鱼出血病,细胞培养,弱毒疫苗,免疫寻 草鱼出血病是一种病毒性鱼病,而免疫预防是该病最有效的防治方法之一因此疫 苗研制对该病的防治意义重大。鱼用疫苗研制在我国起步虽较晚然而自1969年珠江水 产研究所首次研制试用获得成功以来(广东省农科站水产队,1972李焕林等,1979),免 疫预防已有了很大发展。在生产上的应用规模我国已走在世界前列。 多年来鱼用疫苗制品为组织灭活疫苗。但它取材来源于病鱼肝、脾、肾等显症组织, 要在发病流行季节从自然界收集,因而使大批量生产几乎不可能。往往冬末春初放养草 鱼种期间因缺乏疫苗而错过了免疫预防时机。 采用离体细胞培养法制备疫苗就能克服上述缺点我国自从鱼类细胞建株(系)获得成 功以来,浙江淡水水产研究所、长江水产研究所等单位先后利用草鱼出血病病毒敏感细胞 株(系)进行室内离体培养病毒研制出细胞培养灭活疫苗获得一定效果杨广智等,1981 杨先乐等,1986(杨广智等1990)。但迄今尚未有关于草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗研 制的报道。作者自1986年草鱼成纤维细胞系PSF建立后(李焕林等,1988),便开始进行 细胞培养弱毒疫苗(以下简称弱毒疫苗)的研制及其免疫效果的观察现将结果报道如下 一、材料和方法 1材料的来源和处理材料来源于珠江三角洲池塘中出现典型草鱼出血病症状病 收稿日期:1993-08-13 (1)广东省农科站水产队1972。上法免疫预防鱼病的研究农业科资(78-10 (2)李焕林1979草传染性烂、肠炎、赤皮组织苗免疫技术的研究全国鱼病防治技术总结暨经验交 流会资料汇编,273。 门)杨广智等1990草色出血病细胞疫苗制备技术研究。鱼类病害研究,1Z(1):1218 (:李林等,188端成纤维细胞PSF的建立及其生物学特性中国水产科学研究院学报,():18

／／o 一 ’ 第 18卷 第 期 1994年 6月 水 产 学 报 JOURNAL OF Fl8丑品RIESOF C]~：IS'4A s≥ t／2 V 0l 1H． ·． Jun6．199 A 草鱼出血病细胞培养弱毒疫 苗的 制备及其免疫效果 L／ 许淑英 李焕林 邓国成 姜 兰 ‘珠 江水 产研 究所 ，广 州 510380) 挺 要 本文 报道 经筛选 的 GCHV一艇1毒 株在 草 鱼吻端成 纤 维 细胞 系 (PSF)中进 行 适应性培养，弱毒骊化 ，细胞培养弱毒疫苗的制备 ，安全性观察 ，不同稀 释度和剂量的免疫保护 辜弭i定及保存试验。GCHV-~I毒株在 P8F细胞 中继代驯化至 53代达到减毒目的。筛选得 5 曲 代作毒种制备的细胞弱毒疫苗使用始 。用稀释 10～10．倍的疫苗，01～0．3毫升／尾 齐4量注射草鱼，其免疫保护率均在 85 以上。生产上使用疫苗的适宜浓度和荆量是稀释 10倍 和 O．2毫升，昆。冻干疫苗宜保存 于 4~CE|下 较台适的保 存 期 是 6个 月 (4℃)和 18个 月 (一20~C)。 关键词 塑皇苎茎：兰塞苎，免疫技是 草鱼 出血病是 一种病毒性鱼病 ，而 免疫预 防是该病最有效 的防治方法之一。 因此 ，疫 苗研 制对该病 的防治意义重大。鱼用疫苗研 制在 我国起步 虽较 晚，然而 自 1969年珠江水 产研究所首次研制 试用 获得成 功以来(广东 省农科 站水产 队，1972；李 焕秫 等，1979)，免 疫预防 已有 了很大发展 在生产 上的应甩规模我 国已走在世界前列 。 多年来鱼用疫 苗制 品为组织灭 活疫苗。但 它取材来源于病鱼肝 、脾、肾等显症组织 ， 要 在发病流行季节 从自然界 收集 ，固而 使大批量生产几 乎不可能 。往往冬束 春初披养草 鱼 种 期 间 圆缺 乏 疫 苗 而 错 过 了免 疫 预 防 时机 。 采用离体细胞培养法制备疫苗就 能克 服上述缺点，我国 自从鱼类细胞建 株(系)获 得成 功 以来 ，浙江淡永水产研究所 、长江水产研究所等单位先后利用草 鱼出血病 病毒 敏感 细胞 株 (系 )进 行室内离体培养病毒，研制出细胞培养灭活疫 苗，获得一定效果 [杨 广智等，198]； 枥 先乐 等 ，1988](扬 广智等 ，1990)。但迄今 尚未有 关于 草鱼 出血病细胞培 养弱毒疫 苗研 制的报道 。作者 自 1986年草鱼成纤维细胞系 PSF 建立后 (李 焕林 等 ，1988)，便开始 进行 细胞 培养弱毒疫苗 (以下简 称弱毒疫苗)的研 制及其免 疫效果的观察 。现将结果报道如下 一 、 材 料 和 方 法 I．材料的来源和处理 材 料来 源于珠江三 角溯池塘中出现典型 草鱼出血病 症 状 病 牧 槁 日期 ：】。93 ls (1)广 末省农 科站水 产队 ．I 2。土诘 免疫 穗防皖 鱼 病的研 究。农 业科 技 资料(7)，8一 lO 42)李按 林尊 ，]979 草鱼 捧染牲 烂鳃 、腩奠 ．赤 寅寤 纽鳃 苗免痊技 术舯研 究 全 国鱼宿 防治技 术总 结 暨经验 交 流舍 资料{[编 ，27—83 3)橱 广智 等 ．199o。草 鱼 出血病 细胞 矗苗 糊备技 术研 究 鱼粪病 害研究 ，lz(1)：12-16。 (4}牵 烧杯 蝽 ，10鸥 芭色嘲端 戒坪惟细 胞 系 的建 立 及其生 物 学特 性 中 舀水 产科学 研究院 学报 ，(】)：1—8_ 央病血一 维普资讯 http://www.cqvip.com

2期 许叔英等:草鱼出血病细惠培养毒疫苗的制备及其免疫效舉 t11 鱼的肝牌肾组织。取样后作如下处理:剪碎,匀浆后加入10倍组织重量的维持液,置 4"O冰箱预冷,经10000x/mi离心20分钟,取上清液,加入1000单位/毫升青霉素和 1000徽克/蜷升链霉素,置4"C冰箱过夜,即为除菌组织病毒液。 2.弱疫苗的制备方法 (1)毒株筛选将上述病毒液通过鱼体感染或接种PSF细胞增殖,回归感染草鱼, 从中筛选出强毒力的毒株作为弱毒驯化的毒种。 2)毒种弱毒驯化取长成致密单层的PsF细胞,用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙 二胺四乙酸二钠混合消化液消化约1分钟,倒掉消化液,加入含10%小牛血清的199培 养液,吹打分散细胞。然后加入除菌组织病毒液,使病毒最终浓度达1:500,分装细胞瓶内 细胞浓度约1.5×10°个/毫升)。在一定条件下静止培养,8-10天收获。-200冰结。 冻融后收获细胞病毒液,即为第一代的细胞毒种。按上述方法接毒,使病毒浓度稀释50 倍,病毒在草鱼吻端成纤维细胞(PSF)中连续继代驯化,即为某一代的细胞毒种。与此同 时,每代毒种以原液和10倍稀释液、每尾0.2毫升剂量注射全长9-12厘米的草鱼作毒力 检查,15天后以草鱼出血病强毒0.2毫升/尾剂量攻毒观察15天,检查其免疫保护力。 〈3)弱毒湿疫苗的制备采用静止和旋转两种培养方法进行。静止培养同“毒种弱 毒驯化”的继代培养。旋转培养用每小时15转的转鼓带动大容量的小口培养瓶,病毒接 种量、接种方法同静止培养,但细胞浓度要比静止培养大一倍。用安全性好,免疫原性强 的GHv-841毒株筛选代作毒种,收获后的细胞病毒液经安全性和免疫保护力检验合 格者,即为弱毒湿疫苗。 4)弱毒冻干疫苗的制备将各批弱毒湿疫茁经无菌操作倒入大容量的玻璃瓶混 合然后按1:1加入经高压消毒的含5%蔗糖的脱脂牛奶作保护剂。再按总量加入500单 位/毫升青霉素和500微克/毫升链霉素,充分摇匀后,分装冻干瓶中,每瓶5毫升,置真空 冷冻于燥机作冻干处理。出机后经抽真空、加塞、蜡封,即制成冻干疫苗 3.弱每疫苗安全性与免疫保护率以及保存期的观测方法 (1)用稀释10-10倍的弱毒疫苗,分别以02毫升/尾剂量注射草鱼种(在水泥池 或水族箱进行),设对照组。15天后以强毒0.2毫升/尾攻毒。观察15-20天,记录并统 计免疫鱼和对照鱼的显症死亡率,从而计算各稀释度的免疫保护率。 2)用同一批弱毒疫苗稀释10-104倍(用0.65%生理盐水),四种浓度分别以0.1、 02、0.3毫升/尾三种剂量注射当年草鱼种,设对照组。免疫15天后用强毒攻毒之。观察 15-20天,记录和计算各稀释度不同剂量的免疫保护率 (3)将同一批弱毒冻于疫苗分别存放于室温40和-200三种温度下,经2个月、6 个月、18个月和24个月分别随机取出一瓶,用生理盐水稀释10~10倍,以0.2毫升/尾 注射免疫当年草鱼种,设对照组。兔疫15天后用强毒攻毒之。观察15天,分别计算兔疫 保护率。 二、结果 1.弱毒疫苗安全性观察通过数十个野毒材料筛选出GOHv-841毒力强的株

2期 许识荚等：草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的翩备及其免疫效果 鱼 的肝、睥 、肾组织。取 样后作如 下处 理 ：剪碎 ，匀浆 后加入 10倍组织重量 的维持液 ，置 4~C冰箱预冷 ，经 10000r／min离心 20分钟，取上清液 ，加入 1000单位／毫升青霉 素和 1000微克／毫升链霉 素，置 4oa冰箱过夜 ，即为除菌组织病毒液 2． 弱 毒 疫 苗 的 制备 方 法 (1)毒株 筛选 将上述病毒 液通过鱼体感染或接种 PSF 细胞增殖 ，回归感染 草鱼 ， 从 中筛 选 出 强 毒 力 的 毒 株 作 为 弱 毒 驯 化 的 毒 种 。 (2) 毒 种 弱 毒 驯 化 取 长 成 致 密 单 层 的 PSF 细胞 ，用 0．25 胰 蛋 白酶 和 0．02 乙 二 胺四 乙酸二钠混合 消化坡消化约 1分钟 ，倒 掉消化液 ，加入含 1O％小牛 血清 的 199培 养 液 ，吹 打 分 散 细 胞 然 后 加 入 除 茼 组织 病 毒 液 ，使 病 毒 最终 浓 度 达 1：500，分 装 细胞 瓶 内 (细胞 浓度 约 1．5x10‘个／毫 升 )。 在 一 定 条 件 下 静 止 培 养 ，8— 10天 收获 ． 一2O。a冰 结 。 冻 融后收获细胞 病毒菠 ，即为第一代的细胞毒种。按 上述方法 接毒 ，使 病毒 浓度稀释 50 倍 ，病毒在草鱼吻端成纤维 细胞 (PSF)中连 续继 代驯化 ，即为某一代 的细胞 毒种。 与此 同 时 ，每代毒种 以原液和 l0倍 稀释液 、每尾 0．2毫升 刘量注射全长9— 12厘米的草鱼作毒力 检查 ，15天 后以草 鱼 出血病强毒 0．2毫 升／尾 剂量攻毒 ，观察 15天 ，检查其 免疫保护力。 (3)弱毒 湿痘 苗的制备 采用 静止 和旋 转两种培养方法进行。静止培养 同 “毒 种弱 毒驯化 的继代培养。旋转 培养用每小 时 15转的转鼓带动大容 量的小 口培养瓶 ，病毒接 种置 、接种方法 同静 止培养 ，但细胞浓 度要 比静止培养大一倍。用安 全性好 ，免疫原性强 的 GCHV一841毒株筛选代作毒种 ，收获 后的细胞 病毒 液经安全性和免疫保护力检 验 台 格 者，即为弱毒湿 疫苗 。 (4)弱毒 冻干痘 苗的制 备 将 各批 弱毒 湿疫苗经无菌操作 倒入大容 量 的 玻 璃 瓶 混 台 ，然后按 1：1加入经高压消毒 的含 5跖蔗糖的脱脂牛奶 作保护 剂。再按总量加入 500单 位／毫升青霉素和 500微克／毫升链霉素 ，充 分摇匀后 ，分装 冻干瓶 中 ，每瓶 5毫升 ，置真 空 冷冻干燥 机作冻干处理 。出机后经抽 真空、加塞 、蜡封 ，即制成 冻干疫苗 。 3． 弱毒 疫 苗 安 全 性 与免 疫 保 护率 以及 保 存 期 的 观测 方法 (1)用稀 释 10—10‘倍 的弱毒疫苗 ，分别 以 0．2毫升／尾 剂量注射草 鱼种 (在水泥池 或水族箱进行)，设对照 组。15天后 以强毒 0．2毫升／尾攻毒。观察 l5—20天 ，记 录并 统 计免疫鱼和对照鱼的显 症死亡率 ，从而计算 各稀释度的免疫保护率。 (2)用 同一批弱毒 疫苗 稀释 10—10‘倍 (用 0．65 生理盐水 )，四种浓度分别以 0．1． 0．2、0．3毫升／尾 三种 剂量 注射 当年 草鱼种 ，设对照 组。 免疫 15天后用强毒攻毒之 。观察 15— 2O天 ，记录和计算 各稀释 度不 同剂量的免疫保护率。 (3)将 同一 批弱毒冻干疫 苗分 别存放于 室温、4。a和 一20。a三种温度下 ，经 2个月 、6 个月 、18个月和 24个月分别随机取 出一瓶 ，用生理盐水稀 释 i0~10‘倍 ，以 0．2毫升／尾 注射免疫 当年 草鱼 种，设对照组。免疫 15天后用强毒攻毒 之。观 察 15天 ，分别计算 免疫 保 护 率 。 二 、结 果 1． 弱 毒 痘 苗 安 全 性 观 察 通 过 数 十 个 野 毒 材 料 筛 选 出 C-~ ttV--841毒 力 强 的毒 株 ， 维普资讯 http://www.cqvip.com

112 水产学报 18卷 作为弱毒驯化的毒种。几年来在PSF细胞中进行适应性培养,一直保持较强毒力。但在 某一定培养条件下传至50代毒力显著减弱,回归感染死亡率仅30%,传至52代降为 10%,53代毒力更弱,草鱼注射后不出现显症或其他异常现象。连续传至59代均能保持 这种弱毒化性状(表1)。作者釆用53-59代毒种制备弱毒疫苗,均能达到安全性检验的 要求(表2)。 表1GcHv-841毒株49-59代毒力变化及弱毒化后的免疫原性 Table 1 Virulence variation and immunogenicity after attenuation in 49-59 generations of GCHV--841 毒株代数 倍数 剂量、定定死亡率试验组成活来对照组战活率的疫保护率 61 100 10 03 08 10 100 表2弱毒疫黄的安全性观察 Table 2 Observation on innocuity of attenuated live vac 疫苗批号 倍数 存活尾数{试验尾数 100 疫 10:10 10 1010 2 2.弱毒疫菌免疫保护率测定 (1)弱泰疫苗不同种释度的保护率用GOHv-841毒株53-59代分别制备的弱毒

112 水 产 学 报 18巷 作 为 弱毒 驯化 的毒 种。 几年 来 在 PSF 细 胞 中 进 行 适 应 性 培 养 ，一 直 保 持 较 强 毒 力 。但 在 某 一 定 培 养 条 件 下 传 至 50代 毒 力 显 著 减 弱 ， 回 归 感 染 死 亡 率 仅 30 ，传 至 52代 降 为 10 ，53代毒力更弱 ，草鱼 注射 后不 出现显症或其他异常现象 。连续传至 59代均能保 挣 这 种弱毒 化性状 (袁 1)。作者采用 53—59代毒种制备弱毒疫苗 ，均能 达珂安全性检验 的 要求 (表 2)。 表 1 GCHV一841毒株 49—59代 毒 力变化及 再 毒化 后 的免 疫原性 Table 1 V irulence variation and im munogenicity after attenuation in 49— 劢 generationsof GCH V- 841 I∞ 2．弱毒疫苗免疫保护率测定 (t) 弱毒 疫苗不 同稀释 度的保护 率 用GOⅡV一841毒株 53-59代分 别制备的弱鸯 维普资讯 http://www.cqvip.com

2期 许淑英等:草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的制备及其免疫效果 113 疫苗注射当年草鱼种,其免疫保护率均在85%以上(表1)。其中用55-57代分别制备的 弱毒疫苗,当稀释倍数为10时,免疫保护率仍达100%,当稀释倍数为10时,免疫保护 率也可达50%(表3) 表3弱毒疫苗不同稀释寝的保护率 Table 3 Percent relative protection of A. L.. in difforent dilutions 毒株代数 稀释倍数剂量(毫升/尾)免疫組成活%」对照组成活率(%)兔疫保护率(%) 0.2 103 02 100 100 10 100 (2)弱毒疫苗不同注射剂量的免疫保护率用同一批弱毒疫苗对草鱼免疫后进行攻 毒试验表明,稀释倍数为10-10°的疫苗,分别以0.1、0,2、03毫升/尾注射草鱼种,其免 疫保护率都相同,均为100%(表4)。 表4弱毒疫苗不同剂量的保护率 Table4 Percent relative protection of A. L. v in different dosages 剂量(毫升尾)疫苗稀释倍数免疫组成活率〔%)对照组成活率(%)免疫保护率(%) 0. 100 100 100 000000000000 (3)弱毒疫荀不同保存期诚验同一批弱毒冻干疫苗分别保存于室温、4°和一20°0 三种温度,试验结果保存于4°C和-20°06个月的,用稀释倍数10-10注射草鱼,其免

2翔 许飙英等 ：草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的制备及其免疫效果 113 疫苗 注射 当年 草鱼种 ，其 免疫 保护率均在 85 以上(表 1)。其 中用 55—57代分 别制备的 弱毒 疫苗，当稀释倍数 为 i0 时 ，免疫保护率仍达 100 ，当稀释倍数 为 10‘时，免疫 保护 率 也 可 达 50 (表 3)。 表 5 弱毒 疫 苗不 周稀 释度 的保 护 率 Tsble 3 Percent relative protection of A ．L ．V ．in different dilutions (2)弱毒 疫 苗不 同注射 剂量的 免疲保护 率 用 同一批 弱毒疫苗对草鱼免疫后进 行攻 毒试 验表明 ，稀 释倍 数为 10—1O。的疫 苗 ，分别 以 0．1、0．2．0．3毫升／尾 注射草鱼种 ，其免 疫保 护 率 都 相 同 ，均 为 100％ (表 4)。 表 4 弱毒 疫苗 不同 剂量 的保 护率 T able 4 Portentrelative protection of A ．L ．V ．in differentdosages (3)弱毒 疫苗不 同保存期试验 同一批弱毒 冻干 疫苗分别保存于室 温、4。c和 一20。a 三 种 温度 ，试验结果 t保 存于 4。a和 一20。a6个月 的，用稀 释倍 数 10—10。注射草 鱼，其免 维普资讯 http://www.cqvip.com

114 水产学報 18卷 疫保护率均达100%,疫蓝效价不变用10注射草鱼,保存于-20°0的,其免疫保护率仍 然达100%,但保存于4°C的,其免疫保护率降为889%另外在-20°C保存18—24个 的疫苗,用稀释倍数为10—10°注射草鱼疫苗效价仍不变,免疫保护率仍达100%保存 于室温的疫苗免疫效价下降较快,保存2个月(春季),10稀释倍数的保护率降为80%, 保存6个月(春、夏季),其保护率只剩33.3%表5)。 表5弱毒冻干疫苗不同温度和时间保存比较 Table 5 Comparison of storage period for freeze-dried vaccine In different temperatures 保存温度 保存期 免成起 对照组成活牢 释倍教 44,4 88.9 IL、1 10 88 0000000000 100 70 103 100 、讨论 1.医学和兽医学方面早已广泛应用疫苗制品对各种疾病进行免疫预防。疫苗制品 主要是弱毒疫蓝,其次是灭活疫〔殷震等,1985Kis&ry等,1978 Specter等,1978。 据报道灭活疫苗一般来说具有较好的安全性。但也存在一定的缺点。主要是:①须含足够

水 产 学 报 18巷 疫保 护率均达 lOO％ ，疫苗效价不变 }用 10‘注射草 鱼，保 存于 一20a的 ，其免疫保 护率毋 然达 ioo％ ，但保 存于 4。a的，其免疫保护 率降 为 88．9 }另外在 一20。c保 存 l8— 24十 月 的疫 苗 ，用 稀释倍数 为 10— 10。注射草鱼 ，疫苗效价仍不变 ，免疫保护 率仍达 100 }保存 于室 温的疫苗免疫效价下降较快 ，保 存 2个月 (春 季)，10‘稀释倍数 的保 护率降为 80 ， 保 存 6个月 (春 、夏季)，其保护率只 剩 33．3 (表 5)。 表 5 弱毒 冻 干疫 苗不 同温 度 和时 间保 存 比较 Table5 Com parison ofstorage 1~eriod for freeze— dried aeelne in differenttemperatures 三 、讨 论 1·医学和兽医学方 面早 已广 泛应用疫 苗制品对 各种疾病进行免 疫预 防。 疫 苗 制 品 主要是弱 毒疫苗 ，其 次是灭 活疫苗[殷 震等 ，1985；Kisary等， 1978}8pect" 等 ，I978] 据报道灭 活疫苗一般来 说具有较好 的安全性 。但也存在一定的缺点 。 主要是 ①须 古足够 维普资讯 http://www.cqvip.com