（4）测 0D 值：将接种 0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 不同时间的菌悬液摇均匀 后于 560nm 波长、1cm 比色皿中测定 0D 值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照， 并将 0D 值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 大肠杆菌生长的 0D 值，你将如何选择波长? 实验四 细菌增殖曲线的测定 一．实验目的： 通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线图 二．实验原理 大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每 20mln 分 裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、 对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为 纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲 线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线， 了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意 义。 三．菌种与培养基 菌种：大肠杆菌 种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH 至 7.2。 四．仪器 光电比色计，摇床，冰箱 五．操作步骤 1、将在种子培养基中培养 20 h 的培养液 3000rpm 离心 10min 倾去上层液，加入无菌的 生理盐水，成均匀液，细胞数系 109 /m1。 2．取 10 个盛发酵培养液的三角瓶，各接 3m1 菌液作种子，在摇床上相同位置 30℃振 荡培养，并立即取下一瓶为 0 时的增殖状态．之后于培养 1、2、3、4、5、6、7、8、9 各取 一瓶，约 9 个间隔的菌液分别吸取 5m1 菌于无菌试管中，置 4℃下保存。 3．用没接种的培养液为空白对照，将上述菌液于波长 600nm 处比色，但要求消光度在 0.3 一 0.6 之间，若超过，用未接种培养液适当稀释。 六．实验结果： 1．结果 (1) 将测定的 OD600 值填入下表 培养时间（h） 对照 0 1.5 3 4 5 6 7 8 9 10 12 光密度值 OD600 （2）以菌悬液 0D 值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌培养的增殖曲线．
（4）测 0D 值：将接种 0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 不同时间的菌悬液摇均匀 后于 560nm 波长、1cm 比色皿中测定 0D 值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照， 并将 0D 值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 大肠杆菌生长的 0D 值，你将如何选择波长? 实验四 细菌增殖曲线的测定 一．实验目的： 通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线图 二．实验原理 大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每 20mln 分 裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、 对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为 纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲 线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线， 了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意 义。 三．菌种与培养基 菌种：大肠杆菌 种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH 至 7.2。 四．仪器 光电比色计，摇床，冰箱 五．操作步骤 1、将在种子培养基中培养 20 h 的培养液 3000rpm 离心 10min 倾去上层液，加入无菌的 生理盐水，成均匀液，细胞数系 109 /m1。 2．取 10 个盛发酵培养液的三角瓶，各接 3m1 菌液作种子，在摇床上相同位置 30℃振 荡培养，并立即取下一瓶为 0 时的增殖状态．之后于培养 1、2、3、4、5、6、7、8、9 各取 一瓶，约 9 个间隔的菌液分别吸取 5m1 菌于无菌试管中，置 4℃下保存。 3．用没接种的培养液为空白对照，将上述菌液于波长 600nm 处比色，但要求消光度在 0.3 一 0.6 之间，若超过，用未接种培养液适当稀释。 六．实验结果： 1．结果 (1) 将测定的 OD600 值填入下表 培养时间（h） 对照 0 1.5 3 4 5 6 7 8 9 10 12 光密度值 OD600 （2）以菌悬液 0D 值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌培养的增殖曲线．
七．思考题 (1) 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点? (2) 细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短?若细胞密度为 103／m1，培 养 4.5h 后，其密度高达 2×108／m 3，请计算出其代时。 (3) 次生代谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使 次生代谢产物积累更多？ 实验五 木霉 T6 淀粉酶的固态发酵实验 1．实验目的 了解和掌握木霉 T6 菌株在发酵过程中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲 线和测定方法。 2． 基本原理 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解 a－1，4－葡萄 糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与 3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水 杨酸被还原为 3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在 722 型分 光光度计 540 nm 波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原 糖的含量，从而求出淀粉酶的活力。 3．培养基 培养基（250mL）：麸皮 7g ，面粉 0.5g，NaNO3 0.15g，营养盐 6.5mL，pH 自然。 营养盐配方（g/L）：KH2PO4 3.0；(NH4)2SO4 2.0；Cacl2 0.5；MgSO4.7H2O 0.5；Cocl2 0.003； FeSO4 .7H2O 0.0075；ZnSO4 0.002； pH5~6。 四．实验方法： 1．还原糖的测定 （1）标准曲线的制作 取 9 支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确浓度为 1.00 mg/ml 的葡萄糖标准液和 3， 5－二硝基水杨酸试剂。表中单位为 ml。 表 1 还原糖标准曲线制作 管号 加入试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.4 0 培养时间（h） OD600 值 0
七．思考题 (1) 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点? (2) 细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短?若细胞密度为 103／m1，培 养 4.5h 后，其密度高达 2×108／m 3，请计算出其代时。 (3) 次生代谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使 次生代谢产物积累更多？ 实验五 木霉 T6 淀粉酶的固态发酵实验 1．实验目的 了解和掌握木霉 T6 菌株在发酵过程中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲 线和测定方法。 2． 基本原理 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解 a－1，4－葡萄 糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与 3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水 杨酸被还原为 3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在 722 型分 光光度计 540 nm 波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原 糖的含量，从而求出淀粉酶的活力。 3．培养基 培养基（250mL）：麸皮 7g ，面粉 0.5g，NaNO3 0.15g，营养盐 6.5mL，pH 自然。 营养盐配方（g/L）：KH2PO4 3.0；(NH4)2SO4 2.0；Cacl2 0.5；MgSO4.7H2O 0.5；Cocl2 0.003； FeSO4 .7H2O 0.0075；ZnSO4 0.002； pH5~6。 四．实验方法： 1．还原糖的测定 （1）标准曲线的制作 取 9 支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确浓度为 1.00 mg/ml 的葡萄糖标准液和 3， 5－二硝基水杨酸试剂。表中单位为 ml。 表 1 还原糖标准曲线制作 管号 加入试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.4 0 培养时间（h） OD600 值 0
3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 3 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热 5 min，立即用冷水冷水冷却至室温，再向 各管中加入蒸馏水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。 在 540 nm 波长下，以 0 号管为空白，在分光光度计上测定 1－8 号管的吸光度值。以吸光度 值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 （2）发酵液中残留还原糖的测定 发酵液单层滤纸过滤，滤液 0.2 ml 定容至 100 ml，500 倍稀释至含糖量 2-8 mg/100ml 为试样。 取 4 支干燥试管,编号,按表 2 所示的量,精确加入待测液和试剂(ml) 表 2 还原糖的测定 管号 项目 空白 还原糖 0 1 2 3 样品量 0 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 2.0 0 0 0 3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 加完试剂后,其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同,测定出各管溶液 的吸光度值。 （3）计算 以管 1、2、3 的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数， 按下式计算样品中还原糖的百分含量： 2．氨基态氮的测定 （1）取发酵滤液 5.00 ml，置于 100 ml 烧杯中，加入 15 ml 水，磁力搅拌器搅拌 5 min 后， 将电位计插入烧杯中，用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示 pH=8.20，此为游离 酸度，不予计量。加入 10.0 ml 甲醛溶液，立即混匀，速用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至 酸度计指示 pH=9.20，计下消耗 NaOH 标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。 （2）计算 氨基氮（%）=（V-V0）×N×0.014× 20/5×100 式中： V——加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积，ml; V0——加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积，ml; M—— NaOH 标准溶液的浓度,mol/L； 0.014——与 1.00mlNaOH 标准溶液相当的氮的质量，g； （3）淀粉酶活力的测定及计算： CK 样品 1 样品 2 样品 3 底物（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液（mL） 0 0.5 0.5 0.5 沸水浴 10min DNS（mL） 3 3 3 3 酶液（mL） 0.5 0 0 0 蒸馏水 加蒸馏水至 20. 5mL
3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 3 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热 5 min，立即用冷水冷水冷却至室温，再向 各管中加入蒸馏水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。 在 540 nm 波长下，以 0 号管为空白，在分光光度计上测定 1－8 号管的吸光度值。以吸光度 值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 （2）发酵液中残留还原糖的测定 发酵液单层滤纸过滤，滤液 0.2 ml 定容至 100 ml，500 倍稀释至含糖量 2-8 mg/100ml 为试样。 取 4 支干燥试管,编号,按表 2 所示的量,精确加入待测液和试剂(ml) 表 2 还原糖的测定 管号 项目 空白 还原糖 0 1 2 3 样品量 0 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 2.0 0 0 0 3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 加完试剂后,其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同,测定出各管溶液 的吸光度值。 （3）计算 以管 1、2、3 的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数， 按下式计算样品中还原糖的百分含量： 2．氨基态氮的测定 （1）取发酵滤液 5.00 ml，置于 100 ml 烧杯中，加入 15 ml 水，磁力搅拌器搅拌 5 min 后， 将电位计插入烧杯中，用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示 pH=8.20，此为游离 酸度，不予计量。加入 10.0 ml 甲醛溶液，立即混匀，速用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至 酸度计指示 pH=9.20，计下消耗 NaOH 标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。 （2）计算 氨基氮（%）=（V-V0）×N×0.014× 20/5×100 式中： V——加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积，ml; V0——加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积，ml; M—— NaOH 标准溶液的浓度,mol/L； 0.014——与 1.00mlNaOH 标准溶液相当的氮的质量，g； （3）淀粉酶活力的测定及计算： CK 样品 1 样品 2 样品 3 底物（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液（mL） 0 0.5 0.5 0.5 沸水浴 10min DNS（mL） 3 3 3 3 酶液（mL） 0.5 0 0 0 蒸馏水 加蒸馏水至 20. 5mL
550nm 处测 OD 值 OD1 OD2 OD3 淀粉酶活力（IU/g 干培养基）：本实验条件下，每分钟释放出 1umol 还原糖所需要的酶量称为一 个酶活力单位。 IU/g 干培养基＝ * *1000* * * OD n v k M t 其中：n――稀释倍数；v――浸提比（mL/g 干培养基）； k――斜率；M――葡萄糖的分子量； t――反应时间（10min）；1000――转换系数 五．操作步骤： 1．配制培养基，灭菌，冷却。 2．冷却后接种，并搅拌 均匀，置于 28℃培养箱进行培养。 3．每隔 24h 取样，用 0.2M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）按一定的浸提比 进行浸提 1h，离心得粗酶液。共取样 6 次。 4．分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。 六．实验结果： 1．以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。 2．以氨基态氮浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。 3．以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。 七．思考题 1、测定淀粉酶可采用哪些方法？ 2、比较固态发酵和液态发酵异同点。 实验六 小型连续发酵实验 一．实验目的 0 0 0 培养时间（h） 还原糖 （mg/mL） 培养时间（h） 氨基态氮 （mg/mL） 培养时间（h） 淀粉酶活力 （ IU/g 干培养基 ）
550nm 处测 OD 值 OD1 OD2 OD3 淀粉酶活力（IU/g 干培养基）：本实验条件下，每分钟释放出 1umol 还原糖所需要的酶量称为一 个酶活力单位。 IU/g 干培养基＝ * *1000* * * OD n v k M t 其中：n――稀释倍数；v――浸提比（mL/g 干培养基）； k――斜率；M――葡萄糖的分子量； t――反应时间（10min）；1000――转换系数 五．操作步骤： 1．配制培养基，灭菌，冷却。 2．冷却后接种，并搅拌 均匀，置于 28℃培养箱进行培养。 3．每隔 24h 取样，用 0.2M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）按一定的浸提比 进行浸提 1h，离心得粗酶液。共取样 6 次。 4．分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。 六．实验结果： 1．以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。 2．以氨基态氮浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。 3．以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。 七．思考题 1、测定淀粉酶可采用哪些方法？ 2、比较固态发酵和液态发酵异同点。 实验六 小型连续发酵实验 一．实验目的 0 0 0 培养时间（h） 还原糖 （mg/mL） 培养时间（h） 氨基态氮 （mg/mL） 培养时间（h） 淀粉酶活力 （ IU/g 干培养基 ）