7)将纯化后的 SPDP-PE和SMCC-抗体交联物混合,4℃振荡过夜 8)加入80μ的0.lmMN-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育30min,终止 反应 9)利用 Sephacryl-300柱层析分离纯化PE标记的抗体,用PBS洗脱,收 集第一个洗脱峰。 10)分装,4℃避光保存备用 4.四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.01MPBS (pH80)、DMSO、pH9-9.5的碳酸盐缓冲液(同前)、透析袋、Bio-GelP-6层 析柱等。 (2)操作步骤 1)取1om抗体(6mgm)入透析袋在pH9-95的碳酸盐缓冲液中透析过 夜,将透析后的抗体转移自一小烧杯中。 2)称取四甲基异硫氰酸罗丹明lmg,用DMSO溶解制成浓度为lmgm的 溶液。 3)取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液300u逐滴加入到透析过的抗体溶液 中,室温下避光搅拌2h 4)Bio-GelP6层析柱,用PBS洗脱,收集先流出的红色结合物。 5)分装,4℃避光保存备用 (二)免疫荧光细胞化学染色方法 直接法 (1)染色:给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记 抗体,在室温或37℃孵育30min。染色的整个过程,切片应被放置在湿盒中。 (2)洗片:首先倾倒掉存留的荧光抗体,然后用pH7.2或pH74的0.01M BS洗涤两次,每次5min,最后再用蒸馏水洗去结晶盐。 (3)用50%缓冲(0.5M的磷酸盐缓冲液,pH9~95)甘油封固玻片,镜 检 2.间接法 常用的间接法主要有两种:双层法和夹心法
7）将纯化后的 SPDP-PE 和 SMCC-抗体交联物混合，4℃振荡过夜。 8）加入 80µl 的 0.1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育 30min，终止 反应。 9）利用 Sephacryl S-300 柱层析分离纯化 PE 标记的抗体，用 PBS 洗脱，收 集第一个洗脱峰。 10）分装，4℃避光保存备用。 4．四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.01M PBS （pH 8.0）、DMSO、pH 9-9.5 的碳酸盐缓冲液（同前）、透析袋、Bio-Gel P-6 层 析柱等。 （2）操作步骤 1）取 10ml 抗体（6mg/ml）入透析袋在 pH 9-9.5 的碳酸盐缓冲液中透析过 夜，将透析后的抗体转移自一小烧杯中。 2）称取四甲基异硫氰酸罗丹明 1mg，用 DMSO 溶解制成浓度为 1mg/ml 的 溶液。 3）取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液 300µl 逐滴加入到透析过的抗体溶液 中，室温下避光搅拌 2h。 4）Bio-Gel P-6 层析柱，用 PBS 洗脱，收集先流出的红色结合物。 5）分装，4℃避光保存备用。 （二）免疫荧光细胞化学染色方法 1．直接法 （1）染色：给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记 抗体，在室温或 37℃孵育 30min。染色的整个过程，切片应被放置在湿盒中。 （2）洗片：首先倾倒掉存留的荧光抗体，然后用 pH 7.2 或 pH 7.4 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用蒸馏水洗去结晶盐。 （3）用 50％缓冲（0.5M 的磷酸盐缓冲液，pH 9～9.5）甘油封固玻片，镜 检。 2．间接法 常用的间接法主要有两种：双层法和夹心法
(1)双层法 1)吸取经适当稀释的一抗加在经过固定的组织细胞切(涂、爬)片上,在 染色用的湿盒中37℃孵育30min。 2)用pH72的001MPBS洗涤两次,每次5min,最后再用吸水纸洗去残 留的液体 3)滴加荧光标记的二抗,置于湿盒中37℃孵育30min,再用PBS洗涤两次, 每次5min,用吸水纸吸去残留的液体 4)缓冲甘油封固,镜检 (2)夹心法:是一种用未标记的抗原检测组织或细胞中的抗体的方法 1)滴加经适当稀释的特异性抗原于经过固定的组织细胞切(涂)片上,在 染色用的湿盒中37℃孵育30min 2)用pH72的001MPBS洗涤两次,每次5min,最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 3)滴加可与抗原结合的特异性荧光标记抗体,置于湿盒中37℃孵育30min 4)用pH7.2的001MPBS洗涤两次,每次5min,最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 5)缓冲甘油封镜,镜检。 (三)免疫荧光染色的检测 免疫荧光标记的组织细胞玻片可用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜等 进行检测 四、免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是最常用的免疫细胞化学技术,借助于酶细胞化学技术 而非荧光标记来检测抗原的存在。主要有酶标抗体法和非标记抗体酶法两种主要 形式。 (一)酶标抗体法 1.酶标抗体的制备可用于抗体标记的酶一般应具有以下几点:①酶催化 的底物必须是特异性的,容易被显示,易于在光镜下或电镜下观察;②用于免疫 化学的酶要易于获得,便于商品化和标准化;③在中性pH值时,酶应比较稳定, 标记在抗体上的酶应在1~2年内活性不变;④所形成的终产物沉淀必须稳定
（1）双层法 1）吸取经适当稀释的一抗加在经过固定的组织细胞切（涂、爬）片上，在 染色用的湿盒中 37℃孵育 30min。 2）用 pH 7.2 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 3）滴加荧光标记的二抗，置于湿盒中 37℃孵育 30min，再用 PBS 洗涤两次， 每次 5min，用吸水纸吸去残留的液体。 4）缓冲甘油封固，镜检。 （2）夹心法：是一种用未标记的抗原检测组织或细胞中的抗体的方法。 1）滴加经适当稀释的特异性抗原于经过固定的组织细胞切（涂）片上，在 染色用的湿盒中 37℃孵育 30min。 2）用 pH 7.2 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 3）滴加可与抗原结合的特异性荧光标记抗体，置于湿盒中 37℃孵育 30min。 4）用 pH 7.2 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用吸水纸洗去残 留的液体。 5）缓冲甘油封镜，镜检。 （三）免疫荧光染色的检测 免疫荧光标记的组织细胞玻片可用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜等 进行检测。 四、免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是最常用的免疫细胞化学技术，借助于酶细胞化学技术 而非荧光标记来检测抗原的存在。主要有酶标抗体法和非标记抗体酶法两种主要 形式。 （一）酶标抗体法 1．酶标抗体的制备 可用于抗体标记的酶一般应具有以下几点：①酶催化 的底物必须是特异性的，容易被显示，易于在光镜下或电镜下观察；②用于免疫 化学的酶要易于获得，便于商品化和标准化；③在中性 pH 值时，酶应比较稳定， 标记在抗体上的酶应在 1～2 年内活性不变；④所形成的终产物沉淀必须稳定