《工业微生物学》课程教学资源（课件讲义）第五章 微生物的菌种选育

第五章微生物的菌种选育 现越来越多的抗性菌落,最后甚至可以得到完全纯的抗性菌群体。由此可知,原始的链霉 素敏感菌株只通过(1)→(2)→(4)→(5)→(6)→(8)→(9)→(10)→(12) →.的移种和选择序列,就可在根本未接触链霉素的情况下,筛选出大量的抗链霉素的菌 原始敏 感菌种 不含药物影印 的培养皿接种 2 影印培养 3 含药物的 培养皿 图52.12影印培养试验 影印培养法不仅在微生物遗传理论的研究中有重要的影响,而且在育种实践和其它研 究中均有应用。 以上三个实验充分说明了抗性突变是菌体接触所抗物质以前就已经自发产生了,药物 并不是诱变因素,含药物的环境只起筛选和鉴别抗性菌株的作用。即使不存在链霉素,抗 链霉素的突变株仍然存在 2)基因突变的稀有性 虽然自发突变随时都可能发生,但自发突变发生的频率是很低的。人们把每个细胞在 每一世代中发生某一性状突变的概率称为突变率( Mutation ratio),自发突变率一般在 突变率为105表示细胞繁殖成2×10°细胞时,平均产生一个突变体 3)基因突变的独立性 突变对每个细胞是随机的,对每个基因也是随机的。每个基因的突变是独立的,既不 受其它基因突变的影响,也不会影响其它基因的突变。例如巨大芽孢杆菌(Bac. megaterium) 抗异烟肼的突变率是5×10°,而抗氨基柳酸的突变率是1×10°,对两者双重抗性突变率是 8×100,与两者的乘积相近 4)基因突变的可诱变性 通过人为的诱变剂作用,可以提高菌体的突变率,一般可以将突变率提高10~-105倍。 因为诱变剂仅仅是提高突变率,所以自发突变与诱发突变所获得的突变株并没有本质区别。 5)基因突变的稳定性 因为基因突变的原因是遗传物质的结构发生了变化,所以,突变产生新的变异性状是 稳定的,也是可遗传的

第五章 微生物的菌种选育 16 现越来越多的抗性菌落，最后甚至可以得到完全纯的抗性菌群体。由此可知，原始的链霉 素敏感菌株只通过（1）→（2）→（4）→（5）→（6）→（8）→（9）→（10）→（12） →的移种和选择序列，就可在根本未接触链霉素的情况下，筛选出大量的抗链霉素的菌 株。 图 5.2.12 影印培养试验 影印培养法不仅在微生物遗传理论的研究中有重要的影响，而且在育种实践和其它研 究中均有应用。 以上三个实验充分说明了抗性突变是菌体接触所抗物质以前就已经自发产生了，药物 并不是诱变因素，含药物的环境只起筛选和鉴别抗性菌株的作用。即使不存在链霉素，抗 链霉素的突变株仍然存在。 2) 基因突变的稀有性 虽然自发突变随时都可能发生，但自发突变发生的频率是很低的。人们把每个细胞在 每一世代中发生某一性状突变的概率称为突变率(Mutation ratio)，自发突变率一般在 10–6 10–9 之间。突变率为 108 表示细胞繁殖成 2×108细胞时，平均产生一个突变体。 3)基因突变的独立性 突变对每个细胞是随机的，对每个基因也是随机的。每个基因的突变是独立的，既不 受其它基因突变的影响，也不会影响其它基因的突变。例如巨大芽孢杆菌（Bac.megaterium） 抗异烟肼的突变率是 5×10-5，而抗氨基柳酸的突变率是 1×10-6，对两者双重抗性突变率是 8×10-10，与两者的乘积相近。 4) 基因突变的可诱变性 通过人为的诱变剂作用，可以提高菌体的突变率，一般可以将突变率提高 10105 倍。 因为诱变剂仅仅是提高突变率，所以自发突变与诱发突变所获得的突变株并没有本质区别。 5) 基因突变的稳定性 因为基因突变的原因是遗传物质的结构发生了变化，所以，突变产生新的变异性状是 稳定的，也是可遗传的

第五章微生物的菌种选育 6)基因突变的可逆性 由原始的野生型基因变异成为突变型基因的过程称为正向突变( Forward mutation), 相反的过程称为回复突变( Back mutation或 Reverse mutation)。实验证明,任何遗传性 状都可发生正向突变,也可发生回复突变 5.2.2.4突变机制 突变一般包括染色体数目变化、染色体结构的变化和染色体局部座位内的变化三种情 况 1)染色体数目的变化 生物细胞内染色体数目是恒定的,多一条或少一条都可能引起生物表型的变化。原核 微生物只有一条DNA,若从外源获得一段DNA,且与细胞的部分DNA同源,则称为部分双倍 体。与染色体结构变化同属于染色体畸变( chromosomalaberration)。 2)染色体结构的变化 这是一种大段DN变化(损伤)现象,它包括染色体缺失( deletion)、插入( insertion) 重复( duplication)、倒位( nversIon)和易位( translocation),大段DNA的变化会造成 染色体配对时,形成特定的电子显微镜下可见的结构改变,见图5.2.13 W X Y 图5.2.13几种常见染色体畸变 1.缺失;2.重复;3.倒位;4.易位 3)染色体局部座位内的变化 即基因突变( gene mutation),因为突变只发生在一个基因座位内,所以,又称点突变 ( point mutation)。基因突变可分为碱基置换( substitution)、移码突变( frame- shift mutation)、缺失( deletion)和插入( insertion)四种形式。基因突变与染色体畸变的区别

第五章 微生物的菌种选育 17 6) 基因突变的可逆性 由原始的野生型基因变异成为突变型基因的过程称为正向突变(Forward mutation)， 相反的过程称为回复突变(Back mutation 或 Reverse mutation)。实验证明，任何遗传性 状都可发生正向突变，也可发生回复突变。 5.2.2.4 突变机制 突变一般包括染色体数目变化、染色体结构的变化和染色体局部座位内的变化三种情 况。 1) 染色体数目的变化 生物细胞内染色体数目是恒定的，多一条或少一条都可能引起生物表型的变化。原核 微生物只有一条 DNA，若从外源获得一段 DNA，且与细胞的部分 DNA 同源，则称为部分双倍 体。与染色体结构变化同属于染色体畸变(chromosomalaberration)。 2) 染色体结构的变化 这是一种大段 DNA 变化（损伤）现象，它包括染色体缺失(deletion)、插入（insertion）、 重复 (duplication)、倒位(inversion)和易位(translocation)，大段 DNA 的变化会造成 染色体配对时，形成特定的电子显微镜下可见的结构改变，见图 5.2.13。 图 5.2.13 几种常见染色体畸变 1.缺失；2.重复；3.倒位；4.易位 3) 染色体局部座位内的变化 即基因突变(gene mutation)，因为突变只发生在一个基因座位内，所以，又称点突变 (point mutation)。基因突变可分为碱基置换（substitution）、移码突变(frame-shift mutation)、缺失(deletion)和插入(insertion)四种形式。基因突变与染色体畸变的区别

第五章微生物的菌种选育 在于基因突变仅仅是DNA链中一对或少数几对碱基发生了变化 正常DNA双链中的某一碱基对转变成另一碱基对的现象称为碱基置换(base substitution)。碱基置换又有两种情况:原来链上是嘧啶(或嘌呤)碱基的位置上置换成 另一嘧啶(或嘌呤)碱基则称为转换( transition),若原来链上是嘧啶(或嘌呤)碱基的 位置上置换成另一嘌呤(或嘧啶)碱基则称为颠换( transversa),见图5.2.14。颠换现 象较为少见 c:G--…G:G 双链DNA 单链 DNA 图5.2.14碱基的置换 (实线代表转换;虚线代表颠换) 碱基置换后会出现下列几种情况(见图5.2.15): (1)错义突变使所表达的蛋白质中一种氨基酸的位置上,变成另一种氨基酸 (2)无义突变正常翻译为氨基酸的碱基置换后变成UAG(琥珀突变)、UAA(赫石突变) 或UGA(乳石突变)等终止密码子,造成多肽链合成的中止 (3)同义突变,碱基发生了置换,但由于遗传密码子的简并性,而并没有影响原来的 氨基酸顺序。如密码子GCU置换成GCC后,它们都是丙氨酸的密码子 (4)沉默突变碱基置换造成多肽链中一个氨基酸的改变,但该氨基酸对蛋白质的结 构和功能没有多大的影响,并没引起细胞表型变化。 UAC (眵酪氨酸的密马子 UCC (组氨酸密码子) (终止密码子) (酪氨酸密码子)(丝氨 酸密码子) 错误蛋白质 不完整蛋白质 相同蛋白质结构和功能 基本相同蛋白质 错义突变 无义突变 同义突变 沉默突变 图5.2.15编码蛋白质基因的碱基置换的可能结果 对或少数几对邻接的核苷酸的增加或减少,将造成这一位置以后一系列密码子发生 移位错误的现象称为移码突变( frame- shift mutation)。 移码突变有二种情况(见图5.2.16) (1)如果增加或减少的核苷酸数目为3或3的倍数,那么,它只改变某一部位的一个或几

第五章 微生物的菌种选育 18 在于基因突变仅仅是 DNA 链中一对或少数几对碱基发生了变化。 正常 DNA 双链中的某一碱 基对转变成另一 碱基对的现象称 为碱 基置换(base substitution)。碱基置换又有两种情况：原来链上是嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成 另一嘧啶（或嘌呤）碱基则称为转换（transition），若原来链上是嘧啶（或嘌呤）碱基的 位置上置换成另一嘌呤（或嘧啶）碱基则称为颠换(transversion), 见图 5.2.14。颠换现 象较为少见。 双链 DNA 单链 DNA 图 5.2.14 碱基的置换 （实线代表转换；虚线代表颠换） 碱基置换后会出现下列几种情况（见图 5.2.15）： (1) 错义突变 使所表达的蛋白质中一种氨基酸的位置上，变成另一种氨基酸； (2) 无义突变 正常翻译为氨基酸的碱基置换后变成 UAG（琥珀突变）、UAA（赫石突变） 或 UGA（乳石突变）等终止密码子，造成多肽链合成的中止； (3) 同义突变，碱基发生了置换，但由于遗传密码子的简并性，而并没有影响原来的 氨基酸顺序。如密码子 GCU 置换成 GCC 后，它们都是丙氨酸的密码子； (4) 沉默突变 碱基置换造成多肽链中一个氨基酸的改变，但该氨基酸对蛋白质的结 构和功能没有多大的影响，并没引起细胞表型变化。 图 5.2.15 编码蛋白质基因的碱基置换的可能结果 一对或少数几对邻接的核苷酸的增加或减少，将造成这一位置以后一系列密码子发生 移位错误的现象称为移码突变(frame-shift mutation )。 移码突变有二种情况（见图 5.2.16）： （1）如果增加或减少的核苷酸数目为 3 或 3 的倍数，那么，它只改变某一部位的一个或几 UAC （酪氨酸的密码子） CAC UAG UAU UCC （组氨酸密码子） （终止密码子） （酪氨酸密码子） （丝氨 酸密码子） 错误蛋白质 不完整蛋白质 相同蛋白质 结构和功能 基本相同蛋白质 错义突变 无义突变 同义突变 沉默突变

第五章微生物的菌种选育 个氨基酸,其它氨基酸未变,有可能保持原有的蛋白质性质,这取决于这些氨基酸在蛋白 质中的重要性 (2)如果增加或减少的核苷酸数目不是3或3的倍数,那么,这会改变整个蛋白质的氨基 酸顺序,其影响可能很大 1)正常DNA链上的三联密码子 ABCL ABCIABCI ABCL ABCL ABCI ABCI ABCL ABO 2)第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子: 增添了一个碱基 IABCIABCIAB+CABI CABL CABLCABLCABL CABL. 3)在第二个密码子上缺失一个A后引起的变化 →缺失了一个A lABCIBCAl BCAL BCA BCAL BCAL BCALBCAL BCAL. 4)增添一个碱基和缺失一个碱基后,其后的密码子又恢复正常 增添了一个碱基缺失了一个碱基B. ABCIABCIAB+⊥CAB⊥CAB⊥CAC⊥ABC⊥ABC⊥ABC⊥ 5)增添三个碱基后,只引起一段密码子不正常: 加进了三个碱基 IABCIAB+CAB+CAB+CIABCIABCIABCIABCL. 6如缺失三个碱基,也只引起一段密码子不正常 C B lABCIACAIBCAIBABICACIABCIABCIABCIABCL.. 图5.2.16移码突变及其回复突变 (双线部分代表正常密码子,单线部分表示不正常) 如果一次移码突变后,再发生一次移码突变,则有可能会造成回复突变。 基因座位中的缺失或插入与移码突变只是程度不同,基因突变中的缺失或插入涉及到 的核苷酸数量比移码突变多,很难用移码突变来回复,但与染色体畸变中的缺失或插入相

第五章 微生物的菌种选育 19 个氨基酸，其它氨基酸未变，有可能保持原有的蛋白质性质，这取决于这些氨基酸在蛋白 质中的重要性。 （2）如果增加或减少的核苷酸数目不是 3 或 3 的倍数，那么，这会改变整个蛋白质的氨基 酸顺序，其影响可能很大。 1） 正常 DNA 链上的三联密码子 图 5.2.16 移码突变及其回复突变 （双线部分代表正常密码子，单线部分表示不正常） 如果一次移码突变后，再发生一次移码突变，则有可能会造成回复突变。 基因座位中的缺失或插入与移码突变只是程度不同，基因突变中的缺失或插入涉及到 的核苷酸数量比移码突变多，很难用移码突变来回复，但与染色体畸变中的缺失或插入相 ⎯→ ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC  2）第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子： ⎯⎯增添了一个碱基 ⎯→  ABCABCAB+CAB CAB CAB CAB CAB CAB 3）在第二个密码子上缺失一个 A 后引起的变化： ⎯ →缺失了一个 A ⎯→  ABCBCA BCA BCA BCA BCA BCA BCA BCA 4）增添一个碱基和缺失一个碱基后，其后的密码子又恢复正常： ⎯增添了一个碱基 缺失了一个碱基 B. ⎯→   ABCABCAB+  CAB  CAB  CAC  ABC  ABC  ABC  5）增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常： 加进了三个碱基 ⎯→    ABCAB+CAB+CAB+CABCABCABCABC 6 如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常： B C B ⎯→    ABCACABCABABCACABCABCABCABC

第五章微生物的菌种选育 比,它们所变化的范围要小得多 染色体数目的变化对生物的影响很大,对于微生物来讲,往往是致命的:染色体畸变对微 生物的影响次之。这两种遗传物质的变化都可以通过细胞遗传学的方法,借助显微镜观察 到。而基因座位内的变化,无法通过显微镜观察到,很多情况下,它只造成微生物遗传性 状发生变化,但不会引起菌体死亡,所以,它是诱变选育高产突变菌株的主要机制。 5.2.3自发突变与定向培育 早期人们认为微生物可“驯化”或“驯养”,出现一种“定向培育”技术,即在特定环 境下长期处理某一微生物培养物,同时不断地移种传代,以达到积累和选择合适的自发突 变体的古老的育种方法 由于自发突变的频率较低,变异程度不大,所以,用该法培育新菌种的过程十分缓慢 与后来的诱变育种、杂交育种、尤其是基因工程等育种技术相比,定向培育是一种守株待 兔式的被动育种方法,除某些抗性突变外,其它性状不是无法获得,就是需要相当长时间 才能奏效。 定向培育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗( BCG vaccine)。法国的卡尔密脱 ( Calmette)和介林( erin)把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养 基上,连续传代培养230代,前后经历13年时间,终于在1923年获得显著减毒的结核杆 菌一一卡介苗 早年,巴斯德曾用42℃去培养炭疽杆菌,经过20天后,该菌丧失产芽孢能力。经2-3 月后,菌体进一步失去致病能力,因而可用作活菌苗使用。利用它来接种,在预防牛、羊 的炭疽病方面,曾获得良好的成效。巴斯德也曾将疯狗的唾液注入健康兔子脑中长期传代 “驯化”,制成疫苗,救治狂犬病患者,开创了人类免疫学。当时,人们只是认为微生物与 禽畜一样,长期处在特定环境中是可以被“驯服”的,并没有认识到实际上利用了自发突 变 虽然定向培育作为一种古老而低效的育种方法现已被淘汰,但是人们仍然继续在利用 菌体的自发突变现象。例如从污染噬菌体的发酵液中分离得到抗噬菌体的菌株:又如在酒 精发酵工业中,曾有过一株分生孢子为白色的糖化菌“上酒白种”,就是在原来孢子为黑色 的宇佐美曲霉( Aspergillus usamii)3758发生自发突变后,及时从生产过程中挑选出来 的。这一菌株不仅产生丰富的白色分生孢子,而且糖化率比原来菌株强,培养条件也比原 菌株粗放。这也就是积极的菌种复壮工作 524诱变育种 诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,促进其突变率大幅 度提高,然后采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合育种目的的突变株, 以供生产实践或科学研究用。 当前发酵工业和其他生产单位所使用的高产菌株,几乎都是通过诱变育种而大大提高 了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外,还可达到改善产品质量、扩大品种和简化 生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点,故仍是目前被广泛使 用的主要育种方法之

第五章 微生物的菌种选育 20 比，它们所变化的范围要小得多。 染色体数目的变化对生物的影响很大，对于微生物来讲，往往是致命的；染色体畸变对微 生物的影响次之。这两种遗传物质的变化都可以通过细胞遗传学的方法，借助显微镜观察 到。而基因座位内的变化，无法通过显微镜观察到，很多情况下，它只造成微生物遗传性 状发生变化，但不会引起菌体死亡，所以，它是诱变选育高产突变菌株的主要机制。 5.2.3 自发突变与定向培育 早期人们认为微生物可“驯化”或“驯养”，出现一种“定向培育”技术，即在特定环 境下长期处理某一微生物培养物，同时不断地移种传代，以达到积累和选择合适的自发突 变体的古老的育种方法。 由于自发突变的频率较低，变异程度不大，所以，用该法培育新菌种的过程十分缓慢。 与后来的诱变育种、杂交育种、尤其是基因工程等育种技术相比，定向培育是一种守株待 兔式的被动育种方法，除某些抗性突变外，其它性状不是无法获得，就是需要相当长时间 才能奏效。 定向培育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗(BCG vaccine)。法国的卡尔密脱 （Calmette）和介林（Guerin）把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养 基上，连续传代培养 230 代，前后经历 13 年时间，终于在 1923 年获得显著减毒的结核杆 菌——卡介苗。 早年，巴斯德曾用 42℃去培养炭疽杆菌，经过 20 天后，该菌丧失产芽孢能力。经 2-3 月后，菌体进一步失去致病能力，因而可用作活菌苗使用。利用它来接种，在预防牛、羊 的炭疽病方面，曾获得良好的成效。巴斯德也曾将疯狗的唾液注入健康兔子脑中长期传代 “驯化”，制成疫苗，救治狂犬病患者，开创了人类免疫学。当时，人们只是认为微生物与 禽畜一样，长期处在特定环境中是可以被“驯服”的，并没有认识到实际上利用了自发突 变。 虽然定向培育作为一种古老而低效的育种方法现已被淘汰，但是人们仍然继续在利用 菌体的自发突变现象。例如从污染噬菌体的发酵液中分离得到抗噬菌体的菌株；又如在酒 精发酵工业中，曾有过一株分生孢子为白色的糖化菌“上酒白种”，就是在原来孢子为黑色 的宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）3758 发生自发突变后，及时从生产过程中挑选出来 的。这一菌株不仅产生丰富的白色分生孢子，而且糖化率比原来菌株强，培养条件也比原 菌株粗放。这也就是积极的菌种复壮工作。 5.2.4 诱变育种 诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅 度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株， 以供生产实践或科学研究用。 当前发酵工业和其他生产单位所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高 了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大品种和简化 生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，故仍是目前被广泛使 用的主要育种方法之一