五章微生物的菌种选育 第五章微生物的菌种选育 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键,要使发酵工业产品的种类、产量和质量 有较大的改善,首先必须选育性能优良的生产菌种。理想的工业发酵菌种应符合以下要求 (1)遗传性状稳定 (2)生长速度快,不易被噬菌体等污染; 3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率; (4)目标产物最好能分泌到胞外,以降低产物抑制并利于产物分离; (5)尽可能减少产物类似物的产量,以提高目标产物的产量及利于产物分离 (6)培养基成分简单、来源广、价格低廉 (7)对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感; (8)对溶氧的要求低,便于培养及降低能耗 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育,以及根据遗传学基础理论和方法 人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等 技术。后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位,其中通过分子生物学手段 定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。当然,菌种选育的前提条件是从自然 界获得相应的原始菌种 5.1从自然界中获得新菌种 自然界中微生物资源极其丰富,土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的 主要栖居和生长繁殖场所。微生物种类之多,至今仍是一个难以估测的未知数。从微生物 的营养类型和代谢产物及其能在各种极端环境条件(高热、高压、低温、强碱、强酸及高 渗透压等)下生存的角度分析,微生物种类应大大超过所有动植物之和。随着微生物学研 究工作的不断深入,微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。 新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来,因此必须要有快 速而准确的新种分离和筛选方法。典型的微生物新种分离筛选过程示于图5.11。 从以上表解可知,分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测 定等步骤 5.1.1采样 采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素,确 定具体的时间、环境和目标物。 土壤是微生物的大本营,菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层,常以细菌和放线菌 为主:果园树根土层中,酵母菌含量较高;动植物残体及霉腐土层中,分布着较多的霉菌 此外,豆科植物根系土中,往往存在根瘤菌;河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌;油田 和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。季节、表面的植被、温湿、通风情况、养 分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布,故在采土样时应予以重视。采 土样地点选好后,用小铲子去除表土,取离地面5~15cm处的土样几克,盛于预先灭菌的牛 皮纸袋中扎紧,并标明时间、地点和环境等情况,以备查考
第五章 微生物的菌种选育 1 第五章 微生物的菌种选育 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量 有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。理想的工业发酵菌种应符合以下要求： (1) 遗传性状稳定； (2) 生长速度快，不易被噬菌体等污染； (3) 目标产物的产量尽可能接近理论转化率； (4) 目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离； (5) 尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离； (6) 培养基成分简单、来源广、价格低廉； (7) 对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感； (8) 对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法， 人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等 技术。后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位，其中通过分子生物学手段， 定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。当然，菌种选育的前提条件是从自然 界获得相应的原始菌种。 5.1 从自然界中获得新菌种 自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的 主要栖居和生长繁殖场所。微生物种类之多，至今仍是一个难以估测的未知数。从微生物 的营养类型和代谢产物及其能在各种极端环境条件（高热、高压、低温、强碱、强酸及高 渗透压等）下生存的角度分析，微生物种类应大大超过所有动植物之和。随着微生物学研 究工作的不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。 新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快 速而准确的新种分离和筛选方法。典型的微生物新种分离筛选过程示于图 5.1.1。 从以上表解可知，分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测 定等步骤。 5.1.1 采样 采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确 定具体的时间、环境和目标物。 土壤是微生物的大本营，菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌 为主；果园树根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。 此外，豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田 和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。季节、表面的植被、温湿、通风情况、养 分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以重视。采 土样地点选好后，用小铲子去除表土，取离地面 515cm 处的土样几克，盛于预先灭菌的牛 皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考
第五章微生物的菌种选育 各种水体也是工业微生物菌种的重要来源,许多具有光合作用能力的微生物及兼性或 专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。 调查研究并充分查阅资料 设计试验方案 确定采样的生态环境 屎相 确定特定的增殖条件 匾殖培 确定定性或半定量的快速检测方法 原种斜面 确定发酵的基本条件 初筛(快速检测或一菌株1摇瓶培养测定) 碲迟复筛(一菌株3~5摇瓶) ↓结合初步的工艺条件 再复筛 较优菌株斜面(3~5菌株) 生产性能试验 性能鉴定 毒性试验 菌种鉴定 菌种保藏及作为进一步育种的出发菌株 图5.1.1典型的微生物采样和筛选方法 随着工业的发展,许多人工合成物排入环境中。有证据表明微生物正在“学习”代谢 这些陌生的非天然“营养物”。各种污染物,甚至一些剧毒的污染物都有可能在环境中找到 对应的微生物,如已经分离到了能分解剧毒物氰和腈化物的微生物有诺卡氏菌、腐皮镰孢 霉、木霉、假单胞菌、无色杄菌和产碱菌等14个属,共计49个种。污染源附近的土壤 水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放线菌或真菌等微生物 理想的采样地点。 5.1.2增殖 在采集的样品中,一般待分离的菌种在数量上并不占优势,为提高分离的效率,常以 投其所好和取其所抗的原则在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质,使所需菌种的 数量相对增加,这种方法称为増殖培养或富集培养。其实质是使天然样品中的劣势菌转变
第五章 微生物的菌种选育 2 各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物及兼性或 专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。 图 5.1.1 典型的微生物采样和筛选方法 随着工业的发展，许多人工合成物排入环境中。有证据表明微生物正在“学习”代谢 这些陌生的非天然“营养物”。各种污染物，甚至一些剧毒的污染物都有可能在环境中找到 对应的微生物，如已经分离到了能分解剧毒物氰和腈化物的微生物有诺卡氏菌、腐皮镰孢 霉、木霉、假单胞菌、无色杆菌和产碱菌等 14 个属，共计 49 个种。污染源附近的土壤、 水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放线菌或真菌等微生物 理想的采样地点。 5.1.2 增殖 在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，常以 投其所好和取其所抗的原则在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的 数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。其实质是使天然样品中的劣势菌转变 调查研究并充分查阅资料 设计试验方案 确定采样的生态环境 采样 确定特定的增殖条件 增殖培养 确定定性或半定量的快速检测方法 纯种分离 原种斜面 确定发酵的基本条件 初筛（快速检测或一菌株 1 摇瓶培养测定） 筛选 复筛（一菌株 3~5 摇瓶） 结合初步的工艺条件 再复筛 较优菌株斜面（3~5 菌株） 生产性能试验 性能鉴定 毒性试验 菌种鉴定 菌种保藏及作为进一步育种的出发菌株
五章微生物的菌种选育 为人工环境中的优势菌,便于将它们从样品中分离 5.1.3纯化 增殖培养的结果并不能获得微生物的纯种。即使在增殖培养过程中设置了许多限制因 素,但其它微生物并没有死去,只是数量相对减少。一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖 故增殖后得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物 菌种,必须进行微生物的纯化即纯培养。常用的菌种纯化方法很多,大体可将它们分为 个层次,一个层次较粗放,一般只能达到“菌落纯”的水平,从“种”的水平来说是纯的, 其方法有划线分离法,涂布分离法和稀释分离法。划线分离法简便而快速,即用接种针挑 取微生物样品在固体培养基表面划线,适当条件下培养后,获得单菌落:涂布分离法与划 线法类似,用涂布棒蘸取培养液,或先将少量培养液滴在固体培养基表面,再用涂布棒在 固体培养基表面均匀涂布。稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀,获得纯种的机率较 大。该法是将降至60℃左右的固体培养基与少量培养液(事先在培养液中加入无菌的玻璃 珠搅拌打散细胞团,再经过滤处理,效果更佳。)混匀后,再浇注成平板以获取单菌落。另 层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法。它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。这种 方法的具体操作的方法很多,最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分 离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果遇到不长孢子的丝状菌,则可 用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植,也可用无菌毛细管插入菌丝尖端 以获取单细胞。在具体的工作中,究竟采取哪种方法,应视微生物的实际情况和实验条件 而定 为了提高分离筛选工作的效率,除增殖培养时,应控制增殖条件外,在纯种分离时, 也应控制适宜的培养条件,并选用特异的检出方法和筛选方案 5.1.4性能鉴定 菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以 淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株,它们都具备一些共性,但只有经过进 步的生产性能测定,才能确定哪些菌株更符合生产要求 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上,从自然界直接获得的野生型菌 种往往低产甚至不产所需的产物,只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产 所以,我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌 株 52基因突变和微生物菌种选育 5.2.1遗传的物质基础 在生物体中是否有物质专门行使遗传功能以及究竟何种物质承担此重任,是一个在历 史上争论了很久的问题。十九世纪50年代孟德尔( Gregor Mendel)提出是“因子”( factor) 行使着遗传功能,后来进一步确认因子就是摩尔根( Thomas Hunt Morgan)提出的“基因” (gene),并证明基因在染色体上。但染色体是由蛋白质和核酸等物质所组成的,生物体的 主要物质是蛋白质,但组成蛋白质的有20种氨基酸,它的排列组合方式是个天文数字。而 核酸只是由4种碱基构成的,与蛋白质相比,它的排列方式要简单得多。所以,当时人们
第五章 微生物的菌种选育 3 为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。 5.1.3 纯化 增殖培养的结果并不能获得微生物的纯种。即使在增殖培养过程中设置了许多限制因 素，但其它微生物并没有死去，只是数量相对减少。一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖。 故增殖后得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物 菌种，必须进行微生物的纯化即纯培养。常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为二 个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的， 其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。划线分离法简便而快速，即用接种针挑 取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落；涂布分离法与划 线法类似，用涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒在 固体培养基表面均匀涂布。稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的机率较 大。该法是将降至 60℃左右的固体培养基与少量培养液（事先在培养液中加入无菌的玻璃 珠搅拌打散细胞团，再经过滤处理，效果更佳。）混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。另 一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法。它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。这种 方法的具体操作的方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分 离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可 用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端， 以获取单细胞。在具体的工作中，究竟采取哪种方法，应视微生物的实际情况和实验条件 而定。 为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时，应控制增殖条件外，在纯种分离时， 也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。 5.1.4 性能鉴定 菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以 淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一 步的生产性能测定，才能确定哪些菌株更符合生产要求。 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上，从自然界直接获得的野生型菌 种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。 所以，我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌 株。 5.2 基因突变和微生物菌种选育 5.2.1 遗传的物质基础 在生物体中是否有物质专门行使遗传功能以及究竟何种物质承担此重任，是一个在历 史上争论了很久的问题。十九世纪 50 年代孟德尔(Gregor Mendel)提出是“因子”（factor） 行使着遗传功能，后来进一步确认因子就是摩尔根（Thomas Hunt Morgan）提出的“基因” （gene），并证明基因在染色体上。但染色体是由蛋白质和核酸等物质所组成的，生物体的 主要物质是蛋白质，但组成蛋白质的有 20 种氨基酸，它的排列组合方式是个天文数字。而 核酸只是由 4 种碱基构成的，与蛋白质相比，它的排列方式要简单得多。所以，当时人们
第五章微生物的菌种选育 自然推测只有蛋白质才能担负起复杂的生物遗传重任。直到本世纪40年代,由于先后有 个著名实验的论证,人们才普遍接受核酸才是真正的遗传物质 5.2.1.1遗传物质化学本质的确证 1)肺炎链球菌转化实验 8 = RⅡ型活菌 健康 健康 ② 健康 病死 SⅢ型活菌 健康 健康 SⅢ型加热杀死 8 健康 疠死 RI型活菌 病死 8 混合培养 DNA分离 SⅢ型活菌 图5.2.1肺炎链球菌的转化现象 肺炎链球菌( Streptococcus pneumoniae),旧称肺炎双球菌( Diplococcus pneumoniae) 的菌体外有多糖的荚膜包围,它对菌体有保护作用,这种含有荚膜的菌株称为光滑型 ( Smooth,即S型),它可使人患肺炎,也可使小鼠患败血症而死亡,另有一类肺炎双球菌 的突变菌株,没有荚膜保护,称为粗糙型( Rough,即R型),它在动物体内易被吞噬细胞 吞噬,对动物不具毒力,不能杀死小鼠。1928年,英国医生格里菲斯( Griffith)发现将
第五章 微生物的菌种选育 4 自然推测只有蛋白质才能担负起复杂的生物遗传重任。直到本世纪 40 年代，由于先后有三 个著名实验的论证，人们才普遍接受核酸才是真正的遗传物质。 5.2.1.1 遗传物质化学本质的确证 1) 肺炎链球菌转化实验 图 5.2.1 肺炎链球菌的转化现象 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）,旧称肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae） 的菌体外有多糖的荚膜包围，它对菌体有保护作用，这种含有荚膜的菌株称为光滑型 （Smooth，即 S 型），它可使人患肺炎，也可使小鼠患败血症而死亡，另有一类肺炎双球菌 的突变菌株，没有荚膜保护，称为粗糙型（Rough，即 R 型），它在动物体内易被吞噬细胞 吞噬，对动物不具毒力，不能杀死小鼠。1928 年，英国医生格里菲斯（Griffith）发现将
五章微生物的菌种选育 血清ⅠI型的R型肺炎双球菌菌株与经加热杀死的血清II型的S型菌株混合后,注射小鼠, 能毒死小鼠,并从死鼠血中可以分离到血清II型的S型菌株。这现象被认为是血清ⅠI 型的S型菌株使Ⅰ型R型菌株发生了转化( Transformation)。就是说血清I型的R型菌 株从己被杀死的血清III型的S型菌株中获得了遗传物质,见图5.2.1。 1944年艾弗里( Avery)证实了转化现象的化学本质。他将S型菌株中的蛋白质、核酸 和荚膜等成分分离纯化后,分别再与R型菌株混合,发现只有DNA才能使R型菌株转化成S 型菌株,分别用蛋白酶和核酸酶处理转化因子,进一步证实转化现象与蛋白质、荚膜多糖 和RNA无关,只与DM有关,而且DNMA纯度越高,转化效率也越高。其结果见表5.2.1。另 外,经元素分析、血清学分析和一系列物理特性(如超速离心、电泳、紫外吸收)等测定 的结果也证明DNA是遗传信息载体。DNA的转化效率是非常高的,已知其最低作用浓度为 1×10°μg/m1,这是目前任何化学方法都无法检出的浓度。 表5.2.1.肺炎链球菌S型菌株的细胞成分转化R型菌株(活)试验 田胞组分 处理条件 S菌的DNA 未处理 长出S型菌株 S菌的DNA 蛋白酶等(除DNA酶) 长出S型菌株 S菌的DNA NA酶 只长出R型菌株 S菌的RNA 未处理 只长出R型菌株 S菌的蛋白质 未处理 只长出R型菌株 S菌的荚膜多糖 未处理 只长出R型菌株
第五章 微生物的菌种选育 5 血清 II 型的 R 型肺炎双球菌菌株与经加热杀死的血清 III 型的 S 型菌株混合后，注射小鼠， 能毒死小鼠，并从死鼠血中可以分离到血清 III 型的 S 型菌株。这现象被认为是血清 III 型的 S 型菌株使 II 型 R 型菌株发生了转化(Transformation)。就是说血清 II 型的 R 型菌 株从已被杀死的血清 III 型的 S 型菌株中获得了遗传物质，见图 5.2.1。 1944 年艾弗里（Avery）证实了转化现象的化学本质。他将 S 型菌株中的蛋白质、核酸 和荚膜等成分分离纯化后，分别再与 R 型菌株混合，发现只有 DNA 才能使 R 型菌株转化成 S 型菌株，分别用蛋白酶和核酸酶处理转化因子，进一步证实转化现象与蛋白质、荚膜多糖 和 RNA 无关，只与 DNA 有关，而且 DNA 纯度越高，转化效率也越高。其结果见表 5.2.1。另 外，经元素分析、血清学分析和一系列物理特性（如超速离心、电泳、紫外吸收）等测定 的结果也证明 DNA 是遗传信息载体。DNA 的转化效率是非常高的，已知其最低作用浓度为 110-5μg/ml，这是目前任何化学方法都无法检出的浓度。 表 5.2.1. 肺炎链球菌 S 型菌株的细胞成分转化 R 型菌株（活）试验 细胞组分 处理条件 结果 S 菌的 DNA S 菌的 DNA S 菌的 DNA S 菌的 RNA S 菌的蛋白质 S 菌的荚膜多糖 未处理 蛋白酶等（除 DNA 酶） DNA 酶 未处理 未处理 未处理 长出 S 型菌株 长出 S 型菌株 只长出 R 型菌株 只长出 R 型菌株 只长出 R 型菌株 只长出 R 型菌株