第十一章微生物和基因工程 11.1概述 自从分子生物学家发现所有生物的遗传信息都是由DNA分子携带并发现了基因的密码 后,人们就一直致力于将分子生物学的这一划时代成果用于微生物细胞的改造,使得微生物 细胞能够结累更多的目标产物、合成新的代谢产物及转化原本不能转化的底物或有毒物质 通过科学家们的不懈努力,基因工程已经成了工业微生物菌种选育的重要手段,正在发酵工 业中发挥愈来愈大的作用。可以说工业微生物遗传育种取得的重要进展是基因工程发展的基 础之一,现在又为工业微生物的育种提供了新的、有力的工具。两者始终存在着十分密切的 依赖关系。 基因克隆是重组DNA技术的关键步骤。这里,基因定义为细胞的染色体中含有遗传信 息的基本单元。在对基因进行操纵之前,必须对DNA分子的脱氧核糖核酸顺序、各个结构单 元的功能及其相互关系有一个清楚的认识,即所谓的基因组。目前,许多微生物、植物、动 物及人类基因组计划已经完成或即将完成,怎样利用从基因组中获得的大量信息为人类服务 已经成了生物技术的重要研究内容和发展方向。但是这些基因组、特别是人类基因组太复杂, 很难讲清楚其功能和组织。因此本章将只讨论最简单的基因组为例对DNA分子的核苷序列分 析和结构基因的获得进行简要讨论 早在1978年猴子病毒SV40的DNA分子的核苷序列就已经完全清楚,它有5,243个碱基 对,这些碱基对构成了五个结构基因。限制性内切酶( Restriction endonuclease)对基因序 列分析作出了巨大的贡献,限制性内切酶是一类从细菌中分离得到的能够将DNA分子在特定 的位点进行切断的酶。限制性内切酶的功能是将一个很大的DNA分子切割成许多良好定义的 碎片,以便进一步研究。目前已经从约250种细菌中提纯出了500余种限制性内切酶。其中 典型的如从大肠杆菌得到的EORI,专门作用于 GAATTC核苷序列:又如从白色短小杆菌 ( BrevibacteriⅧ m albidum)得到的BaII则专门切断 TGGCCA核苷序列 限制性内切酶切断双股DNA分子时有如图11.1.1所示的两种方式: TGGCCA GAATTC ACCGGT CTTAAG TGG CCA AATTC ACC CTTAAG 图1.1限制性内切酶的两种切断方式:(a)平端,(b)粘性末端 1)沿对称线切断形成两个平端分子(图11.1.1a 2)在对称线附近沿对称位置切断形成两个含粘性末端( Sticky ends)的分子(图 11.11b)。这种方式都在重组DNA技术中使用 限制性内切酶的类型和主要特性列于表11.1.1,其它在重组DNA中常用的核酸酶见表 11.1.2 由于限制性内切酶所能识别的核苷序列是唯一的,因此在一个DNA分子中的切割位点 有限。被切割下来的DNA碎片的分离时需要应用一项非常有用的技术:凝胶电泳。然后就能 进一步研究每个DNA碎片的结构和功能。利用不同的限制性内切酶反复进行上述过程,就能
1 第十一章 微生物和基因工程 11.1 概述 自从分子生物学家发现所有生物的遗传信息都是由 DNA 分子携带并发现了基因的密码 后，人们就一直致力于将分子生物学的这一划时代成果用于微生物细胞的改造，使得微生物 细胞能够结累更多的目标产物、合成新的代谢产物及转化原本不能转化的底物或有毒物质。 通过科学家们的不懈努力，基因工程已经成了工业微生物菌种选育的重要手段，正在发酵工 业中发挥愈来愈大的作用。可以说工业微生物遗传育种取得的重要进展是基因工程发展的基 础之一，现在又为工业微生物的育种提供了新的、有力的工具。两者始终存在着十分密切的 依赖关系。 基因克隆是重组 DNA 技术的关键步骤。这里，基因定义为细胞的染色体中含有遗传信 息的基本单元。在对基因进行操纵之前，必须对 DNA 分子的脱氧核糖核酸顺序、各个结构单 元的功能及其相互关系有一个清楚的认识，即所谓的基因组。目前，许多微生物、植物、动 物及人类基因组计划已经完成或即将完成，怎样利用从基因组中获得的大量信息为人类服务 已经成了生物技术的重要研究内容和发展方向。但是这些基因组、特别是人类基因组太复杂， 很难讲清楚其功能和组织。因此本章将只讨论最简单的基因组为例对 DNA 分子的核苷序列分 析和结构基因的获得进行简要讨论。 早在 1978 年猴子病毒 SV40 的 DNA 分子的核苷序列就已经完全清楚，它有 5,243 个碱基 对，这些碱基对构成了五个结构基因。限制性内切酶(Restriction endonuclease)对基因序 列分析作出了巨大的贡献，限制性内切酶是一类从细菌中分离得到的能够将 DNA 分子在特定 的位点进行切断的酶。限制性内切酶的功能是将一个很大的 DNA 分子切割成许多良好定义的 碎片，以便进一步研究。目前已经从约 250 种细菌中提纯出了 500 余种限制性内切酶。其中 典型的如从大肠杆菌得到的 EcoRI，专门作用于 GAATTC 核苷序列；又如从白色短小杆菌 (Brevibacterium albidum)得到的 BalI 则专门切断 TGGCCA 核苷序列。 限制性内切酶切断双股 DNA 分子时有如图 11.1.1 所示的两种方式: 1） 沿对称线切断形成两个平端分子（图 11.1.1a）。 2） 在对称线附近沿对称位置切断形成两个含粘性末端(Sticky ends)的分子（图 11.1.1b）。这种方式都在重组 DNA 技术中使用。 限制性内切酶的类型和主要特性列于表 11.1.1，其它在重组 DNA 中常用的核酸酶见表 11.1.2。 由于限制性内切酶所能识别的核苷序列是唯一的，因此在一个 DNA 分子中的切割位点 有限。被切割下来的 DNA 碎片的分离时需要应用一项非常有用的技术：凝胶电泳。然后就能 进一步研究每个 DNA 碎片的结构和功能。利用不同的限制性内切酶反复进行上述过程，就能 T G G C C A G A A T T C A C C G G T C T T A A G T G G C C A G A A T T C A C C G G T C T T A A G (a) (b) 图 11.1.1 限制性内切酶的两种切断方式：(a)平端，(b)粘性末端
够最终确定DNA分子的核苷序列和鉴别它所包含的结构基因。现在已经有了全自动DNA测序 仪,利用这类仪器可以大大提高核苷序列分析的速度。此外现在已经建立了各种基因库,将 分析得到基因核苷序列与基因库中已知结构基因的核苷序列进行比较就能够确定该基因是 那一种结构基因或者是新发现的基因。 表11.1.1核酸内切限制酶的类型和主要特性 识别序列 同裂酶 同尾酶 切割位点数目 λSv40|pBR322 Aval C√ PyCGPu 80 BamHI GGATCC BstI Bcll, BglII, Mbol,5 1 Sau3A. Holi BclI TlGATCA BamHI, BglII, Mbol, 7 10 Sau3a. Holi BgIII ALGATC BamHI,BclIl, Mbol, 6 Sau3A, holi Clal AT LCGAT Accl, Acyl, AsIL, 150 Hpall, taql ECoRI EcoRII JCC(A/C)GG Atul, ApyI >35166 Haelll cIcC BspRI, SurI >5019 Hgal GACGC (N) >50|0 11 TGCG(N)10 FnudIIl, HinPI HincIi TPy HindII Hind GTPyPuAC HincII, HinJCI 2 HindIIIAAGCTT 6 HinfI GVANTC FueL >5010 10 Hpal GTT AAC 134 0 Hpall CVCO GG Haply, mol Accl, Acyl, AsulI >504 12 Clal, taql HphI GTGA(N) >504 ↓ CCACT(N) KpnI gGTACLC BamHI, Bcll, BglIl, 21 0 KholI Mbol IDpnI, Sau3AI 508 PstI CTGCAG I SalPI, SfII 1821 Pull CAGVCTG 153 SacII CcCG CscI. SstII >25 Sall GVTCGAC HgiCIII,HgiDIIAval,XhoI 100 Sau3A CATO ChoI BamHI, Bcll, BglIl, >508 22 bol, Holi CCCVGGG Xmal 0 0 gagCtJO Sact 2|0 0 bal TVCTAGA 0 Khol C√ TCGAG I Blul, PaeR7I Aval, Sall 10 ClCCGGG Aval 000
2 够最终确定 DNA 分子的核苷序列和鉴别它所包含的结构基因。现在已经有了全自动 DNA 测序 仪，利用这类仪器可以大大提高核苷序列分析的速度。此外现在已经建立了各种基因库，将 分析得到基因核苷序列与基因库中已知结构基因的核苷序列进行比较就能够确定该基因是 那一种结构基因或者是新发现的基因。 表 11.1.1 核酸内切限制酶的类型和主要特性 酶 识别序列 同裂酶 同尾酶 切割位点数目 SV40 pBR322 Aval CPyCGPuG SalI,XhoI,XmaI 8 0 1 BamHI GGATCC BstI BclI,BglII,MboI, Sau3A,XhoII 5 1 1 BclI TGATCA BamHI,BglII,MboI, Sau3A,XhoII 7 1 0 BglII AGATCT BamHI,BclII,MboI, Sau3A,XhoII 6 0 0 ClaI ATCGAT AccI,AcyI,AsYII, HpaII,TaqI 15 0 1 EcoRI GAATTC 5 1 1 EcoRII CC(A/C)GG AtuI,ApyI >35 16 6 HaeIII GCCC BspRI,BsuRI >50 19 22 HgaI GACGC(N)5 CTGCG(N)10 >50 0 11 HhaI GCGC FnuDIII,HinPI >50 2 31 HincII CTPyPuAC HindII 34 7 2 HindII GTPyPuAC HincII,HinJCI 34 7 2 HindIII AAGCTT HsuI 6 6 1 HinfI GANTC FnuAI >50 10 10 HpaI GTTAAC 13 4 0 HpaII CCGG HapII,MnoI AccI,AcyI,AsuII, ClaI,TaqI >50 4 12 HphI GGTGA(N)6 CCACT(N)7 >50 4 12 KpnI GGTACC BamHI,BclI,BglII, XhoII 2 1 0 MboI GATC DpnI,Sau3AI >50 8 22 PstI CTGCAG SalPI,SfII 18 2 1 PvuII CAGCTG 15 3 1 SacII CCGCGC CscI,SstII >25 0 0 SalI GTCGAC HgiCIII,HgiDII AvaI,XhoI 1 0 0 Sau3A GATC MhoI BamHI,BclI,BglII, boI,XhoII >50 8 22 SmaI CCCGGG XmaI 3 0 0 SstI GAGCTC SacI 2 0 0 XbaI TCTAGA 1 0 0 XhoI CTCGAG BluI,PaeR7I AvaI,SalI 1 0 0 XmaI CCCGGG SmaI AvaI 3 0 0
表11.1.2重组DNA常用的核酸藤 核酸藤名称 主要功能 ⅡI型核酸内切限制酶「在特异性碱基序列部位切割DNA分子 DNA连接酶 将两条DNA分子或片段连接成一个DNA分 大肠杆菌DN聚合酶I通过向3’-端逐一增加核苷酸,填补 反(逆)转录酶 多核苷酸激酶 把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5-0H末端 末端转移酶 将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3-0H末端 核酸外切酶III 从一条DNA链的3-端移去核苷酸残基 D核酸外切酶 自双链DNA分子的5-端移走单核苷酸,暴露出延伸的单链3-端 或性磷酸酶 人DNA分子的5’-端或3’-端或同时从5-和3’-端移去末端磷酸 S1核酸酶 将RNA和单链DMNA降解成5-单核苷酸,或切割双链核苷酸单链区 Bal31核酸酶 有单链特异的核酸内切酶特性,也有双链特异的核酸外切酶活性 Tag DNA聚合酶 在高温下一单链DNA为模板按5→3方向合成新生互补链 无论是细菌DNA还是哺乳动物的DNA,它们在结构上都是相容的,因此从一种机体得到 的DNA分子片断可以很容易地与来自另一种机体的DNA混合。这种类似性可以推广到质粒 ( Plasmids)。质粒是环状双股DNA分子,许多细菌中都有这种存在于染色体外的遗传物质 在重组DNA技术中,质粒在基因工程中的作用是作为载体DNA( Vector)。 EcoR14361Hind Ill 29 Fco57405 Aat|:286 EcoR V 185 Ban il 4 Nhe 1 229 Xmn 3963 sp BamH1 375 ph562 Hinc 1i 3907 Sca 13846 EcoN 1 622 Pyu I 373 sa651 Pst I 3609 Ase13539 Ppa I 3435 Eag I939 Nru I 972 PM/M 1 1315 smI1353 HgiE ll 3056 Eco5713002 Ava I 1425 ppm 11438 Ba144Da11447 AIwN I 2886 PpuM I 1 BspM I 1664 Pyu l 2066 Nde|2297 Tth111I2219 HgE!2295 Xca 1 2246 ACc I 2246 图11.1.2pBR322质粒酶切图谱
3 表 11.1.2 重组 DNA 常用的核酸酶 核酸酶名称 主要功能 II 型核酸内切限制酶 在特异性碱基序列部位切割 DNA 分子 DNA 连接酶 将两条 DNA 分子或片段连接成一个 DNA 分子 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 通过向 3’-端逐一增加核苷酸，填补双链 DNA 分子上的单链缺口 反（逆）转录酶 以 RNA 分子为模板合成互补的 cDNA 多核苷酸激酶 把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 5’-OH 末端 末端转移酶 将同聚物尾巴加到线性双链或单链 DNA 分子的 3’-OH 末端 核酸外切酶 III 从一条 DNA 链的 3’-端移去核苷酸残基 核酸外切酶 自双链 DNA 分子的 5’-端移走单核苷酸，暴露出延伸的单链 3’-端 碱性磷酸酶 从 DNA 分子的 5’-端或 3’-端或同时从 5’-和 3’-端移去末端磷酸 S1 核酸酶 将 RNA 和单链 DNA 降解成 5’-单核苷酸，或切割双链核苷酸单链区 Bal31 核酸酶 有单链特异的核酸内切酶特性，也有双链特异的核酸外切酶活性 Tag DNA 聚合酶 在高温下一单链 DNA 为模板按 5’→3’方向合成新生互补链 无论是细菌 DNA 还是哺乳动物的 DNA，它们在结构上都是相容的，因此从一种机体得到 的 DNA 分子片断可以很容易地与来自另一种机体的 DNA 混合。这种类似性可以推广到质粒 (Plasmids)。质粒是环状双股 DNA 分子，许多细菌中都有这种存在于染色体外的遗传物质。 在重组 DNA 技术中，质粒在基因工程中的作用是作为载体 DNA(Vector)。 图 11.1.2 pBR322 质粒酶切图谱
图11.1.2所示是基因工程中广泛使用的载体DNA,pBR322。该载体有4,363个碱基对, 编码是从唯一的 EcoRI位点开始,将 GAATTC序列中的第一个T编码为1。图中显示了各种 酶切位点,其中黑体字表示唯一的酶切位点,其它则有两个酶切位点。图中还显示该质粒中 含有氨苄青霉素(Ap)和四环素(Tc)两种抗性标记 基因工程微生物的构建包括如下基本步骤(图11.1.3):1)用限制性内切酶对质粒的特 定位点进行切割,形成粘性末端:2)用同样的限制性内切酶对含有目标基因的外源DNA分 子进行切割,两端形成与质粒上的粘性末端互补的单链;3)将切割好的质粒和基因片段混 合并通过DMA连接酶键合在一起完成基因重组并重新成为环状分子;4)将重组质粒转化到 微生物细胞内。 细胞经基因工程改造后能够生产两大类产物:蛋白质和非蛋白质。微生物的DNA分子 与高等生物比要简单得多,特别是原核生物(如大肠杆菌),它们甚至没有细胞核,对外源 的质粒有很好的相容性,同时还具有培养基简单、生长速率快等优点,因此是进行基因工程 研究并应用于工业生产的首选宿主细胞 DNA 供体 载体 ○○○ 限制性酶 (1)得到所需基因,重组 基因片段 供体和载体DNA (2).将重组DNA传递入宿主细胞 (3).确认宿主细胞含有所需的重组DNA (4).基因表达并生产该基因所编码的蛋白质 图11.1.3基因工程的基本步骤:将基因从一个有机体传递到另一有机体 11.2基因传递和重排的自然机制 在微生物细胞中有一个完善的体系防止DNA的复制错误并修复受到损伤的DNA分子
4 图 11.1.2 所示是基因工程中广泛使用的载体 DNA,pBR322。该载体有 4,363 个碱基对， 编码是从唯一的 EcoRI 位点开始，将 GAATTC 序列中的第一个 T 编码为 1。图中显示了各种 酶切位点，其中黑体字表示唯一的酶切位点，其它则有两个酶切位点。图中还显示该质粒中 含有氨苄青霉素(Ap)和四环素(Tc)两种抗性标记。 基因工程微生物的构建包括如下基本步骤(图 11.1.3)：1）用限制性内切酶对质粒的特 定位点进行切割，形成粘性末端；2）用同样的限制性内切酶对含有目标基因的外源 DNA 分 子进行切割，两端形成与质粒上的粘性末端互补的单链；3）将切割好的质粒和基因片段混 合并通过 DNA 连接酶键合在一起完成基因重组并重新成为环状分子；4）将重组质粒转化到 微生物细胞内。 细胞经基因工程改造后能够生产两大类产物：蛋白质和非蛋白质。微生物的 DNA 分子 与高等生物比要简单得多，特别是原核生物（如大肠杆菌），它们甚至没有细胞核，对外源 的质粒有很好的相容性，同时还具有培养基简单、生长速率快等优点，因此是进行基因工程 研究并应用于工业生产的首选宿主细胞。 图 11.1.3 基因工程的基本步骤：将基因从一个有机体传递到另一有机体 11.2 基因传递和重排的自然机制 在微生物细胞中有一个完善的体系防止 DNA 的复制错误并修复受到损伤的 DNA 分子。 DNA DNA 供体 工 载体 克隆 限制性酶 （1）．得到所需基因，重组 基因片段 供体和载体 DNA （2）．将重组 DNA 传递入宿主细胞 （3）．确认宿主细胞含有所需的重组 DNA （4）．基因表达并生产该基因所编码的蛋白质
即使如此,在自然界中由于各种物理和化学因素的影响,如温度、pH、压力、离子强度、各 种化学物质、光及射线等,微生物细胞的基因会发生点突变、缺失突变、插入突变及抑制突 变等。这些物理和化学因素也经常用于传统的诱变育种 生态系统中共存的各种微生物之间会发生基因从一个有机体向另一个转移,使微生物 获得外源基因,第五章介绍的转化( Transformation)、转导( Transduction)和接合作用 ( Con jugation)等就能实现自然的基因重组 另一种与上述现象密切相关而且具有重要意义的现象是细胞内基因的重排,称为易位 子( Transposon)。易位子是一个或几个基因,具有从某一DNA分子“跳跃”到另一个DNA 分子、或在同一DNA分子内跳跃到另一位置的能力。易位子将其本身整合到新位置的能力与 受体DNA的同源性无关,其功能也不是为了编码蛋白质。当一个基因的两端与插入基因片段 联接时经常会出现易位子。许多易位子具有编码抗生素抗性的能力 易位子的重要功能是:1)当易位子装入一个基因中间时会诱导基因突变;2)易位子 能够将两个本来分开的基因带到一起:3)与质粒或者病毒引起的基因传递过程相结合,易 位子能够传递无关细菌之间基因的移动(例如,多抗生素抗性基因在新构建质粒中的移动)。 易位子突变是改变细胞性质非常有用的工具 上述基因传递方法虽然在自然界发生的频率不高,但是提供了将基因从一个细胞传递到另 个细胞的基本方法,也为进一步改善并发展新的基因传递过程创造了条件,是重组DNA技术 的重要基础 11.3基因工程的基本要素 基因工程是一些工具或要素的综合,至今基因工程仍没有一个非常精确的定义。一般 认为,基因工程是通过细胞外操纵DNA分子,根据预先设计的控制因素,创造出人工基因或 新的基因组合 基因工程的基本方法如图11.3.1所示,包括:分离所需要的基因、基因重组、将重组 的基因转移到宿主细胞及重组基因在宿主细胞中的增殖等步骤 11.3.1目标基因的获得 基因工程的第一步是获得所需要的目标基因。一种最直接的方法是采用鸟枪法 ( Shotgun- cloning)。应用限制性酶将供体DNA切割成许多基因片段,然后,将这些基因 片段用凝胶电泳分离后任意克隆到大量的宿主细胞中,通常需要根据目标基因的某一特性建 立一种高效的筛选方法用于鉴别含有目标基因的宿主细胞。显然这种方法的工作量很大而效 率很低,现在已经很少采用 杂交方法具有较好的专一性。首先需要化学合成与目标基因的一部分互补的基因探针, 基因探针要比基因本身短得多,但是应该有足够的长度,这样就不会与其他DNA的序列互补。 因此,在设计基因探针前,至少应该知道目标基因的部分核苷序列或该基因所编码蛋白质的 部分氨基酸序列。由于基因密码具有兼并性,很难从蛋白质的氨基酸序列推演出真正的核苷 酸序列,因此需要设计多种探针。同时还需要将供体DNA分解为基因片段并分离成为单股 DNA,这样才能够与单链的探针反应 细菌作为宿主细胞具有生长速度快、培养简单而且成本低廉的优点,因此细菌是基因 工程首选的宿主细胞。但是对于哪些具有基因内区( Intron)的真核生物基因,由于细菌细胞 内没有将基因内区切割下来的功能,也不能进行mRNA的拼接,因此具有基因内区的真核生 物基因不能直接放到细菌中,即使转移进去了也不能表达所需要的蛋白质。为此可以从基因 供体微生物的细胞质中用杂交探针方法将对应于所需基因的mRNA分离出来,然后就可以应 用逆转录酶( Reverse transcriptase)合成具有对应核苷序列的DNA分子,这种DNA分子
5 即使如此，在自然界中由于各种物理和化学因素的影响，如温度、pH、压力、离子强度、各 种化学物质、光及射线等，微生物细胞的基因会发生点突变、缺失突变、插入突变及抑制突 变等。这些物理和化学因素也经常用于传统的诱变育种 生态系统中共存的各种微生物之间会发生基因从一个有机体向另一个转移，使微生物 获得外源基因，第五章介绍的转化（Transformation）、转导（Transduction）和接合作用 （Conjugation）等就能实现自然的基因重组。 另一种与上述现象密切相关而且具有重要意义的现象是细胞内基因的重排，称为易位 子（Transposon）。易位子是一个或几个基因，具有从某一 DNA 分子 “跳跃”到另一个 DNA 分子、或在同一 DNA 分子内跳跃到另一位置的能力。易位子将其本身整合到新位置的能力与 受体 DNA 的同源性无关，其功能也不是为了编码蛋白质。当一个基因的两端与插入基因片段 联接时经常会出现易位子。许多易位子具有编码抗生素抗性的能力。 易位子的重要功能是：1）当易位子装入一个基因中间时会诱导基因突变；2）易位子 能够将两个本来分开的基因带到一起；3）与质粒或者病毒引起的基因传递过程相结合，易 位子能够传递无关细菌之间基因的移动（例如，多抗生素抗性基因在新构建质粒中的移动）。 易位子突变是改变细胞性质非常有用的工具。 上述基因传递方法虽然在自然界发生的频率不高，但是提供了将基因从一个细胞传递到另一 个细胞的基本方法，也为进一步改善并发展新的基因传递过程创造了条件，是重组 DNA 技术 的重要基础。 11.3 基因工程的基本要素 基因工程是一些工具或要素的综合，至今基因工程仍没有一个非常精确的定义。一般 认为，基因工程是通过细胞外操纵 DNA 分子，根据预先设计的控制因素，创造出人工基因或 新的基因组合。 基因工程的基本方法如图 11.3.1 所示，包括：分离所需要的基因、基因重组、将重组 的基因转移到宿主细胞及重组基因在宿主细胞中的增殖等步骤。 11.3.1 目标基因的获得 基因工程的第一步是获得所需要的目标基因。一种最直接的方法是采用鸟枪法 （Shotgun-cloning）。应用限制性酶将供体 DNA 切割成许多基因片段，然后，将这些基因 片段用凝胶电泳分离后任意克隆到大量的宿主细胞中，通常需要根据目标基因的某一特性建 立一种高效的筛选方法用于鉴别含有目标基因的宿主细胞。显然这种方法的工作量很大而效 率很低，现在已经很少采用。 杂交方法具有较好的专一性。首先需要化学合成与目标基因的一部分互补的基因探针， 基因探针要比基因本身短得多，但是应该有足够的长度，这样就不会与其他 DNA 的序列互补。 因此，在设计基因探针前，至少应该知道目标基因的部分核苷序列或该基因所编码蛋白质的 部分氨基酸序列。由于基因密码具有兼并性，很难从蛋白质的氨基酸序列推演出真正的核苷 酸序列，因此需要设计多种探针。同时还需要将供体 DNA 分解为基因片段并分离成为单股 DNA，这样才能够与单链的探针反应。 细菌作为宿主细胞具有生长速度快、培养简单而且成本低廉的优点，因此细菌是基因 工程首选的宿主细胞。但是对于哪些具有基因内区(Intron)的真核生物基因，由于细菌细胞 内没有将基因内区切割下来的功能，也不能进行 mRNA 的拼接，因此具有基因内区的真核生 物基因不能直接放到细菌中，即使转移进去了也不能表达所需要的蛋白质。为此可以从基因 供体微生物的细胞质中用杂交探针方法将对应于所需基因的 mRNA 分离出来，然后就可以应 用逆转录酶（Reverse transcriptase）合成具有对应核苷序列的 DNA 分子，这种 DNA 分子