第五章微生物的菌种选育 根据突变造成遗传物质改变的范围,可以将突变分为染色体畸变和基因突变,但它们 本质上都造成了基因的突变,所以,都可以广义地理解成基因突变。 5.22.1突变现象 从突变的表现型可将突变分为形态突变、生化突变、致死突变和条件致死突变四类: 1)形态突变型指突变的菌体发生形态可见的变化。如细胞大小、形状、鞭毛、纤毛、孢 子、芽孢、荚膜,以及群体形态结构(菌落和噬菌斑等)的改变 2)生化突变型指突变的菌体原有特定的生化功能发生改变或丧失,但在形态上不一定有 可见的变化,通过生化方法可以检测到。如菌体对底物(糖、纤维素及烃等)的利用能力 对营养物(氨基酸、维生素及碱基等)的需求、对过量代谢产物或代谢产物结构类似物的 耐性以及对抗药性发生的变化。另外,它也包括细胞成分尤其是细胞表面成分(细胞壁、 荚膜及鞭毛等)的细微变异而引起抗原性变化的突变 生化突变对于发酵工业生产具有重大意义。例如:很多氨基酸和核苷酸生产菌就是 些营养缺陷型的突变菌株,或是对某些代谢产物及其结构类似物的抗性菌株:对青霉素或 链霉素等药物的抗性菌株,可改善发酵的管理,并可作为遗传标记以便于育种工作中的筛 选和鉴别。 3)致死突变型突变造成菌体死亡或生活能力下降。致死突变若是隐性基因决定的,那么 双倍体生物能够以杂合子的形式存活下来,一旦形成纯合子,则发生死亡。 4)条件致死突变型突变后的菌体在某些条件下,可以生存,但在另一些条件下则发生死 亡。温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型。有些菌体发生突变后对温度变得敏感了 在较窄的温度范围内才能存活,超出此温度范围则死亡。其原因是有些酶蛋白(DNA聚合酶, 氨基酸活化酶等)肽链中的几个氨基酸被更换,从而降低了原有的抗热性。如有些大肠杆 菌突变菌株能在37℃下生长,但不能在42℃下生长:噬菌体T的几个突变株在25℃下 有感染力,而在37℃下则失去感染力。 以上四种突变类型的划分并不是绝对的,只是关注的角度不同,它们并不彼此排斥, 往往会同时出现。营养缺陷型突变是生化突变型,但也是一种条件致死突变型。而且它常 伴随着菌体形态的变化,即形态突变型。所有的突变从本质上看都可认为是生化突变型 如果从研究者能否在巨大的群体中迅速检出和分离出个别的突变体的目的来看,则只 有选择性突变和非选择性突变两类。前者具选择性标记,可通过某种环境条件使它们得到 生长优势,从而取代原始菌株,例如营养缺陷型和抗性突变型等。后者没有选择性标记, 而只是一些数量上的差异,例如菌落大小、颜色深浅、产量高低等。 5.2.22突变的诱发因素 突变是怎样引起的呢?现在认为突变是可以诱发的,即在已知的物理、化学或生物因 素的作用下,生物体发生突变。突变也可以是自发的,自发突变是指生物在没有人工参与 的条件下所发生的突变,但这并不意味着它的发生是没有原因的,大多数自发突变本质上 也是诱发的,只不过它不是人为的,而是自然环境或细胞内环境诱发的。人们将引起突变 的因素称为诱发因素,诱发因素是多方面的,主要可以分为细胞外因素、细胞内因素和DNA 分子内部因素三个层次。 1)细胞外的诱发因素
第五章 微生物的菌种选育 11 根据突变造成遗传物质改变的范围，可以将突变分为染色体畸变和基因突变，但它们 本质上都造成了基因的突变，所以，都可以广义地理解成基因突变。 5.2.2.1 突变现象 从突变的表现型可将突变分为形态突变、生化突变、致死突变和条件致死突变四类： 1）形态突变型 指突变的菌体发生形态可见的变化。如细胞大小、形状、鞭毛、纤毛、孢 子、芽孢、荚膜，以及群体形态结构（菌落和噬菌斑等）的改变。 2）生化突变型 指突变的菌体原有特定的生化功能发生改变或丧失，但在形态上不一定有 可见的变化，通过生化方法可以检测到。如菌体对底物（糖、纤维素及烃等）的利用能力、 对营养物（氨基酸、维生素及碱基等）的需求、对过量代谢产物或代谢产物结构类似物的 耐性以及对抗药性发生的变化。另外，它也包括细胞成分尤其是细胞表面成分（细胞壁、 荚膜及鞭毛等）的细微变异而引起抗原性变化的突变。 生化突变对于发酵工业生产具有重大意义。例如：很多氨基酸和核苷酸生产菌就是一 些营养缺陷型的突变菌株，或是对某些代谢产物及其结构类似物的抗性菌株；对青霉素或 链霉素等药物的抗性菌株，可改善发酵的管理，并可作为遗传标记以便于育种工作中的筛 选和鉴别。 3）致死突变型 突变造成菌体死亡或生活能力下降。致死突变若是隐性基因决定的，那么 双倍体生物能够以杂合子的形式存活下来，一旦形成纯合子，则发生死亡。 4）条件致死突变型 突变后的菌体在某些条件下，可以生存，但在另一些条件下则发生死 亡。温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型。有些菌体发生突变后对温度变得敏感了， 在较窄的温度范围内才能存活，超出此温度范围则死亡。其原因是有些酶蛋白（DNA 聚合酶， 氨基酸活化酶等）肽链中的几个氨基酸被更换，从而降低了原有的抗热性。如有些大肠杆 菌突变菌株能在 37 ℃下生长，但不能在 42 ℃下生长；噬菌体 T4 的几个突变株在 25 ℃下 有感染力，而在 37 ℃下则失去感染力。 以上四种突变类型的划分并不是绝对的，只是关注的角度不同，它们并不彼此排斥， 往往会同时出现。营养缺陷型突变是生化突变型，但也是一种条件致死突变型。而且它常 伴随着菌体形态的变化，即形态突变型。所有的突变从本质上看都可认为是生化突变型。 如果从研究者能否在巨大的群体中迅速检出和分离出个别的突变体的目的来看，则只 有选择性突变和非选择性突变两类。前者具选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到 生长优势，从而取代原始菌株，例如营养缺陷型和抗性突变型等。后者没有选择性标记， 而只是一些数量上的差异，例如菌落大小、颜色深浅、产量高低等。 5.2.2.2 突变的诱发因素 突变是怎样引起的呢？现在认为突变是可以诱发的，即在已知的物理、化学或生物因 素的作用下，生物体发生突变。突变也可以是自发的，自发突变是指生物在没有人工参与 的条件下所发生的突变，但这并不意味着它的发生是没有原因的，大多数自发突变本质上 也是诱发的，只不过它不是人为的，而是自然环境或细胞内环境诱发的。人们将引起突变 的因素称为诱发因素，诱发因素是多方面的，主要可以分为细胞外因素、细胞内因素和 DNA 分子内部因素三个层次。 1) 细胞外的诱发因素
第五章微生物的菌种选育 这包括自然环境或人工条件下的物理和化学因素。如自然环境中,宇宙间的短波辐射 宇宙线和紫外线等,虽然在自然条件下,它们对地球上生物的辐射量并不大,但一般认为 辐射的诱变作用不存在阈值,任何微弱的辐射均有诱变效应。多因素低剂量长期辐射的综 合效应,将会引起生物的自发突变。自然环境中存在低剂量的金属离子、高分子化合物 生物碱药物、染料及微生物产生的HO2等都能成为引起生物突变的化学因素。 人造的紫外线、γ射线、X射线、快中子、激光以及加热等都能成为基因突变的物理因 素。人造的化学诱变因素有碱基类似物、烷化剂及亚硝酸盐等 2)细胞内的诱发因素 生物体细胞的代谢活动会产生一些诱变物质,如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等, 它们是引起自发突变的内源诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株,可 能就是这类原因 N N------H-N 胸腺嘧啶 鸟瞟呤N 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 鸟瞟呤 腺嘌呤 常见的氬基式或酮式稀有的亚氬基式或烯醇式 常见形式 图5.2.7碱基的互变异构效应图5.28互变异构效应引起的不正常的碱基配对 3)DNA分子内部因素 DNA分子中的碱基存在着互变异构效应。如图5.2.7所示,因为A、T、G、C四种碱基 的第6位,不是酮基(T,G)就是氨基(A,C),碱基T和G能够以酮式或烯醇式两种互变 异构的状态出现,而碱基C和A能够以氨基式或亚氨基式两种互变状态出现。一般生理条 件下,碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式,所以,DNA两条互补链之间总是以A:T和 G碱基配对。但是T偶尔也会以稀有的烯醇式形式出现,这样在DNA复制到达这一位置 的瞬间,新合成链中T对应的不再是A,而是G;同理,若碱基C以稀有的亚氨基形式出现, 在DNA复制到达这一位置的瞬间,则它对应的不是G,而是A,见图5.2.8。有人认为这就
第五章 微生物的菌种选育 12 这包括自然环境或人工条件下的物理和化学因素。如自然环境中，宇宙间的短波辐射、 宇宙线和紫外线等，虽然在自然条件下，它们对地球上生物的辐射量并不大，但一般认为 辐射的诱变作用不存在阈值，任何微弱的辐射均有诱变效应。多因素低剂量长期辐射的综 合效应，将会引起生物的自发突变。自然环境中存在低剂量的金属离子、高分子化合物、 生物碱药物、染料及微生物产生的 H2O2 等都能成为引起生物突变的化学因素。 人造的紫外线、γ射线、X 射线、快中子、激光以及加热等都能成为基因突变的物理因 素。人造的化学诱变因素有碱基类似物、烷化剂及亚硝酸盐等。 2) 细胞内的诱发因素 生物体细胞的代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等， 它们是引起自发突变的内源诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可 能就是这类原因。 图 5.2.7 碱基的互变异构效应 图 5.2.8 互变异构效应引起的不正常的碱基配对 3) DNA 分子内部因素 DNA 分子中的碱基存在着互变异构效应。如图 5.2.7 所示，因为 A、T、G、C 四种碱基 的第 6 位，不是酮基（T，G）就是氨基（A，C），碱基 T 和 G 能够以酮式或烯醇式两种互变 异构的状态出现，而碱基 C 和 A 能够以氨基式或亚氨基式两种互变状态出现。一般生理条 件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式，所以，DNA 两条互补链之间总是以 A:T 和 CG 碱基配对。但是 T 偶尔也会以稀有的烯醇式形式出现，这样在 DNA 复制到达这一位置 的瞬间，新合成链中 T 对应的不再是 A，而是 G；同理，若碱基 C 以稀有的亚氨基形式出现， 在 DNA 复制到达这一位置的瞬间，则它对应的不是 G，而是 A，见图 5.2.8。有人认为这就
第五章微生物的菌种选育 是造成了菌体自发突变的原因之一。 T-T-G-A-T A-A-C-G-T-A A-A-C T-A 2)-T-T-G- →-T-T-G-A-T -T-T一G-A-A-T A-A-C-G-T-A -A-A-c T-A -A-A-C-G-T-A G 3)--T →-TT-A--→-T1A-T-A-T -A-A-C-G-T-A -A-A T-A- -A-A-C-G-T-A C-G 图5.2.9核苷酸的环出效应 1)核苷酸G环出造成新链缺失对应的C;2)单个核苷酸环出,再经一次DN复制后,导致 C:G→A:T颠换;3)两个核苷酸环出,再经一次DNA复制后,导致C:G→A:T颗换和 G:C→A:T转换 有人提出了另一种造成自发突变的原因——环出效应。在DNA复制的过程中,如果 中某一单链上偶尔产生一小环,则会因环上的基因越过了复制或重复复制而发生遗传缺失 或碱基置换,从而也会造成自发突变。图5.2.9就是环出效应的设想机制。当DNA复制到C 时,模板链G向外“环出”,故只有C和T等获得复制,从而发生缺失突变,而下链则可继 续正常复制:另一种情况是,当DNA复制到C时,模板链G向外“环出”,当复制继续进行 时,模板却又恢复了正常。结果在原来应出现C:G碱基对的位置变成了A:G,再经DMA复 制,便成为A:T,从而造成C:G→A:T颠换 若环出的是两个核苷酸,就会导致相邻的两个碱基发生变化。如果这两个碱基分别属 于两个密码子,那么一次突变就可能引起两个氨基酸的改变 总之,诱发因素是普遍存在的,因为所有基因的结构都由四种碱基所组成,所以任何 基因都会突变。至于什么基因发生突变,什么时候发生突变,则都是随机的。采用人工的 物理或化学诱变可以提高突变发生的机率 5.2.2.3基因突变的特点 1)基因突变的自发性及不对应性 各种性状的突变都可以在没有任何人为诱变因素的作用下自发产生,这就是基因突变 的自发性。基因突变的性状与引起突变的因素之间无直接的对应关系。任何诱变因素或通 过自发突变过程都能获得任何性状的变异。就是说,在紫外线诱变下可以出现抗紫外线菌 株,通过自发或其它诱发因素也可以获得同样的抗紫外线菌株,紫外线诱发的突变菌株也 有不抗紫外线的,也可以是抗青霉素的,或是出现其它任何变异性状的突变。基因突变的
第五章 微生物的菌种选育 13 是造成了菌体自发突变的原因之一。 1） -T-T-G- → -T-T-G-A-T- -A-A-C-G-T-A- -A-A-C T-A- \/ G 2） -T-T-G- → -T-T-G-A-T- → -T-T -G-A-A-T- -A-A-C-G-T-A- -A-A-C T-A- -A-A-C-G-T-A- \/ G 3） -T-T- → -T-T-A-T- → -T-T-A-T- A-T- -A-A-C-G-T-A- -A-A T-A- -A-A-C-G-T-A- C-G 图 5.2.9 核苷酸的环出效应 1）核苷酸 G 环出造成新链缺失对应的 C；2）单个核苷酸环出，再经一次 DNA 复制后，导致 C：G →A：T 颠换；3）两个核苷酸环出，再经一次 DNA 复制后，导致 C：G →A：T 颠换和 G：C →A：T 转换 有人提出了另一种造成自发突变的原因——环出效应。在 DNA 复制的过程中，如果其 中某一单链上偶尔产生一小环，则会因环上的基因越过了复制或重复复制而发生遗传缺失 或碱基置换，从而也会造成自发突变。图 5.2.9 就是环出效应的设想机制。当 DNA 复制到 C 时，模板链 G 向外“环出”，故只有 C 和 T 等获得复制，从而发生缺失突变，而下链则可继 续正常复制；另一种情况是，当 DNA 复制到 C 时，模板链 G 向外“环出”，当复制继续进行 时，模板却又恢复了正常。结果在原来应出现 C：G 碱基对的位置变成了 A：G，再经 DNA 复 制，便成为 A：T，从而造成 C：G →A：T 颠换。 若环出的是两个核苷酸，就会导致相邻的两个碱基发生变化。如果这两个碱基分别属 于两个密码子，那么一次突变就可能引起两个氨基酸的改变。 总之，诱发因素是普遍存在的，因为所有基因的结构都由四种碱基所组成，所以任何 基因都会突变。至于什么基因发生突变，什么时候发生突变，则都是随机的。采用人工的 物理或化学诱变可以提高突变发生的机率。 5.2.2.3 基因突变的特点 1) 基因突变的自发性及不对应性 各种性状的突变都可以在没有任何人为诱变因素的作用下自发产生，这就是基因突变 的自发性。基因突变的性状与引起突变的因素之间无直接的对应关系。任何诱变因素或通 过自发突变过程都能获得任何性状的变异。就是说，在紫外线诱变下可以出现抗紫外线菌 株，通过自发或其它诱发因素也可以获得同样的抗紫外线菌株，紫外线诱发的突变菌株也 有不抗紫外线的，也可以是抗青霉素的，或是出现其它任何变异性状的突变。基因突变的
第五章微生物的菌种选育 自发性和不对应性已被波动测验、涂布试验和影印培养实验这三个著名的实验所证实 大肠杆菌 稀释培养物 培养前先分成50小管) 在同一大管中作整体培养 日合 (3)(2)(64)(1X0)(103)(1)(21)(7)(1)(7)(4)(5)(4)(7)5)(3)6)(4)(5) (抗噬菌体菌落数) 〔抗噬菌体菌落数) 来自分别的50个小管的50个平板 来自同一大管的50个平板 5.2.10变量试验示意图 1943年,鲁里亚( Luria)和德尔波留克 (Delbr uck)根据统计学原理,设计了变量试验 ( fluctuation test),又称为波动测验或彷徨试验,见图5.2.10。试验的要点是:取对噬 菌体T敏感的大肠杄菌对数期肉汤培养物,用新鲜培养液稀释成浓度为10°/毫升的细菌悬 液,然后在甲、乙两试管内各装10毫升。接着把甲管中的菌液先分装在50支小试管中(每 管装0.2毫升),保温24-36小时后,即把各小试管的菌液分别倒在50个预先涂有T1的平 板上,经培养后计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数。乙管中10毫升菌液不经分装先整 管保温24-36小时,然后分成50份加到同样涂有噬菌体的平板上,适当培养后,分别计算 各皿上产生的抗性菌落数。结果指出,来自甲管的50皿中,各皿间抗性菌落数相差悬殊 而来自乙管的则各皿数目基本相等。这说明大肠杆菌抗噬菌体性状突变,不是由于环境因 素——噬菌体诱导岀来的,而是在它们接触噬菌体前,在某一次细胞分裂过程中随机地自 发产生的。噬菌体在这里仅起到淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用 1949年,纽康布( Newcombe)曾设计了一种与变量试验相似,但方法更为简便的证实 同一观点的实验,这就是涂布试验( Newcombe experiment)。与变量试验不同,他用的是 固体平板培养法。先在12只培养皿上各涂以数目相等(5×103)的对T1噬菌体敏感的大肠 杆菌,经过5小时的培养,它们约繁殖了12.3代,于是在皿上长出大量微菌落(这时每个 菌落约含5,100个细菌)。取其中6皿直接喷上T噬菌体,另6皿则先用灭菌玻璃棒把上面 得到微菌落重新均匀涂布一次,然后同样喷上相应的T。培养过夜后,计算这两组培养皿 上所形成的抗噬菌体菌落数。结果发现,在涂布过的一组中,共有抗性菌落353个,要比 未经涂布过的(仅28个菌落)高得多,见图5.2.11。这也意味着该抗性突变株发生在未接
第五章 微生物的菌种选育 14 自发性和不对应性已被波动测验、涂布试验和影印培养实验这三个著名的实验所证实。 5.2.10 变量试验示意图 1943 年，鲁里亚(Luria)和德尔波留克(Delbrück)根据统计学原理，设计了变量试验 （fluctuation test），又称为波动测验或彷徨试验，见图 5.2.10。试验的要点是：取对噬 菌体 T1 敏感的大肠杆菌对数期肉汤培养物，用新鲜培养液稀释成浓度为 103 /毫升的细菌悬 液，然后在甲、乙两试管内各装 10 毫升。接着把甲管中的菌液先分装在 50 支小试管中（每 管装 0.2 毫升），保温 24-36 小时后，即把各小试管的菌液分别倒在 50 个预先涂有 T1 的平 板上，经培养后计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数。乙管中 10 毫升菌液不经分装先整 管保温 24-36 小时，然后分成 50 份加到同样涂有噬菌体的平板上，适当培养后，分别计算 各皿上产生的抗性菌落数。结果指出，来自甲管的 50 皿中，各皿间抗性菌落数相差悬殊， 而来自乙管的则各皿数目基本相等。这说明大肠杆菌抗噬菌体性状突变，不是由于环境因 素——噬菌体诱导出来的，而是在它们接触噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自 发产生的。噬菌体在这里仅起到淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。 1949 年，纽康布（Newcombe ）曾设计了一种与变量试验相似，但方法更为简便的证实 同一观点的实验，这就是涂布试验（Newcombe experiment）。与变量试验不同，他用的是 固体平板培养法。先在 12 只培养皿上各涂以数目相等（5104）的对 T1 噬菌体敏感 的大肠 杆菌，经过 5 小时的培养，它们约繁殖了 12.3 代，于是在皿上长出大量微菌落（这时每个 菌落约含 5,100 个细菌）。取其中 6 皿直接喷上 T1 噬菌体，另 6 皿则先用灭菌玻璃棒把上面 得到微菌落重新均匀涂布一次，然后同样喷上相应的 T1。培养过夜后，计算这两组培养皿 上所形成的抗噬菌体菌落数。结果发现，在涂布过的一组中，共有抗性菌落 353 个，要比 未经涂布过的（仅 28 个菌落）高得多，见图 5.2.11。这也意味着该抗性突变株发生在未接
第五章微生物的菌种选育 触噬菌体前。噬菌体的加入只起到甄别这类突变是否发生的作用,而不是诱导突变的因素。 自发突变 获得免疫性 在12个琼脂平面上每 1个平面涂布5×10大 肠杆菌的噶菌体敏感性 保组5小时 保温5小时 小蓝落生长时产 每个平面有5×10 生抗噬菌体突变 小菌落,每个菌落约 在未喷噬菌体T 含5000个细菌 前没有突变细胞 六个平面重新涂布 六个平面重新涂布 喷入T1 喷入T 喷入T1 保温 保温 保温 保沮 一个抗嗟小菌落中每个抗国两组平面有相同数目的细菌 体菌落菌体细胞产生一个所以将产生相同数目的抗嗽菌 抗噬菌体菌落 体菌落 图5.2.11涂布试验示意图 1952年,莱德伯格( Lederberg)夫妇设计了一种更巧妙的影印培养试验,直接证明了微 生物抗药性是自发产生的,并与相应的环境因素毫不相干。试验的基本过程是将长有许多 菌落(可多达数百个)的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木圆柱(直径小于培养皿) 上,木柱如“印章”一样沾满平板上所有的菌落,然后把这一“印章”上的细菌定位接种 到不同的选择培养基平板上,待培养后,对各皿相同位置上的菌落作对比后,就可选出特 定的突变型菌株,此过程称为影印培养法。这种方法已经广泛用于从在非选择性条件下生 长的细菌群体中,分离出各种类型的突变种。 利用影印培养法证明大肠杆菌K12自发产生抗链霉素突变的实验如图5.2.12所示。首 先将大量对链霉素敏感的大肠杆菌K12细胞涂布在不含链霉素的平板(1)的表面,待其长 出密集的小菌落后,用影印法接种到不含链霉素的培养基平板(2)上,随即再影印到含链霉 素的选择性培养基平板(3)上。影印的作用可保证这3个平板上所长出的菌落的亲缘和相 对位置保持严格的对应性。经培养后,在平板(3)上出现了个别抗链霉素菌落。经过与培 养皿(2)和(3)比较,就可在平板(2)的相应位置上找到平板(3)上的几个抗性菌落的“孪 生兄弟”。然后把平板(2)中最明显部位的菌落(实际上有许多菌落)挑至不含链霉素的 培养液(4)中,经培养后,再涂布在平板(5)上,并重复以上各步骤。上述过程几经重 复后,就只要涂上越来越少的原菌液至相当于平板(1)的培养皿(5)和(9)上,而可出
第五章 微生物的菌种选育 15 触噬菌体前。噬菌体的加入只起到甄别这类突变是否发生的作用，而不是诱导突变的因素。 图 5.2.11 涂布试验示意图 1952 年，莱德伯格(Lederberg)夫妇设计了一种更巧妙的影印培养试验，直接证明了微 生物抗药性是自发产生的，并与相应的环境因素毫不相干。试验的基本过程是将长有许多 菌落（可多达数百个）的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木圆柱（直径小于培养皿） 上，木柱如“印章”一样沾满平板上所有的菌落，然后把这一“印章”上的细菌定位接种 到不同的选择培养基平板上，待培养后，对各皿相同位置上的菌落作对比后，就可选出特 定的突变型菌株，此过程称为影印培养法。这种方法已经广泛用于从在非选择性条件下生 长的细菌群体中，分离出各种类型的突变种。 利用影印培养法证明大肠杆菌 K12 自发产生抗链霉素突变的实验如图 5.2.12 所示。首 先将大量对链霉素敏感的大肠杆菌 K12 细胞涂布在不含链霉素的平板（1）的表面，待其长 出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基平板(2)上，随即再影印到含链霉 素的选择性培养基平板（3）上。影印的作用可保证这 3 个平板上所长出的菌落的亲缘和相 对位置保持严格的对应性。经培养后，在平板（3）上出现了个别抗链霉素菌落。经过与培 养皿(2)和(3)比较，就可在平板（2）的相应位置上找到平板（3）上的几个抗性菌落的“孪 生兄弟”。然后把平板（2）中最明显部位的菌落（实际上有许多菌落）挑至不含链霉素的 培养液（4）中，经培养后，再涂布在平板（5）上，并重复以上各步骤。上述过程几经重 复后，就只要涂上越来越少的原菌液至相当于平板（1）的培养皿（5）和（9）上，而可出