第七章氨基酸发酵的微生物 7.1概述 既含有氨基又具有a-位羧基基团的化合物称为a-氨基酸,有些氨基酸是亚氨基羧酸, 如脯氨酸。在自然界中,组成各式各样蛋白质的氨基酸共有20种,除甘氨酸外,所有组成 蛋白质的天然氨基酸都是L-a-氨基(或亚氨基)羧酸,这些氨基酸通过肽键连接成为大分 子的蛋白质,是所有生命的基础。其中的八种氨基酸是人类的必需氨基酸,即人类本身不能 合成、必须从食物中摄入的氨基酸。这八种必须氨基酸是:苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及色氨酸。此外,组氨酸对婴幼儿也是必须氨酸。除了上 述组成蛋白质的氨基酸外,自然界中还存在各种D氨基酸、ω-氨基酸及一些特殊的氨基酸, 如氨基磺酸、氨基硫酸及氨基磷酸等,这些特殊的氨基酸也具有重要的生理作用。氨基酸在 营养保健、调味品、化妆品及药品生产中都有重要的应用,因此必需以工业规模生产氨基酸 以满足市场的需要。 氨基酸可以采用化学合成、从天然物质中提取(蛋白质水解)、微生物发酵及酶催化 等方法生产。化学合成得到的氨基酸是消旋的DL-氨基酸,若需要的产物是L-氨基酸,必 须进行光学异构体的拆分。除少数例外,其它三种方法生产的氨基酸都是具有光学活性的 L氨基酸 蛋白质水解得到的是各种氨基酸的混合物,要将其中的某种氨基酸分离提纯十分困难 碱性或酸性氨基酸的提纯相对容易些,如胱氨酸就是通过毛发水解方法生产的,中性氨基酸 的分离就更困难 许多氨基酸都能采用微生物发酵方法生产。利用水解酶、氨基裂解酶、以吡哆醛5-磷 酸作为辅酶的酶及NAD'为辅酶的L氨基酸脱氢酶等都能用于酶法合成氨基酸的生产,这 些酶一般也要通过微生物发酵获得 所有微生物在培养时都能产生氨基酸,主要用于细胞生长所必需的蛋白质合成,在野 生型微生物中,细胞中合成的各种氨基酸含量由于受到负反馈调节而保持在最佳水平,积累 的量很少,因此不能直接用于工业发酵。在氨基酸的工业化生产中,一般应使微生物积累较 高浓度的氨基酸,才具有实际价值。因此,利用微生物发酵生产氨基酸的关键是解除反馈调 节,使氨基酸能过度积累。通常可以采用如下方法:1)刺激细胞同化起始底物;2)抑制副 反应;3)刺激细胞内氨基酸合成酶系的合成并提高酶的活力:4)抑制或降低使已合成氨基 酸降解的酶活;5)刺激细胞将胞内的氨基酸释放到胞外。因此如果要从一种野生型微生物 出发获得氨基酸的工业化生产菌种,就必需对该微生物的代谢途径进行研究,进而对其遗传 基因进行改造。遗传基因的改造可以采用传统的诱变育种方法,也能应用现代的基因重组技 术,这两种方法都已广泛地用于氨基酸高产菌种的选育 7.1.1微生物发酵法生产氨基酸的历史和发展趋势 1908年日本人 Ikeda发现谷氨酸钠是鲜味的强化剂,开始了工业化生产氨基酸的历史 在此后的近50年中,谷氨酸的生产都是以大豆或面筋蛋白为原料、采用酸水解后分离提取 的方法。1957年日本科学家 Kinoshita等人发现,在培养某些微生物,如谷氨酸棒杆菌 ( Corynbacterium glutamicum)时会产生谷氨酸的积累,从此揭开了用微生物发酵方法生产 氨基酸的历史新篇章。至今,几乎所有的氨基酸都能采用发酵法生产。谷氨酸是第一种应用 发酵法进行工业化生产、也是目前产量最高的氨基酸。全世界的年产量超过50万吨,中国 已经成为世界上最大的谷氨酸钠(味精)生产和消费国。 赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一,虽然植物蛋白中含有少量的赖氨酸,但不能满足
1 第七章 氨基酸发酵的微生物 7. 1 概述 既含有氨基又具有α-位羧基基团的化合物称为α-氨基酸, 有些氨基酸是亚氨基羧酸， 如脯氨酸。在自然界中，组成各式各样蛋白质的氨基酸共有 20 种，除甘氨酸外，所有组成 蛋白质的天然氨基酸都是 L-α-氨基（或亚氨基）羧酸，这些氨基酸通过肽键连接成为大分 子的蛋白质，是所有生命的基础。其中的八种氨基酸是人类的必需氨基酸，即人类本身不能 合成、必须从食物中摄入的氨基酸。这八种必须氨基酸是：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及色氨酸。此外，组氨酸对婴幼儿也是必须氨酸。除了上 述组成蛋白质的氨基酸外，自然界中还存在各种 D-氨基酸、ω-氨基酸及一些特殊的氨基酸， 如氨基磺酸、氨基硫酸及氨基磷酸等，这些特殊的氨基酸也具有重要的生理作用。氨基酸在 营养保健、调味品、化妆品及药品生产中都有重要的应用，因此必需以工业规模生产氨基酸 以满足市场的需要。 氨基酸可以采用化学合成、从天然物质中提取（蛋白质水解）、微生物发酵及酶催化 等方法生产。化学合成得到的氨基酸是消旋的 DL-氨基酸，若需要的产物是 L-氨基酸，必 须进行光学异构体的拆分。除少数例外, 其它三种方法生产的氨基酸都是具有光学活性的 L-氨基酸。 蛋白质水解得到的是各种氨基酸的混合物，要将其中的某种氨基酸分离提纯十分困难， 碱性或酸性氨基酸的提纯相对容易些，如胱氨酸就是通过毛发水解方法生产的，中性氨基酸 的分离就更困难。 许多氨基酸都能采用微生物发酵方法生产。利用水解酶、氨基裂解酶、以吡哆醛 5’-磷 酸作为辅酶的酶及 NAD＋为辅酶的 L-氨基酸脱氢酶等都能用于酶法合成氨基酸的生产，这 些酶一般也要通过微生物发酵获得。 所有微生物在培养时都能产生氨基酸，主要用于细胞生长所必需的蛋白质合成，在野 生型微生物中，细胞中合成的各种氨基酸含量由于受到负反馈调节而保持在最佳水平，积累 的量很少, 因此不能直接用于工业发酵。在氨基酸的工业化生产中，一般应使微生物积累较 高浓度的氨基酸，才具有实际价值。因此，利用微生物发酵生产氨基酸的关键是解除反馈调 节，使氨基酸能过度积累。通常可以采用如下方法：1）刺激细胞同化起始底物；2）抑制副 反应；3）刺激细胞内氨基酸合成酶系的合成并提高酶的活力；4）抑制或降低使已合成氨基 酸降解的酶活；5）刺激细胞将胞内的氨基酸释放到胞外。因此如果要从一种野生型微生物 出发获得氨基酸的工业化生产菌种，就必需对该微生物的代谢途径进行研究，进而对其遗传 基因进行改造。遗传基因的改造可以采用传统的诱变育种方法，也能应用现代的基因重组技 术，这两种方法都已广泛地用于氨基酸高产菌种的选育。 7. 1. 1 微生物发酵法生产氨基酸的历史和发展趋势 1908 年日本人 Ikeda 发现谷氨酸钠是鲜味的强化剂，开始了工业化生产氨基酸的历史。 在此后的近 50 年中，谷氨酸的生产都是以大豆或面筋蛋白为原料、采用酸水解后分离提取 的方法。1957 年日本科学家 Kinoshita 等人发现，在培养某些微生物，如谷氨酸棒杆菌 （Corynbacterium glutamicum）时会产生谷氨酸的积累，从此揭开了用微生物发酵方法生产 氨基酸的历史新篇章。至今，几乎所有的氨基酸都能采用发酵法生产。谷氨酸是第一种应用 发酵法进行工业化生产、也是目前产量最高的氨基酸。全世界的年产量超过 50 万吨，中国 已经成为世界上最大的谷氨酸钠（味精）生产和消费国。 赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，虽然植物蛋白中含有少量的赖氨酸，但不能满足
人和动物的需要。在食物和动物饲料中添加适量的赖氨酸有利于人类健康和动物的生长。人 们已经发现在某些微生物中存在着赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制,据此 Nakayama等人于 961年从谷氨酸棒杆菌分离到一株高丝氨酸营养缺陷型菌种;Shhe和Sano则于1969年获 得了一株苏氨酸和蛋氨酸双重营养缺陷型黄色短杆菌( Brevibacterium flavum)菌种。这两 个菌种的胞内苏氨酸合成都受到了阻遏,从而降低了对天冬氨酸激酶的抑制作用,促进了赖 氨酸的积累,使赖氨酸的工业化生产成为可能。目前,赖氨酸生产菌的发酵水平已经达到 l00g/L以上,微生物发酵法成了唯一的赖氨酸工业化生产方法。 L-苯丙氨酸是另一种人类必需的氨基酸,近年来又在新型甜味剂 Aspartame(中文商品 名:天冬甜精或阿斯巴甜)的合成中发现了新的应用,因此L苯丙氨酸的产量增加很快。1974 年, Coates和 Nester发现了一株β-噻吩丙氨酸抗性的枯草杆菌( Bacillus subtilis)突变株, 该菌株的预苯氨酸脱氢酶活力受到抑制,解除了L-苯丙氨酸的负反馈抑制:1981年,Goto 等人从乳酸发酵杆菌分离到了一株p氟苯丙氨酸(PFP)和5-甲基色氨酸抗性的突变株,属 于酪氨酸缺陷型。目前化学合成、酶法合成及微生物发酵生产苯丙氨酸都已实现工业化生产, 而微生物发酵法则由于原料便宜而受到青睐。 自七十年代以来,几乎所有氨基酸的发酵法生产都进行了研究和开发,已经获得工业 化生产的除了上述三种氨基酸外,还有精氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝 氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。 获得高产菌种始终是发酵法生产氨基酸的关键。除了从野生型菌株岀发,通过筛选、 诱变等方法获得营养缺陷型和/或调节突变型菌株的传统方法外,利用基因重组技术获得氨 基酸发酵高产菌种已经成了新的发展方向。例如,前苏联的科学家利用基因工程方法将合成 L-苏氨酸的基因克隆到大肠杆菌中,L苏氨酸的产量提高到了55g/;能积累L苯丙氨酸的 基因工程菌也已经应用于工业生产;基因工程菌的宿主细胞已经从Gram阴性菌发展到Gram 阳性菌。生产氨基酸的基因工程菌的研究还在深入地进行,必将为提高氨基酸的发酵水平作 出贡献 发酵法生产氨基酸的另一个发展方向是采用先进的发酵技术。固定化细胞发酵、连续 发酵、新型的生物反应器(如气升式反应器)、及发酵过程的优化和控制等都在氨基酸发酵 工业中受到重视 从发酵液中分离提取氨基酸的新技术和新工艺对于提高氨基酸发酵工业的水平和经济 效益也有十分重要的作用。一些新颖的分离方法正在氨基酸工业推广应用,如膜分离、离子 交换及电渗析等 7.1.2发酵法生产氨基酸的徽生物 谷氨酸的产生菌可以从自然界中筛选得到,例如谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌。最初筛 选得到的菌种积累谷氨酸的能力都不强,不超过30g/L。进过不断的诱变育种,现在工业用 的菌种产谷氨酸能力已经超过100g/,有些菌种甚至达到了150g以上,大大提高了生产 效率,降低了生产成本。要从自然界筛选到其它氨基酸的生产菌种就不那么容易了,这是由 这些氨基酸在细胞内的代谢机理决定的。至今从自然界筛选的微生物只有能积累DL-丙氨酸 的嗜氨微杆菌( Microbacterium amminophilum)及产生L缬氨酸的乳酸发酵短杆菌,但是产 量都很低。其他氨基酸的产生菌几乎都是从短杆菌和棒杆菌通过诱变育种或基因工程技术获 得的。这是氨基酸发酵菌种的一大特点。 除了高产外,对氨基酸生产菌种的其它要求包括抗噬菌体的侵入。噬菌体是氨基酸生 产的大敌,由于感染噬菌体而引起‘倒罐’会给生产造成重大损失,因此,应该选育抗噬菌 体的菌种
2 人和动物的需要。在食物和动物饲料中添加适量的赖氨酸有利于人类健康和动物的生长。人 们已经发现在某些微生物中存在着赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，据此 Nakayama 等人于 1961 年从谷氨酸棒杆菌分离到一株高丝氨酸营养缺陷型菌种；Shhe 和 Sano 则于 1969 年获 得了一株苏氨酸和蛋氨酸双重营养缺陷型黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）菌种。这两 个菌种的胞内苏氨酸合成都受到了阻遏，从而降低了对天冬氨酸激酶的抑制作用，促进了赖 氨酸的积累，使赖氨酸的工业化生产成为可能。目前，赖氨酸生产菌的发酵水平已经达到 100g/L 以上, 微生物发酵法成了唯一的赖氨酸工业化生产方法。 L-苯丙氨酸是另一种人类必需的氨基酸，近年来又在新型甜味剂 Aspartame（中文商品 名：天冬甜精或阿斯巴甜）的合成中发现了新的应用, 因此 L-苯丙氨酸的产量增加很快。1974 年，Coates 和 Nester 发现了一株β-噻吩丙氨酸抗性的枯草杆菌（Bacillus subtilis）突变株， 该菌株的预苯氨酸脱氢酶活力受到抑制，解除了 L-苯丙氨酸的负反馈抑制；1981 年，Goto 等人从乳酸发酵杆菌分离到了一株 p-氟苯丙氨酸（PFP）和 5-甲基色氨酸抗性的突变株，属 于酪氨酸缺陷型。目前化学合成、酶法合成及微生物发酵生产苯丙氨酸都已实现工业化生产， 而微生物发酵法则由于原料便宜而受到青睐。 自七十年代以来，几乎所有氨基酸的发酵法生产都进行了研究和开发，已经获得工业 化生产的除了上述三种氨基酸外，还有精氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝 氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。 获得高产菌种始终是发酵法生产氨基酸的关键。除了从野生型菌株出发，通过筛选、 诱变等方法获得营养缺陷型和/或调节突变型菌株的传统方法外，利用基因重组技术获得氨 基酸发酵高产菌种已经成了新的发展方向。例如，前苏联的科学家利用基因工程方法将合成 L-苏氨酸的基因克隆到大肠杆菌中，L-苏氨酸的产量提高到了 55g/L；能积累 L-苯丙氨酸的 基因工程菌也已经应用于工业生产；基因工程菌的宿主细胞已经从Gram阴性菌发展到Gram 阳性菌。生产氨基酸的基因工程菌的研究还在深入地进行，必将为提高氨基酸的发酵水平作 出贡献。 发酵法生产氨基酸的另一个发展方向是采用先进的发酵技术。固定化细胞发酵、连续 发酵、新型的生物反应器（如气升式反应器）、及发酵过程的优化和控制等都在氨基酸发酵 工业中受到重视。 从发酵液中分离提取氨基酸的新技术和新工艺对于提高氨基酸发酵工业的水平和经济 效益也有十分重要的作用。一些新颖的分离方法正在氨基酸工业推广应用，如膜分离、离子 交换及电渗析等。 7. 1. 2 发酵法生产氨基酸的微生物 谷氨酸的产生菌可以从自然界中筛选得到，例如谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌。最初筛 选得到的菌种积累谷氨酸的能力都不强，不超过 30g/L。进过不断的诱变育种，现在工业用 的菌种产谷氨酸能力已经超过 100 g/L，有些菌种甚至达到了 150 g/L 以上，大大提高了生产 效率，降低了生产成本。要从自然界筛选到其它氨基酸的生产菌种就不那么容易了，这是由 这些氨基酸在细胞内的代谢机理决定的。至今从自然界筛选的微生物只有能积累 DL-丙氨酸 的嗜氨微杆菌（Microbacterium amminophilum）及产生 L-缬氨酸的乳酸发酵短杆菌，但是产 量都很低。其他氨基酸的产生菌几乎都是从短杆菌和棒杆菌通过诱变育种或基因工程技术获 得的。这是氨基酸发酵菌种的一大特点。 除了高产外，对氨基酸生产菌种的其它要求包括抗噬菌体的侵入。噬菌体是氨基酸生 产的大敌，由于感染噬菌体而引起‘倒罐’会给生产造成重大损失，因此，应该选育抗噬菌 体的菌种
7.2氨基酸发酵机理和菌种选育 7.2.1氨基酸发酵机理 如前所述,几乎所有的微生物都能在其代谢途经中合成氨基酸以满足细胞生长的需要 但由于受到产物的负反馈抑制,细胞内各种氨基酸的浓度只能维持在生理浓度范围内,不会 产生过量的积累。当以葡萄糖为碳源时,细胞内各种氨基酸代谢途径如图71.1所示 葡萄糖( Glucose,C6) 组氨酸(HisC6N3)+戊糖(C3) 甘氨酸(Gly,C2N) 四碳糖(C4) 苯丙氨酸(PheC9N) 三糖(C3)—丝氨酸(Ser,C3 酪氨酸(Tyr,CN) 莽草酸(C7) 色氨酸(Ty,C1N2) 半胱氨酸(CyC3NS) 丙氨酸(AaC3N) 丙酮酸(Pyr,C3)(Cs)→缬氨酸( Val. CsN) 赖氨酸( Lys, C6N2)氨基庚二酸 (DAP, C7N2) Acetyl(C2) 亮氨酸( Leu, CN) 蛋氨酸( Met CsNS) 天冬氨酸(Asp,CN)+草酰乙酸( Oxalacetate C) 柠檬酸( Citrate,C6) 苏氨酸(Thr,C4N) 异亮氨酸(llu,C6N) 脯氨酸(Pro,CsN a-酮戊二酸(Cs)一谷氨酸( Glu. CsN精氨酸(Arg,C6N4 图721以葡萄糖为碳源时,细胞内各种氨基酸的代谢途经 从图中可以看到,细胞内氨基酸的合成具有如下特点:1)某一类氨基酸往往有一个共 同的前体;2)氨基酸的生物合成与EMP途径、三羧酸循环有十分密切的关系;3)一种氨 基酸可能是另一种氨基酸的前体。因此如果要细胞大量地积累氨基酸,就必需做到:1)必 需解除氨基酸代谢途经中存在的产物反馈抑制:2)应该防止所合成的目标氨基酸降解或者 用于合成其它细胞组分;3)若几种氨基酸有一个共同的前体,应该切断其他氨基酸的合成 途经:4)应该增加细胞膜的通透性,使得细胞内合成的氨基酸能够及时释放到胞外,降低 其胞内的浓度。因此在氨基酸生产菌种的育种工作中,应该在基因水平对微生物进行改造, 改造的方法包括传统的诱变育种及应用现代基因工程 下面将以谷氨酸的生物合成机理为例进行讨论。谷氨酸生产菌可以从自然界中筛选得 到,但产量不高。谷氨酸是三羧酸循环中的α-酮戊二酸在L谷氨酸脱氢酶的催化下与游离 氨反应合成的。α-酮戊二酸则是由草酰琥珀酸脱羧生成、在三羧酸循环中又会在α-酮戊二 酸脱氢酶复合物的催化下进一步脱去一分子二氧化碳形成琥珀酸辅酶A。正是由于上述机 理,自然界筛选的细胞积累的谷氨酸浓度不髙。通过诱变育种,限制细胞内α-酮戊二酸脱
3 7. 2 氨基酸发酵机理和菌种选育 7. 2. 1 氨基酸发酵机理 如前所述，几乎所有的微生物都能在其代谢途经中合成氨基酸以满足细胞生长的需要， 但由于受到产物的负反馈抑制，细胞内各种氨基酸的浓度只能维持在生理浓度范围内，不会 产生过量的积累。当以葡萄糖为碳源时，细胞内各种氨基酸代谢途径如图 7.1.1 所示。 葡萄糖(Glucose, C6） 组氨酸(His,C6N3) 戊糖(C5) 甘氨酸(Gly,C2N) 四碳糖(C4) 苯丙氨酸(Phe,C9N) 三糖(C3) 丝氨酸(Ser,C3N) 酪氨酸(Tyr,C9N) 莽草酸(C7) 色氨酸(Try,C11N2) 半胱氨酸(Cys,C3NS) 丙氨酸(Ala,C3N) 丙酮酸(Pyr,C3) (C5) 缬氨酸(Val,C5N) 赖氨酸(Lys,C6N2) 氨基庚二酸 (DAP,C7N2) Acetyl(C2) 亮氨酸(Leu,C6N) 蛋氨酸(Met,C5NS) 天冬氨酸(Asp,C4N) 草酰乙酸(Oxalacetate,C4) 柠檬酸(Citrate,C6) 苏氨酸(Thr,C4N) 异亮氨酸(Ileu,C6N) 脯氨酸(Pro,C5N) α-酮戊二酸(C5) 谷氨酸(Glu,C5N) 精氨酸(Arg,C6N4) 图 7.2.1 以葡萄糖为碳源时，细胞内各种氨基酸的代谢途经 从图中可以看到，细胞内氨基酸的合成具有如下特点：1）某一类氨基酸往往有一个共 同的前体；2）氨基酸的生物合成与 EMP 途径、三羧酸循环有十分密切的关系；3）一种氨 基酸可能是另一种氨基酸的前体。因此如果要细胞大量地积累氨基酸，就必需做到：1）必 需解除氨基酸代谢途经中存在的产物反馈抑制；2）应该防止所合成的目标氨基酸降解或者 用于合成其它细胞组分；3）若几种氨基酸有一个共同的前体，应该切断其他氨基酸的合成 途经；4）应该增加细胞膜的通透性，使得细胞内合成的氨基酸能够及时释放到胞外，降低 其胞内的浓度。因此在氨基酸生产菌种的育种工作中，应该在基因水平对微生物进行改造， 改造的方法包括传统的诱变育种及应用现代基因工程。 下面将以谷氨酸的生物合成机理为例进行讨论。谷氨酸生产菌可以从自然界中筛选得 到，但产量不高。谷氨酸是三羧酸循环中的α-酮戊二酸在 L-谷氨酸脱氢酶的催化下与游离 氨反应合成的。α-酮戊二酸则是由草酰琥珀酸脱羧生成、在三羧酸循环中又会在α-酮戊二 酸脱氢酶复合物的催化下进一步脱去一分子二氧化碳形成琥珀酸辅酶 A。正是由于上述机 理，自然界筛选的细胞积累的谷氨酸浓度不高。通过诱变育种，限制细胞内α-酮戊二酸脱
氢酶复合物的活性,就能防止α-酮戊二酸的降解,提高谷氨酸的产量。影响谷氨酸产量提 高的另一个重要因素是细胞壁的通透性。细胞内的谷氨酸必需释放到细胞外,才能使胞内谷 氨酸浓度保持在适当的水平,不至产生严重的负反馈抑制。过去曾有人认为生物素是谷氨酸 产生的必要条件,但是通过深入研究表明,生物素的主要作用是改善细胞壁的通透性而并不 是谷氨酸产生的必要条件。有人研究了原来不产谷氨酸的大肠杆菌经诱变后得到的a-酮戊 二酸脱氢酶缺失的突变株,发现不需要生物素就能积累2.3g/L的谷氨酸。虽然亚适量的生 物素(2.5~5.0μgL)可以促进谷氨酸棒杆菌的生长和谷氨酸积累,但是过量的生物素(25 30ug/L)反而会抑制谷氨酸的有效产生。研究表明,生物素在谷氨酸合成中的作用一方面是 作为乙酰辅酶A的辅基,当这种辅酶参与油酸和其他脂肪酸的合成反应时会受到CsI8饱和 脂肪酸的抑制,这样有利于乙酰辅酶A进入三羧酸循环,减少用于合成脂肪酸的消耗:生物 素更重要的作用是使细胞壁中的脂肪酸含量发生变化,从而改变了细胞壁的通透性,有利于 谷氨酸的释放。因此,生物素并不是谷氨酸合成的必要条件。进一步的研究表明,不仅生物 素,培养基中加入油酸盐和饱和脂肪酸也能改善细胞壁的通透性,提高谷氨酸的产量。某些 抗生素,如青霉素和头孢菌素C,也会有利于谷氨酸释放到胞外,但是作用的机理不同。抗 生素的加入会阻碍细胞壁的合成,使细胞膨胀、拉长,结果也是增加了细胞的通透性 从图7.21还可以看到,α-酮戊二酸是谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸的共同前体, 培养条件的改变会使最终产物发生变化。例如,同样是生产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌,在高浓 度氯化铵存在下、保持培养基呈弱酸性并加入锌离子会提高谷氨酰胺合成酶的活力,使谷氨 酸转化为谷氨酰胺:而当培养基中含有过量的生物素和高浓度氯化铵时,L-脯氨酸的积累量 将超过40g/L。上述方法已经用于谷氨酰胺和L脯氨酸的工业化生产 7.2.2发酵法生产氨基酸的菌种选育 工业发酵要求选育出高产菌种。一种微生物经过育种,能够积累过量的目标产物,就可 以用于工业发酵,同时也说明它的遗传基因型与野生菌相比已经发生了变化。如果目标产物 的代谢途径和调控机制已经比较清楚,在菌种选育时就能够有目的地采用适当的方法对细胞 内的调节控制机理进行改造,就能够比较容易地获得高产菌种。微生物中氨基酸合成的代谢 途经和调控机制已经进行了深入研究,为菌种选育创造了良好的条件。根据已经掌握的微生 物中氨基酸生物合成的代谢途径和调控机制,发酵法生产氨基酸的菌种选育方法主要有:选 育营养缺陷型菌种;选育调节突变型菌种及用基因工程方法获得髙产菌种。下面将对这三种 方法分别予以讨论 7.2.2.1从营养缺陷型突变株选育氨基酸产生菌 营养缺陷型突变株的特点是:当菌株生长所必需的某种营养物质供应受到限制时,就不 会合成产生负反馈抑制的抑制剂,从而解除了反馈抑制,使得该代谢途径下游的有关代谢产 物或其前体物质能够过量积累。从氨基酸的合成途径可以看到,各种氨基酸的合成存在着密 切的关系,有些有共同的前体;有些是在同一条支路上合成,既是前面一种氨基酸的反应产 物,又是后一种氨基酸合成的反应物。因此为了使某一种氨基酸大量积累,就必须增加合成 氨基酸前体的速率,切断竞争消耗共同前体的其它氨基酸的代谢支路,防止目标产物被下游 的反应消耗。为了达到上述目标,选育营养缺陷型突变株是最简单有效的提高目标氨基酸产 量的方法。表7.2.1列出了部分氨基酸生产菌种及其遗传标记,其中的鸟氨酸和瓜氨酸是精 氨酸合成的中间产物 表7、2、1用营养缺陷型突变菌株生产的氨基酸
4 氢酶复合物的活性，就能防止α-酮戊二酸的降解，提高谷氨酸的产量。影响谷氨酸产量提 高的另一个重要因素是细胞壁的通透性。细胞内的谷氨酸必需释放到细胞外，才能使胞内谷 氨酸浓度保持在适当的水平，不至产生严重的负反馈抑制。过去曾有人认为生物素是谷氨酸 产生的必要条件，但是通过深入研究表明，生物素的主要作用是改善细胞壁的通透性而并不 是谷氨酸产生的必要条件。有人研究了原来不产谷氨酸的大肠杆菌经诱变后得到的α-酮戊 二酸脱氢酶缺失的突变株，发现不需要生物素就能积累 2.3g/L 的谷氨酸。虽然亚适量的生 物素（2.5～5.0μg/L）可以促进谷氨酸棒杆菌的生长和谷氨酸积累，但是过量的生物素(25～ 30μg/L)反而会抑制谷氨酸的有效产生。研究表明，生物素在谷氨酸合成中的作用一方面是 作为乙酰辅酶 A 的辅基，当这种辅酶参与油酸和其他脂肪酸的合成反应时会受到 C16-18 饱和 脂肪酸的抑制，这样有利于乙酰辅酶 A 进入三羧酸循环, 减少用于合成脂肪酸的消耗；生物 素更重要的作用是使细胞壁中的脂肪酸含量发生变化，从而改变了细胞壁的通透性，有利于 谷氨酸的释放。因此，生物素并不是谷氨酸合成的必要条件。进一步的研究表明，不仅生物 素，培养基中加入油酸盐和饱和脂肪酸也能改善细胞壁的通透性, 提高谷氨酸的产量。某些 抗生素，如青霉素和头孢菌素 C，也会有利于谷氨酸释放到胞外，但是作用的机理不同。抗 生素的加入会阻碍细胞壁的合成，使细胞膨胀、拉长，结果也是增加了细胞的通透性。 从图 7.2.1 还可以看到，α-酮戊二酸是谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸的共同前体， 培养条件的改变会使最终产物发生变化。例如，同样是生产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，在高浓 度氯化铵存在下、保持培养基呈弱酸性并加入锌离子会提高谷氨酰胺合成酶的活力，使谷氨 酸转化为谷氨酰胺；而当培养基中含有过量的生物素和高浓度氯化铵时，L-脯氨酸的积累量 将超过 40g/L。上述方法已经用于谷氨酰胺和 L-脯氨酸的工业化生产。 7. 2. 2 发酵法生产氨基酸的菌种选育 工业发酵要求选育出高产菌种。一种微生物经过育种，能够积累过量的目标产物，就可 以用于工业发酵，同时也说明它的遗传基因型与野生菌相比已经发生了变化。如果目标产物 的代谢途径和调控机制已经比较清楚，在菌种选育时就能够有目的地采用适当的方法对细胞 内的调节控制机理进行改造，就能够比较容易地获得高产菌种。微生物中氨基酸合成的代谢 途经和调控机制已经进行了深入研究，为菌种选育创造了良好的条件。根据已经掌握的微生 物中氨基酸生物合成的代谢途径和调控机制，发酵法生产氨基酸的菌种选育方法主要有：选 育营养缺陷型菌种；选育调节突变型菌种及用基因工程方法获得高产菌种。下面将对这三种 方法分别予以讨论。 7.2.2.1 从营养缺陷型突变株选育氨基酸产生菌 营养缺陷型突变株的特点是: 当菌株生长所必需的某种营养物质供应受到限制时，就不 会合成产生负反馈抑制的抑制剂，从而解除了反馈抑制，使得该代谢途径下游的有关代谢产 物或其前体物质能够过量积累。从氨基酸的合成途径可以看到, 各种氨基酸的合成存在着密 切的关系, 有些有共同的前体; 有些是在同一条支路上合成, 既是前面一种氨基酸的反应产 物, 又是后一种氨基酸合成的反应物。因此为了使某一种氨基酸大量积累, 就必须增加合成 氨基酸前体的速率, 切断竞争消耗共同前体的其它氨基酸的代谢支路, 防止目标产物被下游 的反应消耗。为了达到上述目标, 选育营养缺陷型突变株是最简单有效的提高目标氨基酸产 量的方法。表 7.2.1 列出了部分氨基酸生产菌种及其遗传标记，其中的鸟氨酸和瓜氨酸是精 氨酸合成的中间产物。 表 7、2、1 用营养缺陷型突变菌株生产的氨基酸
氨基酸 遗传标记 参考产率,GL L-Aspartic acid Brevibacterium flavum Citrate synthase 10.6 (L-天冬氨酸) L-Citrulline Bacillus subtilis K (L瓜氨酸) Corynebacterium glutamicum 10.7 L-Leucine Corynebacterium glutamicum Phe His Il 16.0 (L亮氨酸) L-Lysine Corynebacterium glutamicum 13.0 (L-赖氨酸) Brevibacterium flavum Thr. Met 34.0 Brevibacterium lactofermentum 20.2 L-Ornithine Corynebacterium glutamicum 26.0 (L鸟氨酸) Corynebacterium hydrocarbonlactum Cit Brevibacterium lactofermentum Arthrobacter paraffines 8.0 -Proline cerium Hi 23.0 (L-脯氨酸) Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum lle so Arthrobacter paraffines 9.0 Escherichia col DAP 13.0 L-Threonine Il-回复突变 (L-苏氨酸) Candida guillermondii lle, Met, Trp 4.0 Met leu 10.5 L- valine Corynebacterium glutamicum (L-颉氨酸) Arthrobacter paraffines 摩尔产率 α,ε二氨基庚二酸:**———磺胺胍抗性 2*中 莆萄糖--≥谷氨酸 N-乙酰基谷氨酸 Ⅳ-乙酰基谷氨酰基磷酸 NADPH ATP S NADP 鸟氨酸 N-乙酰基鸟氨酸 N-乙酰基谷氨酰基半醛 氨甲酰基酸 一酮戊二酸谷氨酸 瓜氨酸 精氨酸基琥珀酸8X 天冬氨酸,ATP 中一精烈酸反馈抑制: 精氨酸阻遏 图722在产生谷氨酸的枯草杆菌中精氨酸生物合成的调节 1N-乙酰基谷氨酸合成酶:2N-乙酰基谷氨酰激酶:3,N-乙酰基谷氨酸-γ-半醛脱氢酶:4N- 乙酰基鸟氨酸-δ-氨基转移酶:5N-乙酰基谷氨酸-乙酰基鸟氨酸乙酰基转移酶;6.鸟氨酸氨 甲酰基转移酶;7精氨基琥珀酸合成酶;8精氨基琥珀酸酶 图722显示了精氨酸的合成途经。在谷氨酸棒杆菌中,从谷氨酸到精氨酸的合成途经
5 氨基酸 微生物 遗传标记 参考产率, G/L L-Aspartic acid (L-天冬氨酸) Brevibacterium flavum Citrate synthase－ 10.6 L-Citrulline (L-瓜氨酸) Bacillus subtilis K Corynebacterium glutamicum Arg－ Arg－ 16.5 10.7 L-Leucine (L-亮氨酸) Corynebacterium glutamicum Phe－ , His－ , Ile－ 16.0 L-Lysine (L-赖氨酸) Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Homoser－ Thr－ , Met－ Homoser－ 13.0 34.0 20.2 L-Ornithine (L-鸟氨酸) Corynebacterium glutamicum Corynebacterium hydrocarbonlactum Brevibacterium lactofermentum Arthrobacter paraffineus Cit－ Cit－ Cit－ Cit－ 26.0 9.0 40%* 8.0 L-Proline (L-脯氨酸) Brevibacterium sp. Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum His－ Ile－ Ile－ , SGr ** 23.0 14.8 35.0 L-Threonine (L-苏氨酸) Arthrobacter paraffineus Escherichia coli Candida guillermondii Escherichia coli Ile－ DAP － ***, Met － , Ile-回复突变 Ile－ , Met－ , Trp－ Met－ , Leu－ 9.0 13.0 4.0 10.5 L- Valine (L- 颉氨酸) Corynebacterium glutamicum Arthrobacter paraffineus Ile－ , Leu－ Ile－ 30.0 9.0 *———摩尔产率；**———α，ε二氨基庚二酸；***———磺胺胍抗性 图 7.2.2 在产生谷氨酸的枯草杆菌中精氨酸生物合成的调节 1.N-乙酰基谷氨酸合成酶；2.N-乙酰基谷氨酰激酶；3.N-乙酰基谷氨酸-γ-半醛脱氢酶；4.N- 乙酰基鸟氨酸-δ-氨基转移酶；5.N-乙酰基谷氨酸-乙酰基鸟氨酸乙酰基转移酶；6.鸟氨酸氨 甲酰基转移酶；7.精氨基琥珀酸合成酶；8.精氨基琥珀酸酶 图 7.2.2 显示了精氨酸的合成途经。在谷氨酸棒杆菌中，从谷氨酸到精氨酸的合成途经