第九章微生物和酶制剂工业 9.1概述 酶是一种具有催化活性的蛋白质,因此酶具有催化剂的特点,即:能够加快特定反应 的速率但不能改变反应的平衡,在反应中不消耗,反应结束时回复到原来的形态;同时酶又 具有蛋白质的属性,即:酶由氨基酸通过肽键连接而成,只有在适当的温度,pH和离子强 度下才具有生物活性,有些酶还需要辅酶或者辅因子。由于酶催化反应能够在常温常压下进 行,而且具有很高的效率和专一性,酶的应用日益受到了人们的重视。 在细胞中有数以千计的酶同时催化着成千上万个反应,因此可以毫不夸张地说,酶是 一切生命活动的基础。目前已经知道的酶超过了2000种,但是根据最简单的原核生物大肠 杆菌染色体的基因图谱分析,就可能包含3000-4500种不同酶蛋白的信息,所以还有更多的 酶有待于鉴别。 人类早在认识酶以前就知道利用酶为生产和生活服务,例如面粉发酵,酿造,鞣革及 制造奶酪等已经有几千年的历史,都是人类不自觉地利用酶的例子。1783年, Spallanzani 提出消化不是磨碎而是胃液在起作用的概念,对酶有了初步的认识:到了十九世纪人们已 经认识到了酶的存在,建立了酶的概念。1833年 Payer用乙醇抽提麦芽,并用于淀粉水解 和织物退浆;1887年Bˇ chner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳 1926年 Sumner第一次分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶:四十年代末,生产a-淀粉酶 的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产,标志着现代酶制剂工业的开始。 商品酶制剂根据其来源可以分为动物、植物及微生物酶;依据其用途可分为工业用、 分析用及药用:而且不同用途酶制剂产品的价格和生产规模也有很大的差别,见表9.1.1 由于用微生物发酵的方法能够不受原料的限制,实现大规模工业化的酶制剂生产,成本低、 效率高,因此在目前己经能够大规模工业化生产的100多种酶中,极大部分都是通过微生物 发酵生产的 表9.1.1商品酶的来源、用途及生产规模 工业用醇 分析用酶 药用酶 生产规模 以吨计 毫克一克 毫克克 粗酶制剂 纯结晶 纯结晶 微生物 微生物、动物、植物微生物、动物、植物 产品价格 9.1.1酶的分类和命名 我们知道,酶可以分为六个大类。根据酶委员会( Enzyme Commission)的命名规则,酶 的命名以酶委员会英文的头一个字母E.C.开始,后面跟随着四组数字,第一个数字表示酶 的大类,第二和第三个数字代表所催化的反应,第四个数字用于根据所催化的底物区分具有 类似功能的酶 1)氧化还原酶( Oxidoreductase)这类酶催化将氢或氧或电子从一种底物转移到另一种物 质的反应,常称为氧化酶或脱氢酶,如葡萄糖氧化酶及乙醇脱氢酶。氧化还原酶的前三 位数字的意义是 第一个数字 第二个数字 第三个数字 1.(氧化还原酶) 1.醇 1.NAD或NADP 2.醛或酮
1 第九章 微生物和酶制剂工业 9．1 概述 酶是一种具有催化活性的蛋白质，因此酶具有催化剂的特点，即：能够加快特定反应 的速率但不能改变反应的平衡，在反应中不消耗, 反应结束时回复到原来的形态；同时酶又 具有蛋白质的属性，即：酶由氨基酸通过肽键连接而成，只有在适当的温度, pH 和离子强 度下才具有生物活性，有些酶还需要辅酶或者辅因子。由于酶催化反应能够在常温常压下进 行，而且具有很高的效率和专一性，酶的应用日益受到了人们的重视。 在细胞中有数以千计的酶同时催化着成千上万个反应，因此可以毫不夸张地说，酶是 一切生命活动的基础。目前已经知道的酶超过了 2000 种，但是根据最简单的原核生物大肠 杆菌染色体的基因图谱分析, 就可能包含 3000-4500 种不同酶蛋白的信息，所以还有更多的 酶有待于鉴别。 人类早在认识酶以前就知道利用酶为生产和生活服务，例如面粉发酵，酿造，鞣革及 制造奶酪等已经有几千年的历史，都是人类不自觉地利用酶的例子。1783 年，Spallanzani 提出消化不是磨碎而是胃液在起作用的概念，对酶有了初步的认识； 到了十九世纪人们已 经认识到了酶的存在，建立了酶的概念。1833 年 Payer 用乙醇抽提麦芽，并用于淀粉水解 和织物退浆；1887 年 Bchner 发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳； 1926 年 Sumner 第一次分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶；四十年代末，生产α-淀粉酶 的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。 商品酶制剂根据其来源可以分为动物、植物及微生物酶；依据其用途可分为工业用、 分析用及药用；而且不同用途酶制剂产品的价格和生产规模也有很大的差别，见表 9.1.1。 由于用微生物发酵的方法能够不受原料的限制，实现大规模工业化的酶制剂生产，成本低、 效率高，因此在目前已经能够大规模工业化生产的 100 多种酶中，极大部分都是通过微生物 发酵生产的。 表 9.1.1 商品酶的来源、用途及生产规模 工业用酶 分析用酶 药用酶 生产规模 以吨计 毫克-克 毫克-克 纯度 粗酶制剂 纯结晶 纯结晶 来源 微生物 微生物、动物、植物 微生物、动物、植物 产品价格 低 中—高 中—高 9．1．1 酶的分类和命名 我们知道，酶可以分为六个大类。根据酶委员会(Enzyme Commission)的命名规则，酶 的命名以酶委员会英文的头一个字母 E.C.开始，后面跟随着四组数字，第一个数字表示酶 的大类，第二和第三个数字代表所催化的反应，第四个数字用于根据所催化的底物区分具有 类似功能的酶。 1） 氧化还原酶(Oxidoreductase) 这类酶催化将氢或氧或电子从一种底物转移到另一种物 质的反应，常称为氧化酶或脱氢酶，如葡萄糖氧化酶及乙醇脱氢酶。氧化还原酶的前三 位数字的意义是： 第一个数字 第二个数字 第三个数字 1．（氧化还原酶） 1.醇 1.NAD+或 NADP+ 2.醛或酮 2.Fe3+
3烯-CH=CH 4.伯胺 4.其它 5.叔胺 6.NADH或 NADPH 2)转移酶( Transferase)转移酶催化基团转移反应,一般形式为: AX + B →BX+A 但不包括氧化还原反应和水解反应。前三位数字的意义是 第一个数字 第二个数字 第三个数字 2.(转移酶) 1.一碳基团 转移基团的性质 2.醛基或酮基 3.酰基(-C0R) 4.葡萄糖基 7.磷酸基 8.含硫基团 3)水解酶( Hydrolase)水解酶催化水解反应, A-X+H20←>X-OH+HA 前两位数字的意义是 第一个数字 第二个数字 第三个数字 3.(水解酶) 1.酯键 糖苷键 4.肽键 5.除肽键外的C-N键 6.酸酐键 4)裂合酶 Lyase)裂合酶催化除水解外的从底物中脱除基团的反应或其逆反应,产物一般 含有一个双键,第二个数字代表所断裂键的类型,第三位数字代表所除去的基团。催化逆反 应的酶又称为合成酶。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 4.(裂合酶) 1.C 1.羧基 2.醛基 3.酮酸 5)异构酶( Isomerase)异构酶催化异构化反应,前三个数字的定义是 第一个数字 第二个数字 第三个数字 5.(异构酶) 1.消旋反应或差相异构化反应1.氨基酸 2.顺反(cis- trans)异构反应2.羟酸 3.分子内氧化还原反应 3.碳氢化合物 4分子内基团转移反应 6)连接酶( Ligase)连接酶催化各种键的合成,键的形成反应含能化合物(如ATP或核苷三 磷酸)键的断裂同时发生,反应的一般形式是 X +Y+ ATP X—Y+ADP+P1 或 X +Y+ ATP X-Y AMP PPI 连接酶的第二个数字代表所形成键的类型。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 6.(连接酶 1.C-0
2 3.烯-CH=CH- 3.O2 4.伯胺 4.其它 5.叔胺 6.NADH 或 NADPH 2)转移酶(Transferase) 转移酶催化基团转移反应，一般形式为： AX + B BX + A 但不包括氧化还原反应和水解反应。前三位数字的意义是： 第一个数字 第二个数字 第三个数字 2.(转移酶) 1.一碳基团 转移基团的性质 2.醛基或酮基 3.酰基(-CO-R) 4.葡萄糖基 7.磷酸基 8.含硫基团 3)水解酶(Hydrolase) 水解酶催化水解反应, A—X + H2O X—OH + HA 前两位数字的意义是: 第一个数字 第二个数字 第三个数字 3.(水解酶) 1.酯键 2.糖苷键 4.肽键 5.除肽键外的 C-N 键 6.酸酐键 4）裂合酶(Lyase) 裂合酶催化除水解外的从底物中脱除基团的反应或其逆反应，产物一般 含有一个双键，第二个数字代表所断裂键的类型，第三位数字代表所除去的基团。催化逆反 应的酶又称为合成酶。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 4．（裂合酶） ` 1.C-C 1.羧基 2.C-O 2.醛基 3.C-N 3.酮酸 4.C-N 5）异构酶（Isomerase） 异构酶催化异构化反应, 前三个数字的定义是: 第一个数字 第二个数字 第三个数字 5.(异构酶) 1.消旋反应或差相异构化反应 1.氨基酸 2.顺反(cis-trans)异构反应 2.羟酸 3.分子内氧化还原反应 3.碳氢化合物 4.分子内基团转移反应 6）连接酶(Ligase) 连接酶催化各种键的合成，键的形成反应含能化合物（如 ATP 或核苷三 磷酸）键的断裂同时发生，反应的一般形式是： X + Y + ATP X—Y + ADP + PI 或 X + Y + ATP X—Y + AMP + PPI 连接酶的第二个数字代表所形成键的类型。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 6.(连接酶) 1.C-O
以乙醇脱氢酶为例,它的酶编号为:EC1.1.1.1,说明它属于氧化还原酶,电子供体是 CH-OH,电子受体是NAD。因此它的正式命名应该是乙醇:NAD氧化还原酶 9.1.2主要的微生物藤制剂 目前,上述六大类中都有一些酶可以通过微生物发酵生产。部分典型的酶制剂及其生 产菌列于表9.1.2。 表9.1.2只列出了一小部分工业酶制剂,从中可以看到酶的用途已经渗透到各个工业 部门和人们的日常生活。以酶的工业应用为例,α-淀粉酶和糖化酶已经代替传统的酸法水 解用于从淀粉生产葡萄糖及纺织品的退浆:蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶广泛用于洗涤剂、食 品、纺织、精细化学品及手性化合物斥分和合成等:由葡萄糖异构酶催化的从葡萄糖生产高 果玉米糖浆( High Fructose Corn Syrup,HFCS)年产量已超过1,000万吨:通过青霉素酰化 酶催化青霉素G分解生产6-APA已成为半合成抗生素最重要的中间体,等等。许多酶直接应 用于疾病的诊断和治疗,如链激酶,葡萄糖氧化酶及乳酸脱氢酶等。更多的酶则被用于科学 研究,可以毫不夸张地说,没有众多的工具酶,就没有人类基因组计划和以基因重组为核心 的现代生物技术。随着人们对酶的认识不断深入和更多的酶被发现,酶的应用领域将更加广 阔,微生物酶制剂工业也必将得到进一步发展。 表9.1.2部分典型的酶制剂及其生产菌 酶名称 酶类型典型生产菌名称 用途 中文 英文 淀粉酶 水解酶|Bc1 us subtilis淀粉水解 葡萄糖苷酶 Amy glucosidase水解酶「 Aspergil/ us niger葡萄糖生产 碱性蛋白酶[ Alkaline protease水解酶[5Stre1 nyes gr1s洗涤剂(pH80) 性蛋白酶 Protease 解酶|Baci/ lus subtilis洗涤剂(pH7.0) 脂肪酶 水解酶 Rhizopus japonicus洗涤剂等 纤维素酶 Cellulase 水解酶 Trichoderma reesei纤维素水解等 果胶酶 水解酶| Eriwinia carotovora食品加工等 葡萄糖异构酶「 Glucose isomerase异构酶「 Bacillus coagulans高果糖浆制造 霉素酰化酶 Penicillin acylase转移酶| Escherichia coli6-APA制造 天冬氨酸转氨| Aspartic acid 转移酶| Escherichia coli L-苯丙氨酸制造 酶 Transaminase 延胡索酸酶| Fumarase 裂合酶 L-苹果酸制造 葡萄糖氧化酶| Glucose oxidase氧化酶| Bakers east 酶电极制备 T4DNA连接酶|T4 DNA Ligase ‖连接酶|T4感染的Eco1分子生物学研究 漆酶 Laccase 氧化酶 Coliolus versicolor木质素降解 9.1.2产酶微生物的来源和特点 从表9.1.2中可以发现,能够生产酶的微生物菌种分布很广,属于原核生物和真核生物 的许多微生物都能用于酶制剂的生产。往往有许多种微生物能够用于同一种酶的生产,例如, 枯草杆菌,曲霉及根霉等都可以用于生产淀粉酶,产品都能够用于降解淀粉,但是每种微生 物所生产的淀粉酶分子量、最适pH、最适温度及反应速率等都会有所差别,表9.1.3所列 的数据就说明了这种差别。另外,同一种微生物能够产生几种不同的酶或能够催化类似反应、 但是作用位点不同的几种酶,例如,黑曲霉( Aspergillus niger)既能产生淀粉酶,又能
3 2.C-S 3.C-N 4.C-C 以乙醇脱氢酶为例，它的酶编号为：EC 1.1.1.1，说明它属于氧化还原酶，电子供体是 CH-OH，电子受体是 NAD+。因此它的正式命名应该是乙醇：NAD+氧化还原酶。 9.1.2 主要的微生物酶制剂 目前，上述六大类中都有一些酶可以通过微生物发酵生产。部分典型的酶制剂及其生 产菌列于表 9.1.2。 表 9.1.2 只列出了一小部分工业酶制剂，从中可以看到酶的用途已经渗透到各个工业 部门和人们的日常生活。以酶的工业应用为例, −淀粉酶和糖化酶已经代替传统的酸法水 解用于从淀粉生产葡萄糖及纺织品的退浆；蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶广泛用于洗涤剂、食 品、纺织、精细化学品及手性化合物斥分和合成等；由葡萄糖异构酶催化的从葡萄糖生产高 果玉米糖浆(High Fructose Corn Syrup, HFCS)年产量已超过 1,000 万吨；通过青霉素酰化 酶催化青霉素 G 分解生产 6-APA 已成为半合成抗生素最重要的中间体, 等等。许多酶直接应 用于疾病的诊断和治疗, 如链激酶, 葡萄糖氧化酶及乳酸脱氢酶等。更多的酶则被用于科学 研究, 可以毫不夸张地说, 没有众多的工具酶, 就没有人类基因组计划和以基因重组为核心 的现代生物技术。随着人们对酶的认识不断深入和更多的酶被发现, 酶的应用领域将更加广 阔, 微生物酶制剂工业也必将得到进一步发展。 表 9.1.2 部分典型的酶制剂及其生产菌 酶名称 酶类型 典型生产菌名称 用途 中文 英文 淀粉酶 Amylase 水解酶 Bacillus subtilis 淀粉水解 葡萄糖苷酶 Amyloglucosidase 水解酶 Aspergillus niger 葡萄糖生产 碱性蛋白酶 Alkaline protease 水解酶 Streptomyces grisus 洗涤剂（pH8.0） 中性蛋白酶 Protease 水解酶 Bacillus subtilis 洗涤剂（pH7.0） 脂肪酶 Lipas 水解酶 Rhizopus japonicus 洗涤剂等 纤维素酶 Cellulase 水解酶 Trichoderma reesei 纤维素水解等 果胶酶 Pectinase 水解酶 Eriwinia carotovora 食品加工等 葡萄糖异构酶 Glucose isomerlase 异构酶 Bacillus coagulans 高果糖浆制造 青霉素酰化酶 Penicillin acylase 转移酶 Escherichia coli 6-APA 制造 天冬氨酸转氨 酶 Aspartic acid Transaminase 转移酶 Escherichia coli L-苯丙氨酸制造 延胡索酸酶 Fumarase 裂合酶 L-苹果酸制造 葡萄糖氧化酶 Glucose oxidase 氧化酶 Bakers Yeast 酶电极制备 T4 DNA 连接酶 T4 DNA Ligase 连接酶 T4 感染的 E. coli 分子生物学研究 漆酶 Laccase 氧化酶 Coliolus versicolor 木质素降解 9.1.2 产酶微生物的来源和特点 从表 9.1.2 中可以发现，能够生产酶的微生物菌种分布很广，属于原核生物和真核生物 的许多微生物都能用于酶制剂的生产。往往有许多种微生物能够用于同一种酶的生产，例如， 枯草杆菌，曲霉及根霉等都可以用于生产淀粉酶，产品都能够用于降解淀粉，但是每种微生 物所生产的淀粉酶分子量、最适 pH、最适温度及反应速率等都会有所差别，表 9.1.3 所列 的数据就说明了这种差别。另外，同一种微生物能够产生几种不同的酶或能够催化类似反应、 但是作用位点不同的几种酶，例如，黑曲霉（Aspergillus niger）既能产生淀粉酶，又能
产生纤维素酶或蛋白酶:而枯草杆菌( Bacillus subtilis)产生的淀粉酶中,则可能包括 α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶及糖化酶等淀粉水解酶,如图9.1.1所示,它们在淀粉分 子中的作用位点却完全不同。还有一些酶制剂实际上是几种不同酶的混合物并通过它们的协 同作用完成催化作用。例如一般称为纤维素酶的商品酶制剂至少是三种酶的混合物:内切型 葡聚糖酶(EC3.2.1.4,也称为Cx酶、CMC酶或简称EG)、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91,也 称为C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶或简称CBH)和纤维二糖酶(EC3.2.1.91,也称为 β-葡萄糖苷酶或简称BG)。Cx酶作用于纤维素分子内部的非结晶区,随机水解β-1,4糖苷键, 将纤维素大分子切割成带还原性末端的许多碎片;C酶作用于纤维分子末端,水解β-1,4糖 苷键,每次切下一个纤维二糖分子;纤维二糖酶则将纤维二糖进一步水解为葡萄糖。正是在 这三种酶的共同作用下,将纤维素最终水解为葡萄糖。 表9.1.3不同微生物生产的淀粉酶性质比较 微生物 最适p最适温度,CB「分子量1 杆菌Bci/ us subtilis 68,000 B. licheniformis 7.0-9.0 70-90 62,650 B. licheniformis 5.0-8.0 22,500 涟霉菌 Streptomyces aureofaciens 4.6-5.3 40,000 微球菌 Micrococus halobius 6.0-7.0 50-55 根瘤菌 Bacteroides amylophi/s 6.3 92,000 黑曲霉 Aspergillus oryzae 5.5-5.9 52,600 毛霉 Mucor pusillus 3.5-4.0 65-70 48,000 施旺氏酵母 Schwanniomyces castellii 40,000 α-淀粉酶 支链淀粉酶 β-淀粉酶 糖化酶 图9.1.1各种淀粉酶在淀粉分子上的作用位点 利用微生物生产酶制剂的主要优点是 1)可以通过改变微生物的遗传性质和优化培养条件而大大提高产酶水平。通过对产酶 菌种的选育,可以使参与微生物分解代谢的酶活水平提高几千倍、合成代谢的酶活 提高几百倍,这样的例子并不少见: 2)由于微生物发酵的生产周期短,培养基价格低廉,酶制剂可以实现大规模、低成本 的工业化生产
4 产生纤维素酶或蛋白酶；而枯草杆菌（Bacillus subtilis）产生的淀粉酶中，则可能包括 -淀粉酶、-淀粉酶、支链淀粉酶及糖化酶等淀粉水解酶，如图 9.1.1 所示,它们在淀粉分 子中的作用位点却完全不同。还有一些酶制剂实际上是几种不同酶的混合物并通过它们的协 同作用完成催化作用。例如一般称为纤维素酶的商品酶制剂至少是三种酶的混合物: 内切型 葡聚糖酶(EC3.2.1.4, 也称为 Cx 酶、CMC 酶或简称 EG) 、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91, 也 称为 C1 酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶或简称 CBH)和纤维二糖酶(EC3.2.1.91, 也称为 -葡萄糖苷酶或简称 BG)。Cx 酶作用于纤维素分子内部的非结晶区, 随机水解-1,4 糖苷键, 将纤维素大分子切割成带还原性末端的许多碎片；C1 酶作用于纤维分子末端，水解-1,4 糖 苷键，每次切下一个纤维二糖分子；纤维二糖酶则将纤维二糖进一步水解为葡萄糖。正是在 这三种酶的共同作用下，将纤维素最终水解为葡萄糖。 表 9.1.3 不同微生物生产的淀粉酶性质比较 微生物 最适 pH 最适温度,C 分子量 杆菌 Bacillus subtilis 6.0 60 68,000 B. licheniformis 7.0-9.0 70-90 62,650 B. licheniformis 5.0-8.0 76 22,500 链霉菌 Streptomyces aureofaciens 4.6-5.3 40 40,000 微球菌 Micrococus halobius 6.0-7.0 50-55 89,000 根瘤菌 Bacteroides amylophilus 6.3 43 92,000 黑曲霉 Aspergillus oryzae 5.5-5.9 40 52,600 毛霉 Mucor pusillus 3.5-4.0 65-70 48,000 施旺氏酵母 Schwanniomyces castellii 6.0 60 40,000 图 9.1.1 各种淀粉酶在淀粉分子上的作用位点 利用微生物生产酶制剂的主要优点是： 1） 可以通过改变微生物的遗传性质和优化培养条件而大大提高产酶水平。通过对产酶 菌种的选育, 可以使参与微生物分解代谢的酶活水平提高几千倍、合成代谢的酶活 提高几百倍，这样的例子并不少见； 2） 由于微生物发酵的生产周期短, 培养基价格低廉，酶制剂可以实现大规模、低成本 的工业化生产； -淀粉酶 支链淀粉酶 -淀粉酶 糖化酶
3)微生物的筛选方法比较简单,而且已经很成熟,因此有可能在较短的时间内从成千 个菌株中筛选出高产菌种; 4)同样的反应可以用来源于不同微生物所产的性质略有不同的酶催化,因此生物反应 器的操作条件选择具有一定的灵活性和适应性,以便与前后工序相配合 5)微生物发酵生产的酶比活高,有利于酶的分离和提纯 正是由于以上优点,利用微生物生产酶制剂大大降低了酶的生产成本,提高了酶制剂 的生产能力,从而推动了工业规模酶制剂生产和酶制剂应用的进展 一般而言,水解酶都是胞外酶,而其它酶通常属于胞内酶。极大部分酶都属于结构(组 成)酶,即微生物的DNA分子中存在着编码该酶蛋白的基因,在细胞生长过程中就会产生这 些酶并参于细胞代谢过程,但是酶的产量受到细胞的调节和控制;其中有些属于诱导酶,即 需要在培养基中添加特殊的诱导剂才会产生的酶。野生微生物的产酶水平一般都不高,不能 直接用于酶制剂的工业化生产,必须进行菌种选育以提高产酶水平。 虽然每一种微生物的代谢过程都需要数以千计的酶参与,但是不是每一种微生物都适 合于酶的工业化生产。传统的产酶菌种都是从土壤中筛选得到的,首先获得具有产某种酶能 力的微生物,然后通过各种诱变育种方法提高它的产酶水平,直至达到工业化生产的要求 对于产酶的菌种,一般应该符合如下的要求 1)菌种的遗传性能应该比较稳定; 2)菌种具有较高的生长速率; 3)除了蛋白酶生产菌种外,其它产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低,以防止目标酶被 蛋白酶水解 4)目标酶制剂的产量较高 随着分子生物学和重组DNA技术的发展,越来越多的酶已经知道了其氨基酸序列和空间 结构,因此可以通过基因重组获得基因工程菌生产酶制剂。 9.2合成的调节和控制 酶是一种蛋白质。根据生物化学和分子生物学的研究,蛋白质的合成是一个十分复杂 的过程,涉及到三种RNA(tRNA,mRNA及rRNA),几种核苷酸(ATP,GTP等),一系列的酶和 蛋白辅助因子,总共大约有200种细胞成分参与了蛋白质的合成过程。因此与蛋白质合成有 关的调节和控制因素都会影响酶的产量。微生物细胞产生的酶可以分为两大类:胞外酶和胞 内酶。胞外酶一般都属于水解酶,是微生物为了利用环境中的大分子底物(如淀粉、纤维素、 蛋白质等)而释放到胞外的,这样即使水解酶的胞外浓度很高,在细胞内这类酶仍能维持在 较低水平,所受到的调节和控制相对要少一些,因此许多野生菌种(如Gram阳性菌及霉菌等) 也能达到较高的产水解酶水平。胞内酶的作用是催化在细胞内发生的一系列反应,由于胞内 的代谢中间产物或终产物浓度都必须保持在适当的细胞生理浓度的范围内,催化这些反应 的酶活性或浓度必然会受到更多因素的调节和控制。因此如果要生产胞内酶,就必须研究它 们在合成过程中的调节和控制机理,找出解除调节和控制的方法,才能使胞内酶过量积累 9.2.1合成的基因水平调节和控制 9.2.1.1原核生物中酶合成的基因水平调节 在原核生物中,对蛋白质生物合成过程调节起关键作用的是mRNA,mRNA又受到转录的 控制,因此转录水平的调节是主要的,翻译水平的调节影响则比较小。原核生物的转录控制 主要通过操纵子( Operon)实现,在操纵子上有一个启动子( Promoter)位点,在开始转录前 RNA聚合酶与启动子结合。在起动子和酶的结构基因之间有一个调节区,它的作用是控制操 纵子转录的频率。调节区有如下两种形式
5 3） 微生物的筛选方法比较简单，而且已经很成熟，因此有可能在较短的时间内从成千 个菌株中筛选出高产菌种； 4） 同样的反应可以用来源于不同微生物所产的性质略有不同的酶催化，因此生物反应 器的操作条件选择具有一定的灵活性和适应性，以便与前后工序相配合； 5） 微生物发酵生产的酶比活高，有利于酶的分离和提纯。 正是由于以上优点, 利用微生物生产酶制剂大大降低了酶的生产成本, 提高了酶制剂 的生产能力, 从而推动了工业规模酶制剂生产和酶制剂应用的进展。 一般而言，水解酶都是胞外酶，而其它酶通常属于胞内酶。极大部分酶都属于结构(组 成)酶，即微生物的 DNA 分子中存在着编码该酶蛋白的基因，在细胞生长过程中就会产生这 些酶并参于细胞代谢过程，但是酶的产量受到细胞的调节和控制；其中有些属于诱导酶，即 需要在培养基中添加特殊的诱导剂才会产生的酶。野生微生物的产酶水平一般都不高,不能 直接用于酶制剂的工业化生产，必须进行菌种选育以提高产酶水平。 虽然每一种微生物的代谢过程都需要数以千计的酶参与，但是不是每一种微生物都适 合于酶的工业化生产。传统的产酶菌种都是从土壤中筛选得到的，首先获得具有产某种酶能 力的微生物，然后通过各种诱变育种方法提高它的产酶水平，直至达到工业化生产的要求。 对于产酶的菌种，一般应该符合如下的要求： 1） 菌种的遗传性能应该比较稳定； 2） 菌种具有较高的生长速率； 3） 除了蛋白酶生产菌种外，其它产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，以防止目标酶被 蛋白酶水解； 4） 目标酶制剂的产量较高。 随着分子生物学和重组 DNA 技术的发展，越来越多的酶已经知道了其氨基酸序列和空间 结构，因此可以通过基因重组获得基因工程菌生产酶制剂。 9.2 酶合成的调节和控制 酶是一种蛋白质。根据生物化学和分子生物学的研究, 蛋白质的合成是一个十分复杂 的过程, 涉及到三种 RNA(tRNA, mRNA 及 rRNA), 几种核苷酸(ATP, GTP 等), 一系列的酶和 蛋白辅助因子, 总共大约有 200 种细胞成分参与了蛋白质的合成过程。因此与蛋白质合成有 关的调节和控制因素都会影响酶的产量。微生物细胞产生的酶可以分为两大类: 胞外酶和胞 内酶。胞外酶一般都属于水解酶, 是微生物为了利用环境中的大分子底物(如淀粉、纤维素、 蛋白质等)而释放到胞外的, 这样即使水解酶的胞外浓度很高, 在细胞内这类酶仍能维持在 较低水平, 所受到的调节和控制相对要少一些, 因此许多野生菌种(如 Gram 阳性菌及霉菌等) 也能达到较高的产水解酶水平。胞内酶的作用是催化在细胞内发生的一系列反应, 由于胞内 的代谢中间产物或终产物浓度都必须保持在适当的细胞生理浓度的范围内, 催化这些反应 的酶活性或浓度必然会受到更多因素的调节和控制。因此如果要生产胞内酶, 就必须研究它 们在合成过程中的调节和控制机理, 找出解除调节和控制的方法, 才能使胞内酶过量积累。 9.2.1 酶合成的基因水平调节和控制 9.2.1.1 原核生物中酶合成的基因水平调节 在原核生物中, 对蛋白质生物合成过程调节起关键作用的是 mRNA, mRNA 又受到转录的 控制, 因此转录水平的调节是主要的, 翻译水平的调节影响则比较小。原核生物的转录控制 主要通过操纵子(Operon)实现, 在操纵子上有一个启动子(Promoter)位点, 在开始转录前 RNA 聚合酶与启动子结合。在起动子和酶的结构基因之间有一个调节区, 它的作用是控制操 纵子转录的频率。调节区有如下两种形式: