《工业微生物学》第三章 33微生物的培养方法 微生物培养就是提供一个适宜特定微生物生长的理化环境,使其大量地繁殖。微生 物培养的目的各有不同,有些是以大量增殖微生物菌体为目标(如单细胞蛋白或胞内产 物),有些则是希望在微生物生长的同时,实现目标代谢产物的大量积累。由于培养目 标的不同,在培养方法上也就存在许多差别。让所需的微生物大量繁殖,并进而产生大 量目标代谢产物的过程称为微生物发酵,这尤其是指工业上大规模的微生物培养。“培 养”和“发酵”两个概念经常是通用的,但它们与生物氧化中的“发酵”概念是截然不 同的。 从历史发展的角度来看,微生物培养技术的发展主要有以下特点 (1)从少量培养发展到大规模培养。 (2)从浅盘培养发展到厚层固体或深层(液体)培养。 (3)从以固体培养为主发展到以液体培养为主 (4)从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养 (5)从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养。 (6)从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞培养 (7)从单一微生物培养发展到混合微生物培养, (8)从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及“工程菌”。 总之,微生物培养的形式丰富多样,各具特色,各有所长。根据微生物种类、培养 目的和要求、规模和资金投入的不同可以有不同形式的培养装置。良好的装置应在提供 丰富而均匀的营养物质的基础上,保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所 需的良好通气条件(除少数厌氧菌外),此外,还要为微生物提供一个适宜的物理化学 条件和严密的防止杂菌污染的措施。以下是一些实验室和工厂中常见的微生物培养方 331固体培养( solid- state culture) 固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。微生物贴附在营养基质表面生 长,所以,又可称为表面培养( surface culture)。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和 保藏等方面发挥着重要作用。一些丝状真菌也可进行生产规模的固体发酵 3311实验室常见的固体培养 实验室主要有试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面等固体培养 方法用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。用接种针挑取原始培养物后,在 固体培养基表面划线接种,见图33.1(1,2,3)和图33,2。也可以用涂布棒将少量的液体 培养物涂布在整个固体培养基表面,或将少量液体培养物与融化后降温至50-60·℃的固 体培养基混匀,倒入培养皿中,浇注成平板。接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培 养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。 图331斜面接种和穿刺接种培养方法 斜面接种:1接种针火焰灼烧灭菌;2管口置近火焰处;3.用接种针蘸取菌样后,移到 斜面上划线;穿刺接种:4将蘸取菌样的穿刺接种针(头部无环)垂直插入固体培养基 内,再原路拔出 对微好氧微生物采取穿刺培养则更适宜于它们生长,见图3.3.1(4)。玻管中加入固 体培养基,灭菌后穿刺接种,然后塞上橡皮塞。越靠近培养基深处越缺氧,生长的菌厌
《工业微生物学》 第三章 1 3.3 微生物的培养方法 微生物培养就是提供一个适宜特定微生物生长的理化环境，使其大量地繁殖。微生 物培养的目的各有不同，有些是以大量增殖微生物菌体为目标（如单细胞蛋白或胞内产 物），有些则是希望在微生物生长的同时，实现目标代谢产物的大量积累。由于培养目 标的不同，在培养方法上也就存在许多差别。让所需的微生物大量繁殖，并进而产生大 量目标代谢产物的过程称为微生物发酵，这尤其是指工业上大规模的微生物培养。“培 养”和“发酵”两个概念经常是通用的，但它们与生物氧化中的“发酵”概念是截然不 同的。 从历史发展的角度来看，微生物培养技术的发展主要有以下特点： （1）从少量培养发展到大规模培养。 （2）从浅盘培养发展到厚层固体或深层（液体）培养。 （3）从以固体培养为主发展到以液体培养为主。 （4）从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养。 （5）从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养。 （6）从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞培养。 （7）从单一微生物培养发展到混合微生物培养。 （8）从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及“工程菌”。 总之，微生物培养的形式丰富多样，各具特色，各有所长。根据微生物种类、培养 目的和要求、规模和资金投入的不同可以有不同形式的培养装置。良好的装置应在提供 丰富而均匀的营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所必 需的良好通气条件（除少数厌氧菌外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学 条件和严密的防止杂菌污染的措施。以下是一些实验室和工厂中常见的微生物培养方 法： 3.3.1 固体培养（solid-state culture） 固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。微生物贴附在营养基质表面生 长，所以，又可称为表面培养(surface culture）。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和 保藏等方面发挥着重要作用。一些丝状真菌也可进行生产规模的固体发酵。 3.3.1.1 实验室常见的固体培养 实验室主要有试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面等固体培养 方法用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。用接种针挑取原始培养物后，在 固体培养基表面划线接种，见图 3.3.1(1,2,3) 和图 3.3.2。也可以用涂布棒将少量的液体 培养物涂布在整个固体培养基表面，或将少量液体培养物与融化后降温至 50~60℃的固 体培养基混匀，倒入培养皿中，浇注成平板。接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培 养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。 图 3.3.1 斜面接种和穿刺接种培养方法 斜面接种：1.接种针火焰灼烧灭菌；2.管口置近火焰处；3. 用接种针蘸取菌样后，移到 斜面上划线；穿刺接种：4.将蘸取菌样的穿刺接种针（头部无环）垂直插入固体培养基 内，再原路拔出 对微好氧微生物采取穿刺培养则更适宜于它们生长，见图 3.3.1(4)。玻管中加入固 体培养基，灭菌后穿刺接种，然后塞上橡皮塞。越靠近培养基深处越缺氧，生长的菌厌
《工业微生物学》第三章 氧程度越高 对厌氧菌培养必需创造更严格的无氧环境。一种方法是在斜面接种后,将培养管棉 塞上部截去或用火点着烧掉,用玻璃棒将管内部分的棉花压至离培养基lcm处,棉塞上 方再压入一含水的脱脂棉,加入1:1比例混合的焦性没食子酸和碳酸钠粉末,立即加上 橡胶塞。焦性没食子酸和碳酸钠在有水的情况下,缓慢作用,吸收氧气,放出CO2,造 成无氧环境,见图3.3.3。也可将厌氧微生物固体培养物放在真空干燥器内,用泵排出其 中的空气,并可进一步向其中充入氮气或95%氮气和5%二氧化碳的混合气体,再放置 一定的温度环境中培养 在划线起点 长出菌苔 在划线末端 单菌落 (b) 图33.2.平板划线培养方法 (a)平板划线的过程:1用接种针蘸取菌样;2在平板固体培养基表面划线;(b)平板 划线培养结果:在划线的起点,菌落相互重叠,在划线的末端,逐渐出现单菌落 未折前铝帽 升丁基橡胶塞 棉塞璃棒 橡胶塞 折后铝帽 塞入的橡胶塞 焦性没食子酸 湿棉球 厌氧培养物 无氧气相 固体培养基 吸氧反应 厌氧菌单菌落 图333一种厌氧菌的斜面培养法 图334 Hungate滚管技术 中的厌氧试管的剖面图 针对厌氧微生物有人采用一些专用的培养装置,如 (1) Hungate滚管技术主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮,并用高纯氮驱除小环 境中的空气,使培养基的配制、分装、灭菌和储存,以及菌种的接种、培养、观察、分 离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧的条件下,从而保证了厌氧菌的存活。用这种 方法制备的培养基称为预还原无氧灭菌培养基。将菌接种到融化的培养基中,然后将特 制的试管(见图3.34)用丁基橡胶塞严密塞住后平放,置冰浴中均匀滚动,使含菌的培 养基布满在试管的内表面,犹如好氧菌在培养基平板表面一样,最后长出许多单菌落。 (2)厌氧培养皿用于厌氧培养的培养皿有几种设计:有的利用皿盖创造了一个狭窄的 空间,加上含有还原剂的培养基,达到无氧的培养目的(例如 Brewer皿,见图33.4) 有的利用皿底有两个相互隔开的空间,其中一个放焦性没食子酸,另一个放NaOH溶液
《工业微生物学》 第三章 2 氧程度越高。 对厌氧菌培养必需创造更严格的无氧环境。一种方法是在斜面接种后，将培养管棉 塞上部截去或用火点着烧掉，用玻璃棒将管内部分的棉花压至离培养基 1cm 处，棉塞上 方再压入一含水的脱脂棉，加入 1:1 比例混合的焦性没食子酸和碳酸钠粉末，立即加上 橡胶塞。焦性没食子酸和碳酸钠在有水的情况下，缓慢作用，吸收氧气，放出 CO2，造 成无氧环境，见图 3.3.3。也可将厌氧微生物固体培养物放在真空干燥器内，用泵排出其 中的空气，并可进一步向其中充入氮气或 95%氮气和 5%二氧化碳的混合气体，再放置 一定的温度环境中培养。 (a) (b) 图 3.3.2. 平板划线培养方法 (a) 平板划线的过程：1.用接种针蘸取菌样；2. 在平板固体培养基表面划线；(b) 平板 划线培养结果：在划线的起点，菌落相互重叠，在划线的末端，逐渐出现单菌落 图 3.3.3 一种厌氧菌的斜面培养法 图.3.3.4Hungate 滚管技术 中的厌氧试管的剖面图 针对厌氧微生物有人采用一些专用的培养装置，如： （1）Hungate 滚管技术 主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环 境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和储存，以及菌种的接种、培养、观察、分 离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧的条件下，从而保证了厌氧菌的存活。用这种 方法制备的培养基称为预还原无氧灭菌培养基。将菌接种到融化的培养基中，然后将特 制的试管（见图 3.3.4）用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌的培 养基布满在试管的内表面，犹如好氧菌在培养基平板表面一样，最后长出许多单菌落。 （2）厌氧培养皿 用于厌氧培养的培养皿有几种设计：有的利用皿盖创造了一个狭窄的 空间，加上含有还原剂的培养基，达到无氧的培养目的（例如 Brewer 皿，见图 3.3.4）； 有的利用皿底有两个相互隔开的空间，其中一个放焦性没食子酸，另一个放 NaOH 溶液
《工业微生物学》 待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后,立即密闭。摇动使焦性没食子酸和NaOH溶液 接触,发生吸氧反应,从而造成无氧环境(例如 Spray皿和Bray皿,见图33.5)。 皿盖 焦性没食子酸 琼脂平板 狭窄空间 NaOH 焦性没食子酸 琼脂平板 Brewer皿 Spray皿 图33.5三钟厌氧培养皿 3)厌氧罐厌氧罐的类型很多,一般都有一个用聚碳酸酯制成的透明罐体,上面是一 个用螺旋夹紧密夹住的罐盖,盖内的中央有不锈钢丝织成的网袋,内放钯催化剂。罐内 放有含美蓝的氧化还原指示剂,见图33.6。使用时,先装入待培养物,然后密闭罐盖 接着抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气体(N:CO2:H2=8010:I0ⅴ/V 罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下,可被灌入的混合气体中的H2还原成水,从而造成 很高的无氧状态。真空度低于26664Pa(20mmHg)时,指示剂美蓝被还原成无色。罐内 一般可以放10只培养皿或其它液体培养物。也可以在罐内放入商品化的“ Gaspak”产 气袋,将袋口剪开一只角,加入适量的水后,即会自动放出H2和CO 螺旋夹钯催化剂粒 带0形垫的盖 充满无氧空气 厌氧度指示剂 (美蓝) 倒置的培养皿 物料进出口 图3.3.6厌氧罐的一般构造 图3.37手套厌氧箱的一般构造 (4)厌氧手套箱( anaerobic glove box)手套箱是由透明的材料制成的箱式结构,箱体结 构严密,可以通过与箱壁相连的手套进行箱内的操作。箱内充满85%氮气、5%二氧化 碳和10%的氢气,同时,还用钯催化剂清除氧气,使箱内保持严格的无氧状态。物料可 以通过特殊的交换室进出,见图3.3.7 3312生产中常见的固体培养 在生产实践中,好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容 器的表面,这样,既可使菌体获得充足的氧气,又可以将生长过程中产生的热量及时释 改,这就是传统的曲法培养的基本原理 固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮。将麸皮和水混合,必要时添加一些辅 助的营养物和缓冲剂,灭菌后待冷却到合适温度便可接种。疏松的麸皮培养基的多孔结 构便于空气透入,为好氧微生物提供生长必需的氧气。这时,固体培养基中的含水量控 制在40%-80%之间(典型的液体培养基含水量在95%以上),细菌和酵母菌将无法忍受 如此低水含量的环境,所以,固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。这也是
《工业微生物学》 第三章 3 待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭。摇动使焦性没食子酸和 NaOH 溶液 接触，发生吸氧反应，从而造成无氧环境（例如 Spray 皿和 Bray 皿，见图 3.3.5）。 图 3.3.5 三钟厌氧培养皿 （3）厌氧罐 厌氧罐的类型很多，一般都有一个用聚碳酸酯制成的透明罐体，上面是一 个用螺旋夹紧密夹住的罐盖，盖内的中央有不锈钢丝织成的网袋，内放钯催化剂。罐内 放有含美蓝的氧化还原指示剂，见图 3.3.6。使用时，先装入待培养物，然后密闭罐盖， 接着抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气体（N2:CO2:H2 = 80:10:10V/V)。 罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下，可被灌入的混合气体中的 H2 还原成水，从而造成 很高的无氧状态。真空度低于 266.64Pa(20mmHg)时，指示剂美蓝被还原成无色。罐内 一般可以放 10 只培养皿或其它液体培养物。也可以在罐内放入商品化的“Gaspak”产 气袋，将袋口剪开一只角，加入适量的水后，即会自动放出 H2 和 CO2。 图 3.3.6 厌氧罐的一般构造 图 3.3.7 手套厌氧箱的一般构造 (4) 厌氧手套箱（anaerobic glove box）手套箱是由透明的材料制成的箱式结构，箱体结 构严密，可以通过与箱壁相连的手套进行箱内的操作。箱内充满 85% 氮气、5%二氧化 碳和 10%的氢气，同时，还用钯催化剂清除氧气，使箱内保持严格的无氧状态。物料可 以通过特殊的交换室进出，见图 3.3.7。 3.3.1.2 生产中常见的固体培养 在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容 器的表面，这样，既可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释 放，这就是传统的曲法培养的基本原理。 固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮。将麸皮和水混合，必要时添加一些辅 助的营养物和缓冲剂，灭菌后待冷却到合适温度便可接种。疏松的麸皮培养基的多孔结 构便于空气透入，为好氧微生物提供生长必需的氧气。这时，固体培养基中的含水量控 制在 40%~80%之间（典型的液体培养基含水量在 95%以上），细菌和酵母菌将无法忍受 如此低水含量的环境，所以，固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。这也是
《工业微生物学》第三章 生产实践中固体培养主要用于霉菌进行食品酿造及其酶制剂生产的原因。 进行固体培养的设备有较浅的曲盘、转鼓和通风曲槽等。接种时用的种子可以通过 逐级扩大培养获得。将接好种的麸皮培养基在曲盘里铺成薄层,就可放在有温度控制的 培养室(曲房)内培养。目前,一些酶制剂的工业生产仍采用此方法。也可以将接种后 的培养基放到缓慢转动的转鼓内培养。图3.3.8是以米为原料,米曲霉( Aspergillu onηze)固体培养生产日本酒曲的转鼓装置示意图。清洗、蒸煮、接种、固体翻松、水 的喷淋、冷却、空气循环、过滤和排气等所有操作都在该装置上完成。 输出管 加热器 水喷淋头 输入管 观察孔 「日= ====== 3#书蒸汽管 网板 图338转鼓式自动固体培养装置示意图 通风曲槽的机械化程度和生产效率比较高。它一般是一个面积10m2左右的曲槽, 曲槽上有曲架和适当材料编织成的筛板,筛板上可摊一层较厚(30cm左右)的曲料, 曲架下部不断通以低温、潮湿的新鲜过滤空气,进行半无菌的固体培养,见图3.3.9。酱 油酿造和酒精发酵等一般都能用此方法 生产实践中对厌氧菌固体培养的例子还不多见。在我国传统的白酒生产中,一向用 大型深层地窖进行堆积式的固体发酵。虽然其中的酵母菌为兼性厌氧菌,但也可以算作 厌氧固体发酵的例子。 总之,固体培养的设备简单,生产成本低,但是pH、溶解氧和温度等不易控制, 耗费劳动力较多,占地面积大,容易污染,生产规模难以扩大 图3.39通风曲槽结构模式图 1曲床;2风道;3鼓风机;4电动机;5.入风口;6天窗;7帘子;8曲料;9.曲槽罩 332液体培养 liquid- state culture)
《工业微生物学》 第三章 4 生产实践中固体培养主要用于霉菌进行食品酿造及其酶制剂生产的原因。 进行固体培养的设备有较浅的曲盘、转鼓和通风曲槽等。接种时用的种子可以通过 逐级扩大培养获得。将接好种的麸皮培养基在曲盘里铺成薄层，就可放在有温度控制的 培养室（曲房）内培养。目前，一些酶制剂的工业生产仍采用此方法。也可以将接种后 的培养基放到缓慢转动的转鼓内培养。图 3.3.8 是以米为原料，米曲霉（ Asperigillus oryzae）固体培养生产日本酒曲的转鼓装置示意图。清洗、蒸煮、接种、固体翻松、水 的喷淋、冷却、空气循环、过滤和排气等所有操作都在该装置上完成。 图 3.3.8 转鼓式自动固体培养装置示意图 通风曲槽的机械化程度和生产效率比较高。它一般是一个面积 10m2 左右的曲槽， 曲槽上有曲架和适当材料编织成的筛板，筛板上可摊一层较厚（30cm 左右）的曲料， 曲架下部不断通以低温、潮湿的新鲜过滤空气，进行半无菌的固体培养，见图 3.3.9。酱 油酿造和酒精发酵等一般都能用此方法。 生产实践中对厌氧菌固体培养的例子还不多见。在我国传统的白酒生产中，一向用 大型深层地窖进行堆积式的固体发酵。虽然其中的酵母菌为兼性厌氧菌，但也可以算作 厌氧固体发酵的例子。 总之，固体培养的设备简单，生产成本低，但是 pH、溶解氧和温度等不易控制， 耗费劳动力较多，占地面积大，容易污染，生产规模难以扩大。 图 3.3.9 通风曲槽结构模式图 1.曲床；2.风道；3.鼓风机；4.电动机；5.入风口；6.天窗；7.帘子；8.曲料；9. 曲槽罩 3.3.2 液体培养(liquid-state culture）
《工业微生物学》 液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。由于大多数发酵微生物是好 氧性的,而且微生物只能利用溶解氧,所以,如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度 至关重要。常温(20℃)常压下达到平衡时,氧在水中的溶解度仅为62ml/(028mmol) 这些氧只能保证氧化8.3mg(0046mmol)葡萄糖,仅相当于培养基中常用葡萄糖浓度的 1%。除葡萄糖外,培养基中的无机或有机养分一般都可保证微生物使用几小时至数天 所以,对好氧菌而言,生长的限制因子几乎总是氧。在好氧微生物静止培养中常常将培 养液装成浅层进行浅层液体培养( shallow liquid culture),使氧不至于成为限制因子。但 大多数液体培养都是采用更先进的深层培养( submerged culture)。 液体培养中,一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率。 具体可采取以下措施 (1)浅层液体培养 (2)利用摇床作三角瓶的振荡培养。 (3)从深层液体培养器底部通入加压空气,并用气体分布器使空气以小气泡形式均匀 喷出。 (4)对培养液进行机械搅拌,并在培养器壁上设置挡扳,以降低气泡直径,增加相界 面积。 (5)提高罐压。 3321实验室常见的液体培养 在实验室进行好氧菌液体培养的方法主要有四类 (1)试管液体培养 此法的通气效果一般较差,仅适用于培养兼性厌氧菌,以及进行微生物的各种生理 生化试验 (2)浅层液体培养 在三角烧瓶中装入浅层培养液,其通气量与装裝液量、棉塞通气程度密切相关。通气 量对微生物的生长速度和生长量有很大关系,该方法一般也仅适于兼性厌氧菌 (3)摇瓶培养( shaking flask culture) 将装有液体培养基的三角瓶(摇瓶),上盖8~12层纱布或用疏松的棉塞塞住以阻止 空气中杂菌或杂质进入瓶内,而空气可以透过棉塞供微生物呼吸之用。为使菌体获得充 足的氧,一般装液量为三角瓶的10%以下,如250m三角瓶装10-20ml培养液。有时, 为提高搅拌效果,増加通气量,也可在三角瓶内设置挡板或添加玻璃珠等。将摇瓶放在 摇瓶机(摇床)上以一定速度保温振荡培养。摇床有旋转式和往复式二类。摇瓶培养不 仅操作简便,而且可以将许多摇瓶(在大摇床上可多达上百个)同时在相同的温度和振 荡速度等条件下进行培养试验。还采用适当的传感器可以随时监测微生物生长过程中的 各种变化。摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等, 也常在发酵工业中用于种子培养。 (4)台式发酵罐 实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。商品发酵罐的种类很多。一般都有多 种自动控制和记录装置。如配置有pH、溶解氧、温度和泡沫检测电极,有加热或冷却 装置,有补料、消泡和pH调节用的酸或碱储罐及其自动记录装置,甚至计算机控制 因为它的结构与生产用的大型发酵罐接近,所以,它是实验室模拟生产实践的试验工具 见图3.3.10。 实验室中,用液体培养基进行厌氧菌培养时,一般采用加有机还原剂(如巯基乙醇、 半胱氨酸、维生素C等)或无机还原剂(铁丝等)的深层液体培养基,其上方封以凡士 林-石蜡层,以保证氧化还原电位Eh°保持在-150mV~-420mV的范围内。如放在厌氧罐 中培养,则效果更好
《工业微生物学》 第三章 5 液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。由于大多数发酵微生物是好 氧性的，而且微生物只能利用溶解氧，所以，如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度 至关重要。常温（20℃）常压下达到平衡时，氧在水中的溶解度仅为 6.2ml/L(0.28mmol)。 这些氧只能保证氧化 8.3mg(0.046mmol）葡萄糖，仅相当于培养基中常用葡萄糖浓度的 1%。除葡萄糖外，培养基中的无机或有机养分一般都可保证微生物使用几小时至数天。 所以，对好氧菌而言，生长的限制因子几乎总是氧。在好氧微生物静止培养中常常将培 养液装成浅层进行浅层液体培养（shallow liquid culture），使氧不至于成为限制因子。但 大多数液体培养都是采用更先进的深层培养（submerged culture)。 液体培养中，一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率。 具体可采取以下措施： （1）浅层液体培养。 （2）利用摇床作三角瓶的振荡培养。 （3）从深层液体培养器底部通入加压空气，并用气体分布器使空气以小气泡形式均匀 喷出。 （4） 对培养液进行机械搅拌，并在培养器壁上设置挡扳，以降低气泡直径，增加相界 面积。 （5）提高罐压。 3.3.2.1 实验室常见的液体培养 在实验室进行好氧菌液体培养的方法主要有四类。 (1) 试管液体培养 此法的通气效果一般较差，仅适用于培养兼性厌氧菌，以及进行微生物的各种生理 生化试验。 (2) 浅层液体培养 在三角烧瓶中装入浅层培养液，其通气量与装液量、棉塞通气程度密切相关。通气 量对微生物的生长速度和生长量有很大关系，该方法一般也仅适于兼性厌氧菌。 (3) 摇瓶培养（shaking flask culture） 将装有液体培养基的三角瓶（摇瓶），上盖 8~12 层纱布或用疏松的棉塞塞住以阻止 空气中杂菌或杂质进入瓶内，而空气可以透过棉塞供微生物呼吸之用。为使菌体获得充 足的氧，一般装液量为三角瓶的 10%以下，如 250ml 三角瓶装 10~20ml 培养液。有时， 为提高搅拌效果，增加通气量，也可在三角瓶内设置挡板或添加玻璃珠等。将摇瓶放在 摇瓶机（摇床）上以一定速度保温振荡培养。摇床有旋转式和往复式二类。摇瓶培养不 仅操作简便，而且可以将许多摇瓶（在大摇床上可多达上百个）同时在相同的温度和振 荡速度等条件下进行培养试验。还采用适当的传感器可以随时监测微生物生长过程中的 各种变化。摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等， 也常在发酵工业中用于种子培养。 (4) 台式发酵罐 实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。商品发酵罐的种类很多。一般都有多 种自动控制和记录装置。如配置有 pH、溶解氧、温度和泡沫检测电极，有加热或冷却 装置，有补料、消泡和 pH 调节用的酸或碱储罐及其自动记录装置，甚至计算机控制。 因为它的结构与生产用的大型发酵罐接近，所以，它是实验室模拟生产实践的试验工具， 见图 3.3.10。 实验室中，用液体培养基进行厌氧菌培养时，一般采用加有机还原剂（如巯基乙醇、 半胱氨酸、维生素 C 等）或无机还原剂（铁丝等）的深层液体培养基，其上方封以凡士 林-石蜡层，以保证氧化还原电位 Eh 0 保持在-150mV~-420mV 的范围内。如放在厌氧罐 中培养，则效果更好