第八章核苷、核苷酸及其类似物的微生物发酵 8.1引言 人们发现许多核苷酸类物质都具有强化食品风味的功能,因此利用微生物发酵生产核 苷和核苷酸的主要应用领域是在食品工业中作为风味强化剂。按强化能力的大小次序排列 为:鸟嘌呤核苷酸(5ˆ-GMP)肌苷酸5'-IMP)黄嘌呤核苷酸(5-XMP)。同时还发现当5·GMP 或5IMP的钠盐与谷氨酸钠合用时具有协同强化作用。而5-AMP及其2-和3-的异构体、 5-脱氧核糖核苷酸、核苷及嘧啶类核苷酸则没有强化功能。核苷、核苷酸及其衍生物的另 一重要应用领域是用于临床治疗药物,嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤和6-巯基嘌呤具有与抗生素 类似的功能,可以抑制癌细胞的生长;9-β-D阿拉伯呋喃糖基腺苷聚肌胞则能用于治疗疱疹 S-腺苷蛋氨酸及其盐类用于治疗帕金森氏症、失眠并具有消炎镇痛作用。此外核苷酸在农业 上也有良好的应用前景,用核苷酸及其衍生物进行浸种、蘸根及喷雾,可以提高农作物的产 量。一些重要的核苷、核苷酸及相关产物见表8.1.1。 表8.11一些重要的核苷、核苷酸及相关产物 估计年产量,吨/年 用途 5IMP(肌苷酸) 3000 食品添加剂 5-GMP(鸟苷酸) 2.000 食品添加剂 Inosine(肌苷) 500 心脏病 胞苷二磷酸-胆碱 强心剂 AIP(三磷酸腺苷) 200 肌肉营养不良 FAD黄素腺嘌呤二核苷酸) 少量生产 肝或肾病 NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 少量生产 开或肾病 腺嘌呤 少量生产白细胞减少 腺苷 少量生产 冠状缺陷、咽炎、高血压、动脉硬化 5-AMP(腺苷单磷酸) 少量生产 循环系统疾病、风湿症 CAMP(环腺苷单磷酸 少量生产 糖尿病、气喘、癌症等 乳清酸 少量生产 6氮尿苷 少量生产 癌症 目前工业上主要通过RNA的酶法水解生产核苷酸。RNA的来源很广,如啤酒厂的废 酵母、单细胞蛋白及其它发酵工业的废菌体等,其中以酵母中提取RNA最为常见。有时还 专门培养高RNA含量的酵母供提取核苷酸生产之用。细菌、酵母及霉菌中的DNA及RNA 含量列于表832。RNA水解酶一般来自于 Penicillium citrinum和 Streptomyces aureus这两 个菌种的突变株。提取工艺包括细胞破碎、核酸水解及核苷酸分离等步骤。六十年代初RNA 酶法水解生产核苷酸在日本投入了工业化生产。 表832细菌、酵母及霉菌中的DNA及RNA含量 微生物 DNA含量,% RNA含量,% 细菌 0.37-4.5 0.03-0.52 2.5-15
1 第八章 核苷、核苷酸及其类似物的微生物发酵 8. 1 引言 人们发现许多核苷酸类物质都具有强化食品风味的功能，因此利用微生物发酵生产核 苷和核苷酸的主要应用领域是在食品工业中作为风味强化剂。按强化能力的大小次序排列 为：鸟嘌呤核苷酸(5’-GMP)>肌苷酸(5’-IMP)>黄嘌呤核苷酸(5’-XMP)。同时还发现当 5’-GMP 或 5’-IMP 的钠盐与谷氨酸钠合用时具有协同强化作用。而 5’-AMP 及其 2’-和 3’-的异构体、 5’-脱氧核糖核苷酸、核苷及嘧啶类核苷酸则没有强化功能。核苷、核苷酸及其衍生物的另 一重要应用领域是用于临床治疗药物，嘌呤类似物 8-氮鸟嘌呤和 6-巯基嘌呤具有与抗生素 类似的功能，可以抑制癌细胞的生长；9--D-阿拉伯呋喃糖基腺苷聚肌胞则能用于治疗疱疹； S-腺苷蛋氨酸及其盐类用于治疗帕金森氏症、失眠并具有消炎镇痛作用。此外核苷酸在农业 上也有良好的应用前景，用核苷酸及其衍生物进行浸种、蘸根及喷雾，可以提高农作物的产 量。一些重要的核苷、核苷酸及相关产物见表 8.1.1。 表 8. 1.1 一些重要的核苷、核苷酸及相关产物 名称 估计年产量，吨/年 用途 5’-IMP(肌苷酸) 3, 000 食品添加剂 5’-GMP(鸟苷酸) 2, 000 食品添加剂 Inosine(肌苷) 500 心脏病 胞苷二磷酸-胆碱 4 强心剂 ATP(三磷酸腺苷) 200 肌肉营养不良 FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸) 少量生产 肝或肾病 NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 少量生产 肝或肾病 腺嘌呤 少量生产 白细胞减少 腺苷 少量生产 冠状缺陷、咽炎、高血压、动脉硬化 5’-AMP(腺苷单磷酸) 少量生产 循环系统疾病、风湿症 CAMP(环腺苷单磷酸) 少量生产 糖尿病、气喘、癌症等 乳清酸 少量生产 肝病 6-氮尿苷 少量生产 癌症 目前工业上主要通过 RNA 的酶法水解生产核苷酸。RNA 的来源很广，如啤酒厂的废 酵母、单细胞蛋白及其它发酵工业的废菌体等，其中以酵母中提取 RNA 最为常见。有时还 专门培养高 RNA 含量的酵母供提取核苷酸生产之用。细菌、酵母及霉菌中的 DNA 及 RNA 含量列于表 8.3.2。RNA 水解酶一般来自于 Penicillium citrinum 和 Streptomyces aureus 这两 个菌种的突变株。提取工艺包括细胞破碎、核酸水解及核苷酸分离等步骤。六十年代初 RNA 酶法水解生产核苷酸在日本投入了工业化生产。 表 8.3.2 细菌、酵母及霉菌中的 DNA 及 RNA 含量 微生物 DNA 含量，% RNA 含量，% 细菌 0.37-4.5 5-25 酵母 0.03-0.52 2.5-15
霉菌 0.15-3.3 0.7-28 有些核苷及核苷酸类产品采用直接发酵法生产,如肌苷、5-IMP和5-GM等。本章将 主要讨论直接发酵生产核苷及核苷酸的微生物、代谢途径和调控机制。 8.2核苷酸的代谢机理 82.1嘌呤类核苷酸的生物合成途径及调节机制 核苷酸是细胞内合成RNA及DNA的基本结构单元,在正常的细胞代谢中将保持在 定的生理浓度范围内。要使微生物能够过量产生核苷酸或核苷就必需掌握它们的代谢途径和 调节机理,有目的地对微生物进行诱变和筛选,才能获得高产菌株。图8.2.1显示了在 Bacillus subtilis中嘌呤类核苷酸的生物合成途径及调节机制。IMP是GMP和AM生物合成的前体 由于胞内IMP脱氢酶的比活要比腺苷琥珀酸合成酶的比活高10-30倍,IMP主要转化为 GMP。但是,IMP脱氢酶又受到XMP和GMP的反馈抑制和阻遏,而GMP合成酶则基本 上不受GMP的影响,这样当GMP浓度较高时,IMP就会转化为AMP。AMP的合成主要 受到AMP对磷酸核苷高磷酸(PRP)酰胺基转化酶反馈抑制的调节,只要02mM的AMP 就能使PRPP酰胺基转化酶的比活降低50%,而达到同样抑制作用的GMP浓度需要2mM AMP对腺苷基琥珀酸合成酶和腺苷基琥珀酸裂解酶也存在着反馈抑制。 5-磷酸核糖焦磷酸〔PRPP〕 磷酸核糖胺〔FRA〕 1-〔5′-磷酸核糖〕-4-〔-}-琥珀酰羧基酰胺〕 -5-氨基咪唑〔 SAICARP〕 5-氨基-1-〔5′-磷酸核糖〕-咪唑-4-羧基酰胺〔 AICARP 肛苷酸〔IMP〕 2 黄苷酸〔MP〕 號珀酰-腺苷睃〔S-AMP 鸟嘌呤核苷〔GMP〕 腺苷酸〔AMP 图8.2.1在 Bacillus subtilis中嘌呤核苷酸生物合成途经及其调节机制 l:PRPP酰胺基转移酶;2:IMP脱氢酶;3:腺苷基琥珀酸 合成酶:4:GMP合成酶;5:腺苷基琥珀酸裂解酶 822嘧啶核苷酸的生物合成途径和调节机制 图822显示了嘧啶核苷酸的生物合成途径和调节机制。从图中可以看到,嘧啶核苷酸 是从NH3、CO2和ATP合成氨基甲酰磷酸开始,再与天冬氨酸结合生成氨基甲酰天东氨酸, 经闭环后生成二氢乳清酸,从而形成了嘧啶环。乳清酸进一步与PRP反应生成乳清核苷-5- 磷酸,再经过脱羧反应生成5-UMP,5-UMP经磷酸化后依次生成5-UDP及5·UTP,后
2 霉菌 0.15-3.3 0.7-28 有些核苷及核苷酸类产品采用直接发酵法生产，如肌苷、5’-IMP 和 5’-GM 等。本章将 主要讨论直接发酵生产核苷及核苷酸的微生物、代谢途径和调控机制。 8. 2 核苷酸的代谢机理 8.2.1 嘌呤类核苷酸的生物合成途径及调节机制 核苷酸是细胞内合成 RNA 及 DNA 的基本结构单元，在正常的细胞代谢中将保持在一 定的生理浓度范围内。要使微生物能够过量产生核苷酸或核苷就必需掌握它们的代谢途径和 调节机理，有目的地对微生物进行诱变和筛选，才能获得高产菌株。图 8.2.1 显示了在 Bacillus subtilis 中嘌呤类核苷酸的生物合成途径及调节机制。IMP 是 GMP 和 AMP 生物合成的前体， 由于胞内 IMP 脱氢酶的比活要比腺苷琥珀酸合成酶的比活高 10-30 倍，IMP 主要转化为 GMP。但是，IMP 脱氢酶又受到 XMP 和 GMP 的反馈抑制和阻遏，而 GMP 合成酶则基本 上不受 GMP 的影响，这样当 GMP 浓度较高时，IMP 就会转化为 AMP。AMP 的合成主要 受到 AMP 对磷酸核苷高磷酸（PRPP）酰胺基转化酶反馈抑制的调节，只要 0.2mM 的 AMP 就能使 PRPP 酰胺基转化酶的比活降低 50%，而达到同样抑制作用的 GMP 浓度需要 2mM。 AMP 对腺苷基琥珀酸合成酶和腺苷基琥珀酸裂解酶也存在着反馈抑制。 图 8. 2. 1 在 Bacillus subtilis 中嘌呤核苷酸生物合成途经及其调节机制 1：PRPP 酰胺基转移酶；2：IMP 脱氢酶；3：腺苷基琥珀酸 合成酶；4：GMP 合成酶；5：腺苷基琥珀酸裂解酶 8.2.2 嘧啶核苷酸的生物合成途径和调节机制 图 8.2.2 显示了嘧啶核苷酸的生物合成途径和调节机制。从图中可以看到，嘧啶核苷酸 是从 NH3、CO2 和 ATP 合成氨基甲酰磷酸开始，再与天冬氨酸结合生成氨基甲酰天东氨酸， 经闭环后生成二氢乳清酸，从而形成了嘧啶环。乳清酸进一步与 PRPP 反应生成乳清核苷-5’- 磷酸，再经过脱羧反应生成 5’-UMP，5’-UMP 经磷酸化后依次生成 5’-UDP 及 5’-UTP，后
者按如下反应生成5CIP: 5’-UTP+NH3+AIP 5’CTP+ADP+Pi 在嘧啶核苷酸的生物合成途径中,主要的调节酶是天冬氨酸转氨基甲酰酶。它是一个变 构酶,受到CTP的强烈反馈抑制,UMP、UDP及UTP也对该酶具有抑制作用,ATP则对 它有激活作用,因此ATP的存在对CTP的抑制具有拮抗作用。 Co2h ATP ADP 天冬氨酸Pi NH CH2 HoN-COOPO 氮基甲醱瞵氨基甲酰磺酸天冬氨酸转 酸合成酶 基甲 反馈抑制 A氮基甲酰天冬氨酸 二氢乳消酸 氢乳 ○ATP激活 酸脱氢醇 ADP ATP ADP ATPCO 已乳消酸6酸核OH UTP 谷氨酰胺 核苷二6核苷单婿孔核甘CoCH 苷酸酸激 谷氨酸台成 PRPP H203F0H2 2 乳消酸 HH/、核糖5 乳氢核苷-5-6酸 RP-0-P-0-P 胞苷三磷酸 图822嘧啶核苷酸的生物合成途径及调节 83核苷酸类物质生产菌的分离和选育 83.1核苷酸类物质生产菌的分离 从野生菌中直接筛选核苷及核苷酸生产菌的方法主要有生长圈法和特殊平板培养法 83.1.1生长圈法 用生长圈法筛选核苷酸产生菌的机理是利用核苷酸产生菌能够促进嘌呤营养缺陷型大 肠杄菌生长,因而能形成较大的生长圈。具体方法是将非精确的嘌呤营养缺陷型大肠杆菌(如 E. Coli p64或B94)与不含嘌呤的琼脂混合后倒成平板,在平板表面涂布受检的细菌,在- 定条件下培养。如果被检菌能够产生嘌呤类产物,在其周围形成生长圈,然后挑选生长圈较 大的菌落进行进一步的鉴定后作为诱变育种的出发菌株 也可以将被检菌株先在平板上培养,出现菌落时用紫外线照射杀菌。再用鸟嘌呤营养缺 陷型的枯草杄菌的固体培养基覆盖于平板上,经过一定温度下的保温培养,如果发现能够生 长的突变株,就说明它能够产生核苷类物质 8312特殊平板培养法 采用含有高浓度的磷酸盐、镁盐、葡萄糖和锰盐的琼脂平板培养基也能用于筛选产核苷 酸类物质的微生物,具体的筛选步骤如下: 1)采集哺乳动物、鸟类的粪和土壤样品。 2)分离培养基的成分为(%):葡萄糖10,琼脂20,KHPO41.0,MgSO47H2O10,CaCl2H2O 0.01,FeSO47H2O0.001,MnSO4H2O0.0001生物素30μg/L,泛酸钙10mg/L,硫胺素盐
3 者按如下反应生成 5’-CTP： 5’-UTP + NH3 + ATP 5’-CTP + ADP + Pi 在嘧啶核苷酸的生物合成途径中，主要的调节酶是天冬氨酸转氨基甲酰酶。它是一个变 构酶，受到 CTP 的强烈反馈抑制，UMP、UDP 及 UTP 也对该酶具有抑制作用，ATP 则对 它有激活作用，因此 ATP 的存在对 CTP 的抑制具有拮抗作用。 图 8.2.2 嘧啶核苷酸的生物合成途径及调节 8.3 核苷酸类物质生产菌的分离和选育 8.3.1 核苷酸类物质生产菌的分离 从野生菌中直接筛选核苷及核苷酸生产菌的方法主要有生长圈法和特殊平板培养法。 8.3.1.1 生长圈法 用生长圈法筛选核苷酸产生菌的机理是利用核苷酸产生菌能够促进嘌呤营养缺陷型大 肠杆菌生长，因而能形成较大的生长圈。具体方法是将非精确的嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如 E. Coli P64 或 B94）与不含嘌呤的琼脂混合后倒成平板，在平板表面涂布受检的细菌，在一 定条件下培养。如果被检菌能够产生嘌呤类产物，在其周围形成生长圈，然后挑选生长圈较 大的菌落进行进一步的鉴定后作为诱变育种的出发菌株。 也可以将被检菌株先在平板上培养，出现菌落时用紫外线照射杀菌。再用鸟嘌呤营养缺 陷型的枯草杆菌的固体培养基覆盖于平板上，经过一定温度下的保温培养，如果发现能够生 长的突变株，就说明它能够产生核苷类物质。 8.3.1.2 特殊平板培养法 采用含有高浓度的磷酸盐、镁盐、葡萄糖和锰盐的琼脂平板培养基也能用于筛选产核苷 酸类物质的微生物，具体的筛选步骤如下： 1） 采集哺乳动物、鸟类的粪和土壤样品。 2） 分离培养基的成分为(%)：葡萄糖 10，琼脂 2.0, KH2PO4 1.0, MgSO47H2O 1.0, CaCl22H2O 0.01, FeSO47H2O 0.001, MnSO44H2O 0.0001, 生物素 30g/L, 泛酸钙 10mg/L, 硫胺素盐
酸盐5mg/L,叶酸2mg/L,烟酸2mg/L,吡哆醛4mg/L,酚红15mg/L。尿素经单独灭菌 后加入培养基中,培养基调节plH8.2 将粪或土壤样品悬浮液进行平板分离,30°℃培养2-3日,挑岀培养基上的菌落。 3)检验产核苷酸能力 将上述挑得的菌株分别进行培养并检验产核苷酸能力。种子培养基和发酵培养基的组成 分别如下 种子培养基(%):葡萄糖2,蛋白胨1,肉膏1,NaCl0.25,pH70 发酵培养基(%):葡萄糖10,KH2PO41.O,MgSOφ7H2O10, CaCl?·2H2O0.0l,FeSO;7H2O 0.001,酵母膏05-1.0,生物素30μg/L;也可以采用葡萄糖10,KH2PO41.0,MgSO47H2O 1.0,CaC2H2O001,FeSO47HO0.001,肉膏0.2,生物素30ug/L,泛酸钙10mg,硫胺 素盐酸盐5mg/L的培养基 灭菌前pH8:0-82,尿素(06%)单独灭菌后加入。在培养初期需添加3mgL的嘌呤碱 基。30C振荡培养5日后,分析发酵液中的核苷酸含量ε 特殊平板分离法适用于分离两步法发酵生产核苷酸的微生物。 8313核苷酸类物质生产菌选育 主要的核苷酸生产菌一般属于产氨短杆菌和枯草杆菌。1967年发现产氨短杆菌 AIC℃6872在嘌呤碱基存在下可以生产相应的核苷酸,如:由腺嘌呤生产腺苷酸,由次黄嘌 呤生产肌苷酸及由鸟嘌呤生产鸟苷酸等。随着对该菌株硏究工作的深入,通过诱变育种,获 得了生产各种核苷酸的突变株,图8.3.1显示了诱变谱系及相应的产物。 产氨短杆菌ATC6872 DES 450(GuNt可 )KY13102(MnA) (产I,IR和Hx)(和转化为Gua,G,GDP和GTP 3714(6-MGr)KY13171(M1) 广)(M2量2 KY13125(k2hn2) KY13502 自发突变 KY13503 KY13315 (A Nt KY13313(A Mn Nt KY13504 Doc突变株) (XN转化为Gua,GM,GDP和GTP) 图83.1产氨短杆菌的诱变谱系和产物 (DES:硫酸二乙酯:MNNG:N甲基N-硝基N-亚硝基胍:UV:紫外线 A:腺嘌呤不完全缺陷型:Aˉ:腺嘌呤缺陷型;M:锰敏感型;M:锰不敏感型 N":核苷酸分解酶弱;6-MG:6-號基鸟嘌呤抗性;Doc:迪古霉素抗性) 枯草杆菌一般具有较高的磷酸酯酶活性,能够将核苷酸转化为核苷。1963年,日本味 之素公司用Ⅹ射线处理枯草杆菌获得了肌苷生产菌,此后关于用Ⅹ射线、紫外线及化学诱 变等方法处理枯草杆菌的报道很多,诱变后的枯草杆菌分别具有积累肌苷、鸟苷、腺苷及黄 苷等的能力
4 酸盐 5 mg/L, 叶酸 2 mg/L, 烟酸 2 mg/L, 吡哆醛 4 mg/L, 酚红 15 mg/L。尿素经单独灭菌 后加入培养基中，培养基调节 pH8.2。 将粪或土壤样品悬浮液进行平板分离，300C 培养 2-3 日，挑出培养基上的菌落。 3）检验产核苷酸能力 将上述挑得的菌株分别进行培养并检验产核苷酸能力。种子培养基和发酵培养基的组成 分别如下。 种子培养基（%）：葡萄糖 2，蛋白胨 1，肉膏 1，NaCl 0.25，pH7.0。 发酵培养基（%）：葡萄糖 10，KH2PO4 1.0, MgSO47H2O 1.0, CaCl22H2O 0.01, FeSO47H2O 0.001, 酵母膏 0.5-1.0, 生物素 30g/L; 也可以采用葡萄糖 10，KH2PO4 1.0, MgSO47H2O 1.0, CaCl22H2O 0.01, FeSO47H2O 0.001, 肉膏 0.2, 生物素 30g/L, 泛酸钙 10mg/L, 硫胺 素盐酸盐 5 mg/L 的培养基。 灭菌前 pH8.0-8.2，尿素（0.6%）单独灭菌后加入。在培养初期需添加 3 mg/L 的嘌呤碱 基。300C 振荡培养 5 日后，分析发酵液中的核苷酸含量。 特殊平板分离法适用于分离两步法发酵生产核苷酸的微生物。 8.3.1.3 核苷酸类物质生产菌选育 主要的核苷酸生产菌一般属于产氨短杆菌和枯草杆菌。1967 年发现产氨短杆菌 ATCC6872 在嘌呤碱基存在下可以生产相应的核苷酸，如：由腺嘌呤生产腺苷酸，由次黄嘌 呤生产肌苷酸及由鸟嘌呤生产鸟苷酸等。随着对该菌株研究工作的深入，通过诱变育种，获 得了生产各种核苷酸的突变株，图 8.3.1 显示了诱变谱系及相应的产物。 图 8.3.1 产氨短杆菌的诱变谱系和产物 （DES：硫酸二乙酯；MNNG：N-甲基-N’-硝基 N-亚硝基胍；UV：紫外线； AL：腺嘌呤不完全缺陷型；A —：腺嘌呤缺陷型；Mn s：锰敏感型；MnI：锰不敏感型； Ntw：核苷酸分解酶弱；6-MGr：6-巰基鸟嘌呤抗性；Docr：迪古霉素抗性） 枯草杆菌一般具有较高的磷酸酯酶活性，能够将核苷酸转化为核苷。1963 年，日本味 之素公司用 X 射线处理枯草杆菌获得了肌苷生产菌，此后关于用 X 射线、紫外线及化学诱 变等方法处理枯草杆菌的报道很多，诱变后的枯草杆菌分别具有积累肌苷、鸟苷、腺苷及黄 苷等的能力
DNA转化法也常用于肌苷及鸟苷生产菌的育种。该方法首先要从枯草杆菌制备转化用 的高纯度DNA,其方法如下:用溶菌酶使细胞壁溶解,冰冻后解冻,进一步用酚和pH9缓 冲液的混合物在十二烷基磺酸钠存在下抽提核酸,核酸用胰RNas(EC2.7.7.16和 RNase T(由EC3,148制备)使RNA消化,再用含酚缓冲液抽提即可获得具有高转化性的DNA。 DNA转化则可以按如下步骤进行:将受体细胞在 Difco抗菌培养基3通气培养至对数生长 期结束时分离出菌体,洗涤菌体并以1:10比例重新悬浮于5毫升CHT2培养基,于37C 培养4小时,将细胞分离后洗涤:再次以1:10比例悬浮于CHI-10培养基,取09毫升于 30C培养90分钟,添加1毫升DNA溶液(DNA浓度为1微克/毫升),继续培养30分钟 后添加脱氧核糖核酸酶20微克毫升并加镁盐浓度至θ.0lmol。继续保温10分钟后取0.1 毫升的细胞悬浮液到基础培养基中进行培养,37C培养40-48小时后检査生产核苷的能力。 84发酵法生产核苷酸类物质 8.41发酵法生产5MP 5-IMP可以通过以下途径生产:1)微生物发酵法生产肌苷,然后通过化学反应磷酸化 得到5-IMP;2)直接发酵法生产5-IMP;3)发酵法生产腺嘌呤或5-AMP,再采用化学或 酶催化转化为5-IMP;4)将化学合成的次黄嘌呤通过微生物转化生产5-IMP。本节将介绍 前面两种生产方法,其中第一种方法的产物肌苷本身就可以直接用于医药工业。 在细胞内合成的5-IMP不能透过细胞壁释放到胞外,但是通过胞内的脱磷酸反应生成 肌苷后就可以释放到胞外。野生微生物产肌苷的能力很低,必须采用诱变育种的方法才能提 高肌苷的产量。根据图8.21所示的5-MP生物合成途径和调节机制可以看到,诱变育种的 目标应该是解除AMP对PRPP酰胺基转移酶的反馈抑制及切断5-IMP继续代谢生成GMP 和AMP的途径。由此可见,筛选AMP和GMP营养缺陷型突变株(Ade和Gua)是提高肌苷 产量的有效方法。为了使IMP脱氢酶和腺嘌呤基琥珀酸合成酶失活或降低活性,则应该筛 选对鸟嘌呤及腺嘌呤类似物抗性的突变株以阻遏这两种酶的合成。此外,如果采用枯草杄菌 进行诱变育种,某些氨基酸也会抑制5'-IMP的生物合成,因此选育组氨酸、苏氨酸及酪氨 酸缺陷型突变株也有利于提高肌苷的产量。 表841肌苷发酵微生物及其遗传标记 突变株 遗传特征 肌苷产量,gL 枯草肝菌( Bacillus subtilis Ade- his- C-30 Ade His Ty 10.50 RAD-16 Ade- Trp"- Dea"8AG 「18:00 产氨短杆菌( Brevibacterium aminomiagenes KY13714 Ade- 6MG Gua 13.60 KY13761 Ade- 6MG 6MTPr Gua 41021Ade6 MG GuaT,MP生物合成酶系不受524 AMP、ATP和GMP的阻遏,也不受腺嘌 呤和鸟嘌呤抑制 微杆菌( Microbacterium sp2) No 250 Bio6MP 8AG MSO 6TG 35.0 注:营养缺陷型:Adeˉ:腺苷:Bioˉ.:生物素;Guar:鸟嘌呤:His:组氨酸:Tr:酪氨 酸;Trp-:色氨酸。酶缺失型:Red:GMP还原酶;Dea-:AMP脱氨酶。类似物抗性:8AG 8-氮鸟嘌呤;6MG:6-巯基鸟嘌呤:6MP:6-甲基硫嘌呤:MSO:蛋氨酸亚砜;6TGF: 6-硫鸟嘌呤:6MP:6-巯基嘌呤
5 DNA 转化法也常用于肌苷及鸟苷生产菌的育种。该方法首先要从枯草杆菌制备转化用 的高纯度 DNA，其方法如下：用溶菌酶使细胞壁溶解，冰冻后解冻，进一步用酚和 pH9 缓 冲液的混合物在十二烷基磺酸钠存在下抽提核酸，核酸用胰 RNase(EC2.7.7.16)和 RNase T1(由 EC3.1.4.8 制备)使 RNA 消化，再用含酚缓冲液抽提即可获得具有高转化性的 DNA。 DNA 转化则可以按如下步骤进行：将受体细胞在 Difco 抗菌培养基 3 通气培养至对数生长 期结束时分离出菌体，洗涤菌体并以 1：10 比例重新悬浮于 5 毫升 CHT-2 培养基，于 370C 培养 4 小时，将细胞分离后洗涤；再次以 1：10 比例悬浮于 CHT-10 培养基，取 0.9 毫升于 300C 培养 90 分钟，添加 1 毫升 DNA 溶液（DNA 浓度为 1 微克/毫升），继续培养 30 分钟 后添加脱氧核糖核酸酶 20 微克/毫升并加镁盐浓度至 0.01mol/L。继续保温 10 分钟后取 0.1 毫升的细胞悬浮液到基础培养基中进行培养，370C 培养 40-48 小时后检查生产核苷的能力。 8.4 发酵法生产核苷酸类物质 8.4.1 发酵法生产 5’-IMP 5’-IMP 可以通过以下途径生产：1）微生物发酵法生产肌苷，然后通过化学反应磷酸化 得到 5’-IMP；2）直接发酵法生产 5’-IMP；3）发酵法生产腺嘌呤或 5’-AMP，再采用化学或 酶催化转化为 5’-IMP；4）将化学合成的次黄嘌呤通过微生物转化生产 5’-IMP。本节将介绍 前面两种生产方法，其中第一种方法的产物肌苷本身就可以直接用于医药工业。 在细胞内合成的 5’-IMP 不能透过细胞壁释放到胞外，但是通过胞内的脱磷酸反应生成 肌苷后就可以释放到胞外。野生微生物产肌苷的能力很低，必须采用诱变育种的方法才能提 高肌苷的产量。根据图 8.2.1 所示的 5’-IMP 生物合成途径和调节机制可以看到，诱变育种的 目标应该是解除 AMP 对 PRPP 酰胺基转移酶的反馈抑制及切断 5’-IMP 继续代谢生成 GMP 和 AMP 的途径。由此可见，筛选 AMP 和 GMP 营养缺陷型突变株(Ade−和 Gua− )是提高肌苷 产量的有效方法。为了使 IMP 脱氢酶和腺嘌呤基琥珀酸合成酶失活或降低活性，则应该筛 选对鸟嘌呤及腺嘌呤类似物抗性的突变株以阻遏这两种酶的合成。此外，如果采用枯草杆菌 进行诱变育种，某些氨基酸也会抑制 5’-IMP 的生物合成，因此选育组氨酸、苏氨酸及酪氨 酸缺陷型突变株也有利于提高肌苷的产量。 表 8.4.1 肌苷发酵微生物及其遗传标记 突变株 遗传特征 肌苷产量，g/L 枯草肝菌(Bacillus subtilis) No. 2 Ade− 0.21 B-4 Ade− His− 4.46 C-30 Ade− His− Tyr− 10.50 RAD-16 Ade− Trp− Red− Dea− 8AGr 18.00 产氨短杆菌(Brevibacterium aminomiagenes) KY13714 Ade− 6MGr Gua− 13.60 KY13761 Ade− 6MGr 6MTPr Gua− 30.0 41021 Ade − 6MGr Gua− ,IMP 生物合成酶系不受 AMP、ATP 和 GMP 的阻遏，也不受腺嘌 呤和鸟嘌呤抑制 52.4 微杆菌(Microbacterium sp.) No. 250 Bio− .6MPr 8AGr MSOr 6TGr 35.0 注：营养缺陷型：Ade−：腺苷；Bio− .：生物素；Gua−：鸟嘌呤；His−：组氨酸；Tyr−：酪氨 酸；Trp−：色氨酸。酶缺失型：Red−：GMP 还原酶；Dea−：AMP 脱氨酶。类似物抗性：8AGr： 8-氮鸟嘌呤；6MGr：6-巯基鸟嘌呤；6MTPr：6-甲基硫嘌呤；MSOr：蛋氨酸亚砜；6TGr： 6-硫鸟嘌呤；6MPr：6-巯基嘌呤