《分子与细胞》课程教学课件（PPT讲稿）第8章 常用分子操作技术、分子杂交与印迹技术、DNA测序

Template DNA 5 -5 Primer 2 目的片段 5

5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Template DNA 5 5 5 5 5 5 5 5 目的片段

5 5 25~30次循环后，目的片段的含量可以 扩大100万倍以上

Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 25～30 次循环后，目的片段的含量可以 扩大100万倍以上

三、PCR反应体系 标准的PCR反应体系(10~100μI) 10×缓冲液 1/10体积 Mg2+ 1.5mmol/L 4种dNTP混合物 200μmol/L 引物 各1μmol/L 模板DNA 102~105拷贝（1pg~1ug） Taq DNA聚合酶 1≈5u 双蒸水 至50≈100ul

28 标准的PCR反应体系（10 ～100ml） 三、PCR反应体系

PCR引物设计 ·PCR反应中有一对引物，即5'端引物和3'端 引物。设计引物时以一条DNA单链为基准， 5'端引物与待扩增片段5'端上游的一段DNA 序列相同；3端引物与待扩增片段3端的一 段DNA序列互补。 基准 -5ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3' TCCAACGGCTAGGCATTT 5' 5 ATAAGCCCGAAAGGTTCG- 3'TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5

29 • PCR反应中有一对引物，即5’端引物和3’端 引物。设计引物时以一条DNA单链为基准， 5′端引物与待扩增片段5′端上游的一段DNA 序列相同；3′端引物与待扩增片段3′端的一 段DNA序列互补。 PCR引物设计 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5′ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3′ 3′ 5′ 5’ATAAGCCCGAAAGGTTCG TCCAACGGCTAGGCATTT 5’ 基准

PCR引物设计 PCR引物设计的基本原则： ①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。ATGC随机分 布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③引物内部不应出现互补序列。 ④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3” 端的互补重叠

• PCR引物设计的基本原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。ATGC随机分 布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③引物内部不应出现互补序列。 ④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′ 端的互补重叠。 PCR引物设计