至雌球花闭合、雄球花散粉完毕为止，并详细记录雌、雄球花各发育时期的形态变化和经历时间（如表1-1）。3杨树、杜仲、银杏等雌雄异株树种确定观察的树种，选择观察的花枝与雌、雄花芽。每天或间隔数天定时观测雌、雄花芽一次，观察雌、雄花芽的形态和颜色变化，测量雌、雄花芽长度和直径，直至雌、雄花散粉完毕为止，并详细记录雌、雄花芽各发育阶段的形态变化和经历时间（如表1-1）。五、作业按实验的目的要求，以实验小组为单位完成实验内容：每位同学独立撰写一份林木开花授粉习性观察分析报告。表 1-1不同发育时期花（序）形态变化表雄花（序）雌花（序）气日期平均平均花的花药平均平均 花的温花长花径颜色颜色花长颜色花径表1-2开花授粉习性处理方法处理花朵数收获果实数收获种子数自然状态人工自花授粉套袋套袋自然自花授粉去雄套袋异花授粉去雄套袋不授粉
1 至雌球花闭合、雄球花散粉完毕为止，并详细记录雌、雄球花各发育时期的形态变 化和经历时间（如表 1-1）。 3 杨树、杜仲、银杏等雌雄异株树种 确定观察的树种，选择观察的花枝与雌、雄花芽。每天或间隔数天定时观测雌、 雄花芽一次，观察雌、雄花芽的形态和颜色变化，测量雌、雄花芽长度和直径，直 至雌、雄花散粉完毕为止，并详细记录雌、雄花芽各发育阶段的形态变化和经历时 间（如表 1-1）。 五、作业 按实验的目的要求，以实验小组为单位完成实验内容；每位同学独立撰写一份 林木开花授粉习性观察分析报告。 表 1-1 不同发育时期花（序）形态变化表 日期 气 温 雄花（序） 雌花（序） 平均 花长 平均 花径 花的 颜色 花药 颜色 „ 平均 花长 平均 花径 花的 颜色 „ 表 1-2 开花授粉习性 处理方法 处理花朵数 收获果实数 收获种子数 自然状态 人工自花授粉套袋 套袋自然自花授粉 去雄套袋异花授粉 去雄套袋不授粉
实验二植物花粉染色体加倍与鉴定染色体加倍主要是通过人工理化方法处理植物分裂细胞，促使细胞内的理化环境发生改变，影响纺锤丝或细胞板的形成，从而诱导细胞核或细胞质不分裂，导致体细胞内染色体数目倍增。其中物理诱导法包括各种采用各种射线辐射、高低温以及机械损伤等处理；化学诱导法包括采用各种植物碱、麻醉剂等。人工诱导花粉染色体加倍是树木人工多倍体育种中最为快捷的途径之一。一、实验目的学习植物染色体加倍及鉴定的方法和技术。二、实验材料杨树、二月兰等树木或草本植物材料。三、主要仪器与试剂仪器设备：温室、人工气候箱（0-50℃）、显微镜、微量注射器、干燥器、酒精灯、烧杯、容量瓶、量筒、吸管、青霉素小瓶、镊子、剪刀、解剖针、单面刀片、载玻片、盖玻片、滤纸、记号笔、标签等。试剂：秋水仙碱、冰乙酸、无水乙醇、盐酸、醋酸洋红等。四、实验方法与步骤1花粉染色体加倍有效处理时期由于理化处理只影响正在分裂的细胞，所以在处理时要了解被处理植物的细胞分裂周期，从而保证在细胞分裂有效作用时期之前进行处理。掌握最适处理时期，可取得事半功倍的效果。秋水仙碱等化学药剂诱导杨树等植物花粉染色体加倍的最佳处理时期为减数分裂粗线期（康向阳等，1999），高温诱导杨树等植物花粉染色体加倍的最佳处理时期为减数分裂终变期-中期I之前（康向阳等，2000）。实验时可选择在减数分裂的细线末期、粗线期、终变期等时期进行处理。在实验中，可采用醋酸洋红压片观察杨树等小孢子母细胞减数分裂过程，同时观察花芽外部形态的变化，及其与花芽外部形态变化的相互关系等（表2-1）。定期用卡诺固定液固定花芽，并边固定边采用制片跟踪观察。即花芽在固定液中固定2h后，用镊子摘取花药置于载玻片上，立即滴一滴醋酸洋红染色液，镊子挤压花药，将花粉母细胞排出，使其悬浮于染色液中，然后将花药壁组织清除于净，加盖玻片观祭。由于杨树等花芽内小抱子细胞减数分裂过程不同步，故以全部分裂相
实验二 植物花粉染色体加倍与鉴定 染色体加倍主要是通过人工理化方法处理植物分裂细胞，促使细胞内的理化环 境发生改变，影响纺锤丝或细胞板的形成，从而诱导细胞核或细胞质不分裂，导致 体细胞内染色体数目倍增。其中物理诱导法包括各种采用各种射线辐射、高低温以 及机械损伤等处理；化学诱导法包括采用各种植物碱、麻醉剂等。人工诱导花粉染 色体加倍是树木人工多倍体育种中最为快捷的途径之一。 一、实验目的 学习植物染色体加倍及鉴定的方法和技术。 二、实验材料 杨树、二月兰等树木或草本植物材料。 三、主要仪器与试剂 仪器设备：温室、人工气候箱（0-50℃）、显微镜、微量注射器、干燥器、酒 精灯、烧杯、容量瓶、量筒、吸管、青霉素小瓶、镊子、剪刀、解剖针、单面刀片、 载玻片、盖玻片、滤纸、记号笔、标签等。 试剂：秋水仙碱、冰乙酸、无水乙醇、盐酸、醋酸洋红等。 四、实验方法与步骤 1 花粉染色体加倍有效处理时期 由于理化处理只影响正在分裂的细胞，所以在处理时要了解被处理植物的细胞 分裂周期，从而保证在细胞分裂有效作用时期之前进行处理。掌握最适处理时期， 可取得事半功倍的效果。秋水仙碱等化学药剂诱导杨树等植物花粉染色体加倍的最 佳处理时期为减数分裂粗线期（康向阳等，1999），高温诱导杨树等植物花粉染色 体加倍的最佳处理时期为减数分裂终变期-中期Ⅰ之前（康向阳等，2000）。实验时 可选择在减数分裂的细线末期、粗线期、终变期等时期进行处理。 在实验中，可采用醋酸洋红压片观察杨树等小孢子母细胞减数分裂过程，同时 观察花芽外部形态的变化，及其与花芽外部形态变化的相互关系等（表 2-1）。定 期用卡诺固定液固定花芽，并边固定边采用制片跟踪观察。即花芽在固定液中固定 2h 后，用镊子摘取花药置于载玻片上，立即滴一滴醋酸洋红染色液，镊子挤压花 药，将花粉母细胞排出，使其悬浮于染色液中，然后将花药壁组织清除干净，加盖 玻片观察。由于杨树等花芽内小孢子母细胞减数分裂过程不同步，故以全部分裂相
中占大多数的减数分裂时期作为该花芽的代表时期。2诱导花粉染色体加倍的方法（1）化学诱导花粉染色体加倍花粉染色体化学加倍主要选用秋水仙碱处理，萘嵌戊烷（C12H1o）、有机杀菌剂富民隆、氧化亚氮（N0）等也常被使用。1试剂的最适浓度：因处理的材料、选择的处理方法以及处理的持续时间和环境温度等而异。一般而言，敏感材料（如根）采取直接浸泡或注射、处理持续时间长、环境温度高时，浓度宜较低：而当材料相对不敏感、采取涂布、喷雾等方法、处理持续时间短或环境温度较低时，浓度宜较高。秋水仙碱化学诱导采用的浓度一般为0.01%~0.5%。②处理持续时间：因处理的材料、选择的处理方法以及环境温度等而异，一般在12～72小时之间。处理的持续时间必需适度，如处理时间太短，则往往只有少数细胞染色体加倍，此时未加倍的细胞在生长、分裂速度方面较加倍细胞快，加倍细胞的生长增殖受到抑制，处理无效：反之，如处理时间过长，超过一个细胞分裂周期，则处理结果是染色体数目增加不止一倍，而形成更高的倍性细胞，或者因细胞受到秋水仙碱等化学试剂的毒害而引起细胞死亡，甚至导致组织或个体死亡。③处理方式有：①浸渍法：即用一定浓度的秋水仙碱等化学试剂浸渍萌发的种子、幼苗、茎尖、花芽等。②注射法：即用注射器将一定浓度的秋水仙碱等化学溶液直接注射到待处理的部位。一些树木的花芽适合用此方法。③涂布法：即将含一定浓度的秋水仙碱等化学溶液的羊毛脂软膏涂抹在生长点上。④喷雾法：即将配制好的秋水仙碱等化学药剂喷到要处理的分生部位。5药剂一培养基法：即将待处理材料接种到含一定浓度秋水仙碱等化学试剂的培养基上进行处理的方法。幼胚、愈伤组织以及一些较小的种子适合采用该种方法。杨树等树木花粉染色体加倍可采用注射法，即用微量注射器将秋水仙碱液从花芽顶端注入花芽内，每天3-4次，每次注入至药液溢出花芽为止，每次处理间隔为5-7小时。如该批花枝当天没注射完，于当日晚将所注射花枝移入冷室（0-4℃）以减缓减数分裂进程，确保处理效果的连续性。④处理适宜温度：温度过高和过低均不利于多倍体诱导。低于10℃时，因低温能抑制细胞分裂，从而影响化学药剂的作用效果：大于25℃，药剂对细胞的毒害作用加剧，导致细胞活力降低、甚至发生细胞裂解等。一般处理温度以15～20℃为宜。另外，处理温度与处理的溶液浓度和持续时间密切相关，一般温度低时浓度可稍大、处理时间可较长；温度高时须降低溶液浓度，缩短处理的持续时间。（2）物理因素诱导花粉染色体加倍
1 中占大多数的减数分裂时期作为该花芽的代表时期。 2 诱导花粉染色体加倍的方法 （1）化学诱导花粉染色体加倍 花粉染色体化学加倍主要选用秋水仙碱处理，萘嵌戊烷（C12H10）、有机杀菌剂 富民隆、氧化亚氮（N2O）等也常被使用。 ①试剂的最适浓度：因处理的材料、选择的处理方法以及处理的持续时间和环 境温度等而异。一般而言，敏感材料（如根）采取直接浸泡或注射、处理持续时间 长、环境温度高时，浓度宜较低；而当材料相对不敏感、采取涂布、喷雾等方法、 处理持续时间短或环境温度较低时，浓度宜较高。秋水仙碱化学诱导采用的浓度一 般为 0.01%～0.5%。 ②处理持续时间：因处理的材料、选择的处理方法以及环境温度等而异，一般 在 12～72 小时之间。处理的持续时间必需适度，如处理时间太短，则往往只有少 数细胞染色体加倍，此时未加倍的细胞在生长、分裂速度方面较加倍细胞快，加倍 细胞的生长增殖受到抑制，处理无效；反之，如处理时间过长，超过一个细胞分裂 周期，则处理结果是染色体数目增加不止一倍，而形成更高的倍性细胞，或者因细 胞受到秋水仙碱等化学试剂的毒害而引起细胞死亡，甚至导致组织或个体死亡。 ③处理方式有：①浸渍法：即用一定浓度的秋水仙碱等化学试剂浸渍萌发的种 子、幼苗、茎尖、花芽等。②注射法：即用注射器将一定浓度的秋水仙碱等化学溶 液直接注射到待处理的部位。一些树木的花芽适合用此方法。③涂布法：即将含一 定浓度的秋水仙碱等化学溶液的羊毛脂软膏涂抹在生长点上。④喷雾法：即将配制 好的秋水仙碱等化学药剂喷到要处理的分生部位。⑤药剂-培养基法：即将待处理 材料接种到含一定浓度秋水仙碱等化学试剂的培养基上进行处理的方法。幼胚、愈 伤组织以及一些较小的种子适合采用该种方法。 杨树等树木花粉染色体加倍可采用注射法，即用微量注射器将秋水仙碱液从花 芽顶端注入花芽内，每天 3-4 次，每次注入至药液溢出花芽为止，每次处理间隔为 5-7 小时。如该批花枝当天没注射完，于当日晚将所注射花枝移入冷室（0-4℃） 以减缓减数分裂进程，确保处理效果的连续性。 ④处理适宜温度：温度过高和过低均不利于多倍体诱导。低于 10℃时，因低 温能抑制细胞分裂，从而影响化学药剂的作用效果；大于 25℃，药剂对细胞的毒 害作用加剧，导致细胞活力降低、甚至发生细胞裂解等。一般处理温度以 15～20℃ 为宜。另外，处理温度与处理的溶液浓度和持续时间密切相关，一般温度低时浓度 可稍大、处理时间可较长；温度高时须降低溶液浓度，缩短处理的持续时间。 （2）物理因素诱导花粉染色体加倍
物理诱导法是指利用温度、射线、机械损伤等物理因素处理植物材料诱导细胞染色体加倍的方法，其中以高温处理效果最好。由于物种生物学特性差异，一些植物对秋水仙碱等化学试剂较为敏感，处理后因化学试剂毒害作用而难以取得理想效果，此时选择高温等物理方法诱导染色体加倍可能会收到叫好的效果。①处理的适宜温度：因处理的材料、处理的持续时间等而异。一般而言，高温处理诱导杨树等植物花粉染色体加倍的适宜温度范围为38～45℃。②处理持续时间：因处理的材料、选择的处理温度等而异，一般高温处理在2~8h，如在温度较高时处理时间过长，会导致花药细胞干枯而死亡。③处理方法：在进行高温处理时，对于手类似于杨树等可以采用切枝水培的树种或可通过盆栽的一、二年生草本植物、小灌木，可于恒温箱中施加高温处理诱发花粉染色体加倍：对于如杜仲等难以像杨树那样切枝水培的树种，可以采用“树木高温加倍器（发明专利ZL200510011598.5）”于树上对花芽进行高温处理诱导花粉染色体加倍。3标记与花枝管理：各处理均要挂上标签，注明处理方法、浓度、次数、日期等，并注意观察花序生长变化，及时换水，注意收集花粉。4花粉形态观与统计：一般而言，未减数二倍性花粉是正常花粉体积的2倍，在光学显微镜下，2n花粉与正常花粉对比明显，易于判别。在统计时将各个处理所得的花粉混合均匀，用解剖针取少量花粉置于洁净的载玻片上，用醋酸洋红染色，制成3-5个临时涂片，每片观察5个视野，统计花粉中的大花粉百分率（表2-2表2-3)。五、作业每组选择1种实验材料，以小组为单位采用秋水仙碱或高温处理完成一植物科的花粉染色体加倍及鉴定过程：每位同学独立并完成一份实验报告。表 2-1花粉母细胞减数分裂及雄配子发育进程水培时间（h）减数分裂时期花序形态花药颜色2
2 物理诱导法是指利用温度、射线、机械损伤等物理因素处理植物材料诱导细胞 染色体加倍的方法，其中以高温处理效果最好。由于物种生物学特性差异，一些植 物对秋水仙碱等化学试剂较为敏感，处理后因化学试剂毒害作用而难以取得理想效 果，此时选择高温等物理方法诱导染色体加倍可能会收到叫好的效果。 ①处理的适宜温度：因处理的材料、处理的持续时间等而异。一般而言，高温 处理诱导杨树等植物花粉染色体加倍的适宜温度范围为 38～45℃。 ②处理持续时间：因处理的材料、选择的处理温度等而异，一般高温处理在 2～ 8 h，如在温度较高时处理时间过长，会导致花药细胞干枯而死亡。 ③处理方法：在进行高温处理时，对于类似于杨树等可以采用切枝水培的树种， 或可通过盆栽的一、二年生草本植物、小灌木，可于恒温箱中施加高温处理诱发花 粉染色体加倍；对于如杜仲等难以像杨树那样切枝水培的树种，可以采用“树木高 温加倍器（发明专利 ZL200510011598.5）”于树上对花芽进行高温处理诱导花粉染 色体加倍。 3 标记与花枝管理：各处理均要挂上标签，注明处理方法、浓度、次数、日期 等，并注意观察花序生长变化，及时换水，注意收集花粉。 4 花粉形态观察与统计：一般而言，未减数二倍性花粉是正常花粉体积的 2 倍， 在光学显微镜下，2n 花粉与正常花粉对比明显，易于判别。在统计时将各个处理 所得的花粉混合均匀，用解剖针取少量花粉置于洁净的载玻片上，用醋酸洋红染色， 制成 3-5 个临时涂片，每片观察 5 个视野，统计花粉中的大花粉百分率（表 2-2， 表 2-3）。 五、作业 每组选择 1 种实验材料，以小组为单位采用秋水仙碱或高温处理完成一植物种 的花粉染色体加倍及鉴定过程；每位同学独立并完成一份实验报告。 表 2-1 花粉母细胞减数分裂及雄配子发育进程 水培时间（h） 减数分裂时期 花序形态 花药颜色
表 2-2秋水仙碱诱导2n花粉比率统计表注射次数对照备注处理时期浓度(0次)351表2-3高温处理诱导2n花粉百分率(%)处理时期处理温度℃处理时间h2n花粉百分率%花粉量/花芽mg对照（未处理正常散粉）
3 表 2-2 秋水仙碱诱导 2n 花粉比率统计表 处理时期 浓度 注射次数 对照 （0 次） 备注 1 3 5 表 2-3 高温处理诱导 2n 花粉百分率(%) 处理时期 处理温度℃ 处理时间 h 2n 花粉百分率% 花粉量/花芽 mg 对照（未处理正常散粉）