(二)基因诊断的基本方法 人类疾病的原因包括内因和外因两大类，内因主要是指 遗传因素，即基因结构、表达状况的改变。其中基因结构 的改变包括点突变、插入、缺失，重排、易位、基因扩增、 基因结构多态性变异、前病毒插入等；外因是指外在的环 境因素，如病原体的侵入等。 因此，针对这些病因可采取相应的基因诊断方法，主要 的可从以下几个方面着手：
（二）基因诊断的基本方法 人类疾病的原因包括内因和外因两大类，内因主要是指 遗传因素，即基因结构、表达状况的改变。其中基因结构 的改变包括点突变、插入、缺失，重排、易位、基因扩增、 基因结构多态性变异、前病毒插入等；外因是指外在的环 境因素，如病原体的侵入等。 因此，针对这些病因可采取相应的基因诊断方法，主要 的可从以下几个方面着手：
1、基因突变的诊断 (1)点突变的诊断 ①诊断已知的点突变：对于突变位点已被阐明的一些遗 传病，可以采用PCR/ASO(allele specific oligonucleotide, ASO,等位基因特异性寡核苷酸)探针法进行检测。在扩 增DNA片段后直接与相应寡核苷酸探针杂交，即可明确诊 断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。 例如，已知某位点正常碱基为C,突变为T(即C→T):
①诊断已知的点突变：对于突变位点已被阐明的一些遗 传病，可以采用PCR／ASO(allele specific oligonucleotide， ASO，等位基因特异性寡核苷酸)探针法进行检测。在扩 增DNA片段后直接与相应寡核苷酸探针杂交，即可明确诊 断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。 例如，已知某位点正常碱基为C，突变为T(即C→T)： 1、基因突变的诊断 （1）点突变的诊断
引物1 突变位点 引物2 在该位点两端设计引物1、2进行PCR扩增，得到产物 后进行斑点杂交或狭缝杂交(P177)。针对该突变分别 合成一对寡核苷酸片段作为探针；其中一个为正常探针， 与正常序列互补（中央碱基为G);另一个是突变探针， 与突变序列互补（中央碱基为A)。突变碱基及对应
在该位点两端设计引物1、2进行PCR扩增，得到产物 后进行斑点杂交或狭缝杂交 (P177)。针对该突变分别 合成一对寡核苷酸片段作为探针；其中一个为正常探针， 与正常序列互补(中央碱基为G)；另一个是突变探针， 与突变序列互补(中央碱基为A)。突变碱基及对应 3′ 突变位点 5′ 引物2 引物1
的正常碱基均位于寡核苷酸片段的中央，因为只有在这个 位置时，该碱基与被探测的DA上相应碱基或匹配或错配， 对二者结合力影响最大。严格控制杂交及洗脱条件，使只 有与靶序列完全互补的探针才能结合在等位基因片段上， 而中央碱基与靶序列不匹配的探针则不能结合在等位基因 片段上
的正常碱基均位于寡核苷酸片段的中央，因为只有在这个 位置时，该碱基与被探测的DNA上相应碱基或匹配或错配， 对二者结合力影响最大。严格控制杂交及洗脱条件，使只 有与靶序列完全互补的探针才能结合在等位基因片段上， 而中央碱基与靶序列不匹配的探针则不能结合在等位基因 片段上
结果分析：a.如果从受检者DNA扩增的PCR产物与正常 探针杂交，而不和突变探针杂交，表示受检者不存在这种 突变基因；b.如果只有突变探针可以杂交，则说明突变基 因是纯合子；c.若正常探针与突变探针都可杂交，说明突 变基因是杂合子；d.如果患者的DNA与正常探针以及所有 已知突变基因的寡核苷酸探针均不能杂交，则提示患者的 缺陷基因不属于先前已发现的突变类型，而很可能是一种 新的突变类型
结果分析：a. 如果从受检者DNA扩增的PCR产物与正常 探针杂交，而不和突变探针杂交，表示受检者不存在这种 突变基因；b. 如果只有突变探针可以杂交，则说明突变基 因是纯合子；c. 若正常探针与突变探针都可杂交，说明突 变基因是杂合子；d. 如果患者的DNA与正常探针以及所有 已知突变基因的寡核苷酸探针均不能杂交，则提示患者的 缺陷基因不属于先前已发现的突变类型，而很可能是一种 新的突变类型