电子形成的荧光图像衰减速度很快，所以一旦观察到理想的结构图像就需要尽快利用照相装置进行照相。值得注意的是，电镜照相与普通照相不同，图像的反衬度最低时才是正聚焦，且底片还必须要经过预干燥处理。透镜电镜的成像原理透射电镜之所以能获得高分辨率的图像，主要是因为它解决了两个关键问题，一是用电子枪发射出了波长极短的电子波，二是利用电磁透镜可控制电子的运动轨迹，即可对电子束进行聚焦、放大和成像。故透射电镜的有效放大倍数可高达数百万倍。电子枪发射出的高速电子束在磁场中聚焦，从而被会聚到待观察的样品上：电子束在通过样品时会发生散射，但由于样品不同部位的质量厚度不同，即物质的组成结构不同，电子束发生散射的程度就不同：透过样品后的电子束撞击到荧光屏上，由电能转变成光能，形成了浓淡不同的图像。此图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构，因而可用来分析和研究样品的超微结构。由此可见，在透射电镜中，被观察粒子的大小一定要大于电子束的波长才能被分辨出来否则，电子束就会发生绕射，无法看到粒子。这也是电镜的分辨率由电子束波长所决定的原因之所在。另外，用于透射电镜的标本须制成厚度仅有0.05mm的超薄切片，而且由于电子束不能透过玻璃，因此这种切片需要用用特制的样品托，而不能用普通光镜所用的载玻片。（图请见细胞生物学教材）1.2电镜的分类常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的一种类型，应用非常广泛，既可以用来分析生物组织的内部结构，又可以用来研究金属内部的晶体结构；是当今世界上所用电镜中数量最多的一类，约占现有电镜总数的90%左右，扫描电镜属于物体发射电子这一类，可以用来观察复杂的表面图像，其焦深和分辨率不但比光镜高出很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。LMSEMTEMSoune创Source (light)(eleetrunsCondenseCondensObicetObjective0.aperturScanning unitObjectiveObjectOcularEyeEyeFluo-screenMonitorComputer2、目的了解电子显微镜的工作原理和结构，观摩超薄切片技术演示，了解电镜图像反差来源的16
16 电子形成的荧光图像衰减速度很快，所以一旦观察到理想的结构图像就需要尽快利用照相装 置进行照相。值得注意的是，电镜照相与普通照相不同，图像的反衬度最低时才是正聚焦， 且底片还必须要经过预干燥处理。 透镜电镜的成像原理 透射电镜之所以能获得高分辨率的图像, 主要是因为它解决了两个关键问题, 一是用电 子枪发射出了波长极短的电子波, 二是利用电磁透镜可控制电子的运动轨迹, 即可对电子束 进行聚焦、放大和成像。故透射电镜的有效放大倍数可高达数百万倍。 电子枪发射出的高速电子束在磁场中聚焦，从而被会聚到待观察的样品上；电子束在通 过样品时会发生散射，但由于样品不同部位的质量厚度不同, 即物质的组成结构不同，电子 束发生散射的程度就不同；透过样品后的电子束撞击到荧光屏上，由电能转变成光能，形成 了浓淡不同的图像。此图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构，因而可用 来分析和研究样品的超微结构。 由此可见，在透射电镜中，被观察粒子的大小一定要大于电子束的波长才能被分辨出来, 否则，电子束就会发生绕射，无法看到粒子。这也是电镜的分辨率由电子束波长所决定的原 因之所在。 另外，用于透射电镜的标本须制成厚度仅有 0.05mm 的超薄切片，而且由于电子束不能 透过玻璃,因此这种切片需要用用特制的样品托，而不能用普通光镜所用的载玻片。 (图请 见细胞生物学教材) 1.2 电镜的分类 常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的一种类 型，应用非常广泛，既可以用来分析生物组织的内部结构，又可以用来研究金属内部的晶体 结构; 是当今世界上所用电镜中数量最多的一类, 约占现有电镜总数的 90%左右, 扫描电镜 属于物体发射电子这一类, 可以用来观察复杂的表面图像, 其焦深和分辨率不但比光镜高出 很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。 2、目的 了解电子显微镜的工作原理和结构，观摩超薄切片技术演示，了解电镜图像反差来源的
基础；判断、识别电镜下动、植物细胞中的各种亚显微结构。3、材料电子显微镜、各种细胞亚显微结构照片。4、方法电镜参观、观察电镜照片等内容分组交叉进行。为节约时间，每组10人。4.1电镜的演示由电镜室的老师讲解并演示，同学观看。4.2.电镜照片的观察挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片，供同学们观察和学习，以了解各种亚细胞结构的超微结构特征。1、细胞膜。细胞膜在电镜照片上呈3层结构，形状像“铁轨”，内外两层为电子密度较高的致密层（深色），两层之间为电子密度较小的疏松层（浅色），这3层结构称为单位膜（unitmembrane）。单位膜是生物膜的基本结构。2、细胞核：多数细胞的细胞核位于细胞的中央，按其结构和功能的不同又可分下列几部分：(1)核被膜：电镜下可见核被膜(unclearenvelope)由二层单位膜组成，二层核膜之间的间隙称核周间隙(perinuclearspace)。核被膜上有许多均匀分布的小孔，称核孔(nuclearpore)。核膜外层与细胞质接触面附有许多核蛋白体，并可与内质网相连，使核周间隙与内质网腔相通。(2)染色质和染色体：电镜下的间期细胞核内，染色质(chromatin)呈纤维状结构，它经固定染色后呈现着色深浅不同的两种区域。电子密度较高的着色深的区域为异染色质（heterochromatin），分布在周围为主；电子密度较低的着色较浅的区域为常染色质(euchromatin)，主要分布在核中央为主。分裂期细胞核中染色质高度螺旋化，缩短变粗，成为深染的杆状染色体（chromosome）。因此，染色质和染色体是同一种物质的两种形态，都是由DNA和组蛋白（histone）为主要成分构成的复合物，只是它们处于细胞周期的不同阶段。(3)核仁：间期细胞核内可有1至数个球形核仁，电镜下核仁具较高的电子致密度，无被膜，呈海绵状结构。核仁内部结构可分为4个组成部分：①纤维部分：为紧密排列的纤维丝构成核仁的海绵状网架。②颗粒部分：分散于网架之间，或围绕着纤维丝的致密颗粒。③核仁相随染色质(nucleolusassociatedchromatin)：即核仁组成中心的染色质部分，它们在间期时以染色质的形式与核仁保持联系，④核基质(nuclearmatrix)：为无定形的蛋白质性液体，电子密度低，充满于上述各部分的间隙。3、细胞质：细胞质是细胞膜以内与细胞核以外的全部物质，包括各种细胞器、基质和内含物等。(1)内质网：根据内质网(endoplasmicreticulum,ER)膜表面是否附有核糖核蛋白体，可将内质网分为二类：①粗面内质网(roughendoplasmicreticulum，rER)，是以互相连通的扁囊为主的膜性管道系统，少数是些游离囊泡，切面上呈管状或泡状，膜表面附有颗粒状的核糖核17
17 基础；判断、识别电镜下动、植物细胞中的各种亚显微结构。 3、材料 电子显微镜、各种细胞亚显微结构照片。 4、方法 电镜参观、观察电镜照片等内容分组交叉进行。为节约时间，每组 10 人。 4.1 电镜的演示 由电镜室的老师讲解并演示，同学观看。 4.2. 电镜照片的观察 挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片，供同学们观察和学习，以 了解各种亚细胞结构的超微结构特征。 1、细胞膜。细胞膜在电镜照片上呈 3 层结构，形状像“铁轨”，内外两层为电子密度 较高的致密层（深色），两层之间为电子密度较小的疏松层（浅色），这 3 层结构称为单位膜 （unit membrane）。单位膜是生物膜的基本结构。 2、细胞核：多数细胞的细胞核位于细胞的中央，按其结构和功能的不同又可分下列几 部分： (1)核被膜：电镜下可见核被膜(unclear envelope)由二层单位膜组成，二层核膜之间的 间隙称核周间隙(perinuclear space)。核被膜上有许多均匀分布的小孔，称核孔(nuclear pore)。 核膜外层与细胞质接触面附有许多核蛋白体，并可与内质网相连，使核周间隙与内质网腔相 通。 (2)染色质和染色体：电镜下的间期细胞核内，染色质(chromatin)呈纤维状结构，它经 固定染色后呈现着色深浅不同的两种区域。电子密度较高的着色深的区域为异染色质 （heterochromatin），分布在周围为主；电子密度较低的着色较浅的区域为常染色质 (euchromatin)，主要分布在核中央为主。 分裂期细胞核中染色质高度螺旋化，缩短变粗，成为深染的杆状染色体（chromosome）。 因此，染色质和染色体是同一种物质的两种形态，都是由 DNA 和组蛋白（histone）为主要 成分构成的复合物，只是它们处于细胞周期的不同阶段。 (3)核仁：间期细胞核内可有 1 至数个球形核仁，电镜下核仁具较高的电子致密度，无 被膜，呈海绵状结构。核仁内部结构可分为 4 个组成部分： ①纤维部分：为紧密排列的纤维丝构成核仁的海绵状网架。 ②颗粒部分：分散于网架之间，或围绕着纤维丝的致密颗粒。 ③核仁相随染色质(nucleolus associated chromatin)：即核仁组成中心的染色质部分，它 们在间期时以染色质的形式与核仁保持联系。 ④核基质(nuclear matrix)：为无定形的蛋白质性液体，电子密度低，充满于上述各部分 的间隙。 3、细胞质：细胞质是细胞膜以内与细胞核以外的全部物质，包括各种细胞器、基质和 内含物等。 (1)内质网：根据内质网(endoplasmic reticulum, ER)膜表面是否附有核糖核蛋白体，可将 内质网分为二类：①粗面内质网(rough endoplasmic reticulum, rER)，是以互相连通的扁囊为 主的膜性管道系统，少数是些游离囊泡，切面上呈管状或泡状，膜表面附有颗粒状的核糖核
蛋白体；②滑面内质网（smoothendoplasmicreticulum，sER），形态为分支小管或小泡，有的彼此相连成网，膜表面无核糖核蛋白体附着。(2)高尔基复合体：电镜下可见高尔基复合体由膜性的扁平囊、大囊泡和小囊泡组成。①扁平囊（saccule）：一般3一8个扁平囊泡重叠在一起，平行排列，略弯曲成弓形，故有凸、凹2个面，凸面又称形成面（formingface），面向细胞核和内质网，凹面又称成熟面（matureface），靠近细胞膜，产生许多分泌泡。扁平囊的内容物呈中等电子致密度。②大囊泡（vacuole)：多分布于成熟面，它们的电子致密度不一。③小囊泡（vesicle）：常见于形成面，数量较多。(3)线粒体：电镜下的线粒体由内、外两层膜围成，外膜平滑、内膜向内折叠，形成许多板状或管状的嗜(crista)。内、外膜之间的腔隙称外腔(outerchamber)，内膜围成的内部空腔称内腔(innerchamber)，内腔里充满了基质，基质中可有电子致密度很高的基质颗粒(matrixgranule)。用负染色法处理内膜，能清楚地显示出内膜上有许多与膜垂直的球形基粒(elementaryparticle)。(4)溶酶体：溶酶体是由一层单位膜围成的球状小体，内含多种酸性水解酶。电镜下可见内容物的电子密度均匀者为初级溶酶体（primarylysosome），内容物的电子密度不均匀者为次级溶酶体（secondarylysosome）。(5)核糖核蛋白体：又称核糖体，在电镜下呈椭圆形致密小颗粒，在高分辨率电镜下可见它由大、小两个亚单位（subunit）构成。核蛋白体若附于内质网膜表面者为固着核蛋白体（fixedribosome），若游离于胞质内的为游离核蛋白体（freeribosome），还可见到由mRNA将若干个核蛋白体串连成的多聚核蛋白体（polyribosome），呈花簇状、平螺纹状或念珠状等多种形状。(6)中心粒：电镜下见到的中心粒（centriole）是成对且互相垂直的圆筒状小体，圆筒壁由9组纵行的微管排列而成。（7)微管和微丝：微管是中空纤维状长管，横切面呈环状，环壁着色较深，由13根原纤维围成，环腔内着色较浅。微丝为实心纤维，经常成束平行排列在细胞膜下，也有的分散并交织成网状。（8)微体：微体（microbody）也称过氧化物酶体（peroxisome），在电镜下由一层单位膜围成的圆形或卵圆形细胞器，一般比溶酶体小，常见于肝细胞和肾小管细胞中粗面内质网的周围。微体内的基质含中等电子密度的颗粒物质，有的动物的肝、肾细胞中的微体含一类核体（nucleoid），它是尿酸氧化酶的结晶，类核体也可为致密的无定形的物质。(9)脂滴：电镜下的脂滴(lipiddroplet)为大小不等的泡状结构，内容物呈均质性，致密度高低不一，用戊二醛固定的材料中脂滴的电子致密度较钱酸固定者为低。脂滴没有界膜，有界膜的脂滴称脂质体（liposome）。(10)糖原：糖原(glycogen)无包膜，也不附于其他膜上。糖原颗粒有2型：α颗粒和β颗粒。α颗粒呈花簇状，β颗粒呈圆形，单个分散存在于胞质中。5、结果与讨论5.1通过本实验的学习，比较光镜与电镜工作原理的差异。比较电子显微镜（EM)和光学显微镜（LM)的异同18
18 蛋白体；②滑面内质网(smooth endoplasmic reticulum, sER)，形态为分支小管或小泡，有的 彼此相连成网，膜表面无核糖核蛋白体附着。 (2)高尔基复合体：电镜下可见高尔基复合体由膜性的扁平囊、大囊泡和小囊泡组成。 ①扁平囊（saccule）：一般 3－8 个扁平囊泡重叠在一起，平行排列，略弯曲成弓形， 故有凸、凹 2 个面，凸面又称形成面（forming face），面向细胞核和内质网，凹面又称成熟 面（mature face），靠近细胞膜，产生许多分泌泡。扁平囊的内容物呈中等电子致密度。 ②大囊泡（vacuole）：多分布于成熟面，它们的电子致密度不一。 ③小囊泡（vesicle）：常见于形成面，数量较多。 (3)线粒体：电镜下的线粒体由内、外两层膜围成，外膜平滑、内膜向内折叠，形成许 多板状或管状的嵴(crista)。内、外膜之间的腔隙称外腔(outer chamber)，内膜围成的内部空 腔称内腔(inner chamber)，内腔里充满了基质，基质中可有电子致密度很高的基质颗粒(matrix granule)。用负染色法处理内膜，能清楚地显示出内膜上有许多与膜垂直的球形基粒 （elementary particle）。 (4)溶酶体：溶酶体是由一层单位膜围成的球状小体，内含多种酸性水解酶。电镜下可 见内容物的电子密度均匀者为初级溶酶体（primary lysosome），内容物的电子密度不均匀者 为次级溶酶体（secondary lysosome）。 (5)核糖核蛋白体：又称核糖体，在电镜下呈椭圆形致密小颗粒，在高分辨率电镜下可 见它由大、小两个亚单位（subunit）构成。核蛋白体若附于内质网膜表面者为固着核蛋白体 （fixed ribosome），若游离于胞质内的为游离核蛋白体（free ribosome），还可见到由 mRNA 将若干个核蛋白体串连成的多聚核蛋白体（polyribosome），呈花簇状、平螺纹状或念珠状等 多种形状。 (6)中心粒：电镜下见到的中心粒（centriole）是成对且互相垂直的圆筒状小体，圆筒壁 由 9 组纵行的微管排列而成。 (7)微管和微丝：微管是中空纤维状长管，横切面呈环状，环壁着色较深，由 13 根原纤 维围成，环腔内着色较浅。微丝为实心纤维，经常成束平行排列在细胞膜下，也有的分散并 交织成网状。 (8)微体：微体（microbody）也称过氧化物酶体（peroxisome），在电镜下由一层单位 膜围成的圆形或卵圆形细胞器，一般比溶酶体小，常见于肝细胞和肾小管细胞中粗面内质网 的周围。微体内的基质含中等电子密度的颗粒物质，有的动物的肝、肾细胞中的微体含一类 核体（nucleoid），它是尿酸氧化酶的结晶，类核体也可为致密的无定形的物质。 (9)脂滴：电镜下的脂滴(lipid droplet)为大小不等的泡状结构，内容物呈均质性，致密度 高低不一，用戊二醛固定的材料中脂滴的电子致密度较锇酸固定者为低。脂滴没有界膜，有 界膜的脂滴称脂质体（liposome）。 (10)糖原：糖原(glycogen)无包膜，也不附于其他膜上。糖原颗粒有 2 型：α颗粒和β 颗粒。α颗粒呈花簇状，β颗粒呈圆形，单个分散存在于胞质中。 5、结果与讨论 5.1 通过本实验的学习，比较光镜与电镜工作原理的差异。 比较电子显微镜(EM)和光学显微镜(LM)的异同
显微EMLM内镜容照明源波长分辨本质光路介质透镜聚焦方式孔径角放大倍率反衬度5.2区分细胞的超微结构和显微结构，写出各种细胞器的名称及其结构特征。19
19 EM LM 照明源 波长 分辨本质 光路介质 透镜 聚焦方式 孔径角 放大倍率 反衬度 5.2 区分细胞的超微结构和显微结构, 写出各种细胞器的名称及其结构特征。 显 微 内 镜 容
实验3、细胞膜的渗透性1、原理小分子跨膜运输：生物膜对小分子的跨膜渗透包括水、电解质和非电解质溶质。根据对人工不含蛋白质的磷脂双分子层研究物质通透性质表明，只要时间足够长，任何分子都能顺浓度梯度扩散通过脂双层。人工合成的脂质体主要用来研究细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。但不同分子通过脂双层扩散的速率差别很大，主要取决于它们在脂类和水之间的分配系数及其分子的大小。分子越小，分配系数越大，通过质膜的速率越快。从下图中可以看出，小的、亲脂性的、非极性分子（如O2、CO2、N2、苯）容易溶解于脂双层，可迅速透过脂双层。小的、不带电荷的极性分子（如水、脲、甘油等）如果足够小时，也能很快透过脂双层；大的、不带电荷的极性分子（如葡萄糖，蔗糖等）可以跨膜扩散运输，但比较困难；对于带电荷的分子或离子，由于这些分子的电荷及高的水化度，因此不管多小，都很难透过脂双层的疏水区，它们要通过载体介导的主动运输方式跨膜运输。所以人工脂双层对水的透性比那些直径小的多的Na+和K+大109倍。与人工脂双层膜不同的是，生物膜不但允许水和非极性分子借简单的物理扩散作用透过，还允许各种极性分子，如离子、糖、氨基酸、核苷酸及很多细胞代谢产物通过特有的机制通过。如果将红细胞放置在各种溶液中，根据红细胞质膜对各种溶质的渗透性不同，有的溶质可渗入，有的溶质不能渗入。即使能渗入，速度也有差异。可通过观察红细胞溶血现象时间的不同来记录渗入速度。血红蛋白从红细胞中逸出的现象称为溶血现象。渗入红细胞的溶质能提高红细胞渗透压，使水进入红细胞，引起溶血及细胞膜破裂。此时光线较容易通过溶液，使溶液呈现透明即为溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。因此，可通过溶血现象来测量各种物质通透性的差别。2、目的2.1了解细胞膜的渗透性：2.2了解各种物质进入红细胞的速度。3、材料与方法3.1材料3.1.1一龄鸡、家免或小鼠。将鸡血溶于含有抗凝剂的等渗液中（肝素钠0.2mg/mL,一般范围在0.01-0.2mg/mL等渗液为0.15mol/LNaCI)。3.1.2主要试剂和仪器：5mmol/LNaCl,65mmol/LNaCl,0.15mol/LNaCl,0.8mol/L甲醇，0.8mol/L乙醇，0.8mol/L丙三醇，2%TritonX-100，氯仿，直管，5mL量筒，滴管，20
20 实验 3、细胞膜的渗透性 1、原理 小分子跨膜运输：生物膜对小分子的跨膜渗透包括水、电解质和非电解质溶质。根据对 人工不含蛋白质的磷脂双分子层研究物质通透性质表明，只要时间足够长，任何分子都能顺 浓度梯度扩散通过脂双层。人工合成的脂质体主要用来研究细胞膜的渗透性及各类物质进入 细胞的速度。但不同分子通过脂双层扩散的速率差别很大，主要取决于它们在脂类和水之间 的分配系数及其分子的大小。分子越小，分配系数越大，通过质膜的速率越快。从下图中可 以看出，小的、亲脂性的、非极性分子（如 O2、CO2、 N2 、苯）容易溶解于脂双层，可 迅速透过脂双层。小的、不带电荷的极性分子（如水、脲、甘油等）如果足够小时，也能很 快透过脂双层；大的、不带电荷的极性分子（如葡萄糖，蔗糖等）可以跨膜扩散运输，但比 较困难；对于带电荷的分子或离子，由于这些分子的电荷及高的水化度，因此不管多小，都 很难透过脂双层的疏水区，它们要通过载体介导的主动运输方式跨膜运输。所以人工脂双层 对水的透性比那些直径小的多的 Na+和 K+大 109 倍。 与人工脂双层膜不同的是，生物膜不但允许水和非极性分子借简单的物理扩散作用透 过，还允许各种极性分子，如离子、糖、氨基酸、核苷酸及很多细胞代谢产物通过特有的机 制通过。 如果将红细胞放置在各种溶液中， 根据红细胞质膜对各种溶质的渗透性不同，有的溶 质可渗入，有的溶质不能渗入。即使能渗入，速度也有差异。可通过观察红细胞溶血现象时 间的不同来记录渗入速度。血红蛋白从红细胞中逸出的现象称为溶血现象。渗入红细胞的溶 质能提高红细胞渗透压，使水进入红细胞，引起溶血及细胞膜破裂。此时光线较容易通过溶 液，使溶液呈现透明即为溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。因此，可通过溶 血现象来测量各种物质通透性的差别。 2、目的 2.1 了解细胞膜的渗透性； 2.2 了解各种物质进入红细胞的速度。 3、材料与方法 3.1 材料 3.1.1 一龄鸡、家兔或小鼠。将鸡血溶于含有抗凝剂的等渗液中（肝素钠 0.2mg/mL,一 般范围在 0.01-0.2mg/mL；等渗液为 0.15mol/L NaCl）。 3.1.2 主要试剂和仪器：5mmol/L NaCl, 65mmol/L NaCl, 0.15mol/L NaCl, 0.8mol/L 甲醇， 0.8mol/L 乙醇，0.8mol/L 丙三醇，2% Triton X-100, 氯仿，直管，5mL 量筒，滴管