3）新鲜制备蛋日。蛋白会随看时间降解使混合物变得不均匀。最好在蛋白纯化完成的当天进行结晶实验。（4）单一的蛋白聚合状态。如仅存在单体或二聚体的任意一种。可将分子筛纯化方法作为蛋白纯化的最后步骤。可使用动态光散射器确定蛋白的聚合状态，（5）蛋白浓度。（6）蛋白在室温下是否稳定。是否需要添加一些东西（如盐）。蛋白降解是否迅速（7）类似的蛋白是否结晶过？检查PDB并查看头部记录以获得结晶化细节。2.选择适当的晶体筛选试剂盒。市售多种蛋白结晶筛选试剂盒，大多是基于随机法或者不完全因素法（Sparsematrixscreen)设计的。最早由McPherson报道，收集了最常见的蛋白结晶条件，把这些因素作随即组合而成。最经典的就是HamptonResearch的CrystalScreenKit。后来新开发的试剂盒，参考了更多蛋白样本。还有一些有一定针对性的试剂盒，比如针对蛋白复合物的试剂盒，ProteinComplexScreen，由NIAiDPeterSun组设计。HamptonResearch公司的NatrixScreen针对核酸蛋白复合物的结晶。TJ-Lab有常见的10多种结晶试剂盒，可以根据需要和样品特性选择。3.蛋白样品需要选择适当的缓冲液。需要对蛋白缓冲液的喜好有一定的了解。比如，缓冲液pH远离蛋白等电点1~2个单位，尽量减少盐或者其他组分（比如甘油）。避开磷酸缓冲液，因为磷酸根容易与钙／镁离子互作，形成盐晶。根据需要是不是需要加还原剂如DTT等。4.悬滴法结晶实验的建立，预计消耗时间：2hr/kit（1）挑选需要用到的CrystallizationKits（见附录），按照Kits条件的顺序，在结晶板（一般24孔）的盖子上做好编号，每完成一块结晶板的编号，切记将结晶板的盖子与底座做上唯一标记，以防在后续步骤中不同结晶板的盖子与底座混淆。（2）完成对结晶板的编号与标记后，一一对应地将Kits中各条件溶液加入到各孔中，即加入下槽液，下槽液的体积一般为250~300μL（如果是优化条件，为方便计算，体积为500μL。（3）根据目的蛋白的个数或浓度，预先设计好在一块盖玻片上点几个悬滴，确定数目（如4~6个），进一步确定悬滴间的位置，在结晶板的盖子上最好画一个盖玻片的示意图，将悬滴间的位置关系在示意图上标记清楚，留意盖玻片正反面视角观察导致的悬滴间位置关系的差异，同时在结晶板的盖子上标记清楚姓名、实验日期、蛋白名称、蛋白浓度等相关信息（4）按照设定的顺序，将目的蛋白点在盖玻片上，吸取对应的下槽液与之混合（目的蛋白的滴加量根据浓缩后的体积而定，确保目的蛋白的量是足以点完所有条件的，一般目的蛋白的滴加量为0.2μL；下槽液的滴加量取决于其与目的蛋白的比例，一般为1：1）。5.悬滴混合完成后，将盖玻片盖在对应的孔上，压片时用力适中，确保密封（如果结晶板没有自带封胶那么需要在加入下槽液之前，在每个孔边缘人工均匀地涂上凡士林等封胶）；关键步骤：每点完一块板就随即将其移入18℃C恒温箱中，直至点完所有条件。6.不同蛋白结晶速度快慢不一，因此观察晶体形成情况的时间也没有规律，一般是在第二天进行第一次观察，将结晶板从恒温箱中取出，在显微镜下逐孔观察，注意观察时尽量迅速，避免光线、温度等外界条件的变化对晶体造成影响。7.根据经验，对每孔中结晶情况进行判断，如遇疑似目的蛋白的晶体，将对应的悬滴标记出来，留待进一步确定或冻存（大多数情况下，初步筛选一无所获是很正常的，少数幸运情况下，会观察到晶体或一些疑似晶体的物质，可能存在各种形态，或太密集，或太小，或极不规则等等，此时就需要对结晶条件进行优化）
（3）新鲜制备蛋白。蛋白会随着时间降解使混合物变得不均匀。最好在蛋白纯化完成的当天进行结晶实 验。 （4）单一的蛋白聚合状态。如仅存在单体或二聚体的任意一种。可将分子筛纯化方法作为蛋白纯化的最后 步骤。可使用动态光散射器确定蛋白的聚合状态。 （5）蛋白浓度。 （6）蛋白在室温下是否稳定。是否需要添加一些东西（如盐）。蛋白降解是否迅速。 （7）类似的蛋白是否结晶过？检查PDB并查看头部记录以获得结晶化细节。 2. 选择适当的晶体筛选试剂盒。 市售多种蛋白结晶筛选试剂盒，大多是基于随机法或者不完全因素法（Sparse matrix screen)设计的。最 早由McPherson报道，收集了最常见的蛋白结晶条件，把这些因素作随即组合而成。最经典的就是Hampton Research 的Crystal Screen Kit。后来新开发的试剂盒，参考了更多蛋白样本。还有一些有一定针对性的试剂 盒，比如针对蛋白复合物的试剂盒，Protein Complex Screen, 由NIAID Peter Sun组设计。Hampton Research 公司的Natrix Screen针对核酸蛋白复合物的结晶。TJ-Lab有常见的10多种结晶试剂盒，可以根据需要和样品特 性选择。 3. 蛋白样品需要选择适当的缓冲液。 需要对蛋白缓冲液的喜好有一定的了解。比如，缓冲液pH远离蛋白等电点1~2个单位，尽量减少盐或者其 他组分（比如甘油）。避开磷酸缓冲液，因为磷酸根容易与钙／镁离子互作，形成盐晶。根据需要是不是需要 加还原剂如DTT等。 4. 悬滴法结晶实验的建立，预计消耗时间：2 hr／kit （1）挑选需要用到的 Crystallization Kits（见附录），按照 Kits条件的顺序，在结晶板（一般 24孔）的盖 子上做好编号，每完成一块结晶板的编号，切记将结晶板的盖子与底座做上唯一标记，以防在后续步骤中不同 结晶板的盖子与底座混淆。 （2）完成对结晶板的编号与标记后，一一对应地将Kits中各条件溶液加入到各孔中，即加入下槽液，下槽 液的体积一般为250~300 μL（如果是优化条件，为方便计算，体积为500 μL。 （3）根据目的蛋白的个数或浓度，预先设计好在一块盖玻片上点几个悬滴，确定数目（如4~6个），进一 步确定悬滴间的位置，在结晶板的盖子上最好画一个盖玻片的示意图，将悬滴间的位置关系在示意图上标记清 楚，留意盖玻片正反面视角观察导致的悬滴间位置关系的差异，同时在结晶板的盖子上标记清楚姓名、实验日 期、蛋白名称、蛋白浓度等相关信息。 （4）按照设定的顺序，将目的蛋白点在盖玻片上，吸取对应的下槽液与之混合（目的蛋白的滴加量根据浓 缩后的体积而定，确保目的蛋白的量是足以点完所有条件的，一般目的蛋白的滴加量为0.2 μL；下槽液的滴加 量取决于其与目的蛋白的比例，一般为1：1）。 5. 悬滴混合完成后，将盖玻片盖在对应的孔上，压片时用力适中，确保密封（如果结晶板没有自带封胶， 那么需要在加入下槽液之前，在每个孔边缘人工均匀地涂上凡士林等封胶）； 关键步骤：每点完一块板就随即将其移入18 °C恒温箱中，直至点完所有条件。 6. 不同蛋白结晶速度快慢不一，因此观察晶体形成情况的时间也没有规律，一般是在第二天进行第一次观 察，将结晶板从恒温箱中取出，在显微镜下逐孔观察，注意观察时尽量迅速，避免光线、温度等外界条件的变 化对晶体造成影响。 7. 根据经验，对每孔中结晶情况进行判断，如遇疑似目的蛋白的晶体，将对应的悬滴标记出来，留待进一 步确定或冻存（大多数情况下，初步筛选一无所获是很正常的，少数幸运情况下，会观察到晶体或一些疑似晶 体的物质，可能存在各种形态，或太密集，或太小，或极不规则等等，此时就需要对结晶条件进行优化）
8.观察结束后，将出现疑似晶体的孔的编号记录下来，随即将结晶板放回恒温箱中，对照Kits的说明书及母液管壁上的注释，将记录下来的编号对应的条件挑选出来，并另记于实验本。9.根据目的蛋白初筛时出晶的大概时间，对优化的条件进行显微镜观察，如果能够观察到单个晶体，应该尽快将晶体冻存起来，留待衍射。影响出晶的试剂成分参考1.聚合物分子量大小：不同分子量的聚合物比如PEG，和水作用方式不同，沉淀蛋白能力也不同。一般来说，分子量大的PEG沉淀效果更强，更容易产生晶核。相反，分子量小的PEG，更不容易让蛋白沉淀和结晶。因此有的蛋白在较低浓度高分子量PEG（比如PEG800O）下能长晶体，但是不能在高浓度低分子量PEG条件下出晶体。另外，低分子量PEG，包括EG，PEG400等，都是很好的防冻剂。在高分子量PEG条件下长的晶体，可以添加20%左右的EG或者PEG400来防冻。根据PEGs的相似性和不同性质，优化晶体的时候，可以尝试不同分子量的PEG，以获得高质量单晶。2.盐的种类和选择：盐的种类很多，对蛋白质结晶的影响也各有不同。总的来说，基本符合Hofmeister定律。电解质溶液的表面张力表现出特殊离子效应，表面张力会随看盐溶液浓度的增加而增大，而在浓度增量相同时不同的电解质溶液的表面能增量不相同，这个现象被认为是FranzHofmeiste效应。从大量实验看，Hofmeister序列离子对溶液的影响在盐浓度高的溶液中较明显，且阴离子的影响要大于阳离子的影响。模拟研究表明，溶剂化能在离子和周围水分子之间的变化是Hofmeiste效应形成机制的基础。Hofmeister序列如下：SCN-<l-<CIO4-<NO3-<Br-<CIO3-<CI-<BrO3-<F-<SO42-<K+<Na+<<Li+~Ca2+。序列中头几种离子增加溶剂表面张力，降低非极性盐析分子的溶解度（盐析），加强了疏水作用。而最后几种离子增加非极性盐溶分子的溶解度（盐溶），增加水的有序性，降低了疏水作用。盐析效应通常用于蛋白质纯化，利用硫酸铵沉淀。然而，这些盐也直接与蛋白质相互作用（蛋白质带电且具有强偶极矩），甚至可以特异结合（例如磷酸盐和硫酸盐与RNaseA结合）。具有强烈“盐溶"效应的离子，如i-和SCN-是强变性剂，因为它们在肽基团中盐化，因此与未折叠的蛋白质相互作用比与天然蛋白质相互作用更强，它们将去折叠反应的化学平衡转移到未折叠蛋白上。在一个含有多种类型离子的水溶液中，蛋白变性更加复杂。Orderof Protein stabilizationAnionsF->PO43>SO.2>CH,COO>CI>Br>>SCNCationS(CH,),N*>(CH3)2NH2+>NH*>K+>Na*>Cs*>Li*>Mg*>Cat>BatOrderofProteindestabilization针对性建议（TROUBLESHOOTING）实验前确保蛋白样品比较均一。高速离心去除蛋白沉淀，提高蛋白均一性。5.5.2结晶条件优化简介（INSTRUCTION）利用晶体学方法获取蛋白结构往往需要付出极大的辛苦，因为很多情况下，获得高质量的晶体是很困难的，大多数时候没有晶体或者只有低质量的晶体，例如出现李晶、晶体太小、晶体衍射等等。以下是一些常见关于晶体优化等相关内容。如果只能得到微晶，那么可以通过改变结晶条件：沉淀剂浓度、pH（有时，0.1pH单位的改变足以影响出晶）、蛋白浓度（提高液滴中蛋白质的比例可以提高蛋白终浓度）、温度（如果需要4度结晶，可在结
8. 观察结束后，将出现疑似晶体的孔的编号记录下来，随即将结晶板放回恒温箱中，对照Kits的说明书及 母液管壁上的注释，将记录下来的编号对应的条件挑选出来，并另记于实验本。 9. 根据目的蛋白初筛时出晶的大概时间，对优化的条件进行显微镜观察，如果能够观察到单个晶体，应该 尽快将晶体冻存起来，留待衍射。 影响出晶的试剂成分参考 1. 聚合物分子量大小： 不同分子量的聚合物比如PEG，和水作用方式不同，沉淀蛋白能力也不同。一般来说，分子量大的PEG， 沉淀效果更强，更容易产生晶核。相反，分子量小的PEG，更不容易让蛋白沉淀和结晶。因此有的蛋白在较低 浓度高分子量PEG（比如PEG8000）下能长晶体，但是不能在高浓度低分子量PEG条件下出晶体。另外，低分 子量PEG，包括EG，PEG400等，都是很好的防冻剂。在高分子量PEG条件下长的晶体，可以添加20%左右的 EG或者PEG400来防冻。根据PEGs的相似性和不同性质，优化晶体的时候，可以尝试不同分子量的PEG，以 获得高质量单晶。 2. 盐的种类和选择： 盐的种类很多，对蛋白质结晶的影响也各有不同。总的来说，基本符合Hofmeister定律。电解质溶液的表 面张力表现出“特殊离子效应”，表面张力会随着盐溶液浓度的增加而增大，而在浓度增量相同时不同的电解质溶 液的表面能增量不相同，这个现象被认为是Franz Hofmeiste效应。从大量实验看，Hofmeister序列离子对溶液 的影响在盐浓度高的溶液中较明显，且阴离子的影响要大于阳离子的影响。模拟研究表明，溶剂化能在离子和 周围水分子之间的变化是Hofmeiste效应形成机制的基础。Hofmeister序列如下：SCN-<I-<ClO4-<NO3-<Br- <ClO3-<Cl-<BrO3-<F-<SO42-<K+<Na+<<Li+～Ca2+。序列中头几种离子增加溶剂表面张力，降低非极性盐析 分子的溶解度（盐析），加强了疏水作用。而最后几种离子增加非极性盐溶分子的溶解度（盐溶），增加水的 有序性，降低了疏水作用。盐析效应通常用于蛋白质纯化，利用硫酸铵沉淀。然而，这些盐也直接与蛋白质相 互作用（蛋白质带电且具有强偶极矩），甚至可以特异结合（例如磷酸盐和硫酸盐与RNaseA结合）。具有强烈 “盐溶”效应的离子，如i-和SCN-是强变性剂，因为它们在肽基团中盐化，因此与未折叠的蛋白质相互作用比与天 然蛋白质相互作用更强，它们将去折叠反应的化学平衡转移到未折叠蛋白上。在一个含有多种类型离子的水溶 液中，蛋白变性更加复杂。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 实验前确保蛋白样品比较均一。高速离心去除蛋白沉淀，提高蛋白均一性。 5.5.2 结晶条件优化 简介（INSTRUCTION） 利用晶体学方法获取蛋白结构往往需要付出极大的辛苦，因为很多情况下，获得高质量的晶体是很困 难的，大多数时候没有晶体或者只有低质量的晶体，例如出现孪晶、晶体太小、晶体 衍射等等。以下是一些常见关于晶体优化等相关内容。 如果只能得到微晶，那么可以通过改变结晶条件：沉淀剂浓度、pH（有时，0.1 pH单位的改变足以影 响出晶）、蛋白浓度（提高液滴中蛋白质的比例可以提高蛋白终浓度）、温度（如果需要4度结晶，可在结
晶前预冷所有的溶液并冰上操作）、方法（更大的液滴可以形成更大的晶体，因为液滴中含有更多的蛋白质，平衡的速度更慢。也可以尝试坐滴或三明治滴）、蛋白自身。一、如果无法提高，可以尝试改变蛋白1.配体-蛋白复合物。如果你的蛋白质结合配体可制备配体-蛋白复合物，因为配体的结合可能会连接两个子结构域而降低灵活性，将改变蛋白质的表面特性，可能会导致蛋白构象改变。2.均质性。非均质的第三四级结构阻碍结晶。你的蛋白质分解成一个稳定的蛋白水解片段（或者是“自发的”，或者在一个附加的蛋白酶的帮助下）吗？你的蛋白质与同一家族其他蛋白质的同源性是否降低到n和c-未端？3.结构域。你的蛋白质有结构域结构吗？可通过检查Pfam数据库，检查ProDom数据库，Psiblast搜索获悉。4.低复杂性区域。有时，点突变可阻止/启动蛋白质结晶。研究不同的物种是获得不影响功能的点突变集合的最简单方法。5.脱糖基作用。对于糖基化修饰的蛋白质，松软和不均匀的碳水化合物可能会干扰结晶。可尝试酶促脱糖。6.添加剂及洗涤剂。最受欢迎的添加剂有：甘油，（通常用量1%~25%的甘油），可以阻止成核，并可能给你更少，更大的晶体，并具有双重作为冷冻保护剂的优势。乙醇或二氧六环，这些物质会毒化晶体并使晶体停止生长避免成核过多。二价阳离子，如镁。洗涤剂，如β-辛基葡萄糖苷。Hampton有三个添加剂筛选和三个洗涤剂筛选试剂盒。找到合适的添加剂可能与找到蛋白质单一聚合态的条件有关。尝试使用不同的添加剂得到单一聚合态蛋日。二、晶体衍射相关影响因素：1.衍射：衍射取决于晶体大小。因为散射与晶体中的单位胞数成正比。单位晶胞的数目与晶体的体积成正比，因此将立方晶体的所有尺寸加倍，衍射就会达到8倍。相反，晶体中单位晶胞的数量取决于单位晶胞的大小，而单位晶胞的大小又取决于蛋白质的大小。2.秩序：散射取决于每个单元的相同程度。同一性越强，散射越强。盐比蛋白质衍射更好，因为它更有序。3.对称性：对于同样大小的晶体，盐的衍射效果比蛋白质的好，因为单位晶胞要小得多。（盐晶衍射的光斑相距较远，在一个小的振荡角范围内，光斑可能会消失。在高分辨率下会有一些强烈的斑点，不会看到低分辨瓣率的斑点。）4.晶体的衍射质量可以随以下任何组合而变化衍射强度衍射质量无衍射多镶嵌晶体Multiplemosaiccrystal弱衍射10埃镶嵌晶体衍射3.5-6埃多晶体单晶体衍射>2.8埃材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）：目的蛋白、结晶板、凡士林、硅化盖玻片等耗材器械（EQUIPMENT）：恒温培养箱、体视显微镜
晶前预冷所有的溶液并冰上操作）、方法（更大的液滴可以形成更大的晶体，因为液滴中含有更多的蛋白 质，平衡的速度更慢。也可以尝试坐滴或三明治滴）、蛋白自身。 一、如果无法提高，可以尝试改变蛋白 1. 配体-蛋白复合物。如果你的蛋白质结合配体可制备配体-蛋白复合物，因为配体的结合可能会连接两 个子结构域而降低灵活性，将改变蛋白质的表面特性，可能会导致蛋白构象改变。 2. 均质性。非均质的第三四级结构阻碍结晶。 你的蛋白质分解成一个稳定的蛋白水解片段（或者是“自 发的”，或者在一个附加的蛋白酶的帮助下）吗？你的蛋白质与同一家族其他蛋白质的同源性是否降低到n- 和c-末端？ 3. 结构域。你的蛋白质有结构域结构吗？可通过检查Pfam数据库，检查ProDom数据库，Psiblast搜索 获悉。 4. 低复杂性区域。有时，点突变可阻止/启动蛋白质结晶。研究不同的物种是获得不影响功能的点突变 集合的最简单方法。 5. 脱糖基作用。对于糖基化修饰的蛋白质，松软和不均匀的碳水化合物可能会干扰结晶。可尝试酶促 脱糖。 6. 添加剂及洗涤剂。最受欢迎的添加剂有：甘油，（通常用量1%~25%的甘油），可以阻止成核，并 可能给你更少，更大的晶体，并具有双重作为冷冻保护剂的优势。乙醇或二氧六环，这些物质会毒化晶体 并使晶体停止生长避免成核过多。二价阳离子，如镁。洗涤剂，如β-辛基葡萄糖苷。Hampton有三个添加 剂筛选和三个洗涤剂筛选试剂盒。找到合适的添加剂可能与找到蛋白质单一聚合态的条件有关。尝试使用 不同的添加剂得到单一聚合态蛋白。 二、晶体衍射相关影响因素： 1. 衍射：衍射取决于晶体大小。因为散射与晶体中的单位胞数成正比。单位晶胞的数目与晶体的体积 成正比，因此将立方晶体的所有尺寸加倍，衍射就会达到8倍。相反，晶体中单位晶胞的数量取决于单位晶 胞的大小，而单位晶胞的大小又取决于蛋白质的大小。 2. 秩序：散射取决于每个单元的相同程度。 同一性越强，散射越强。盐比蛋白质衍射更好，因为它更 有序。 3. 对称性：对于同样大小的晶体，盐的衍射效果比蛋白质的好，因为单位晶胞要小得多。（盐晶衍射 的光斑相距较远，在一个小的振荡角范围内，光斑可能会消失。在高分辨率下会有一些强烈的斑点，不会 看到低分辨率的斑点。） 4. 晶体的衍射质量可以随以下任何组合而变化： 衍射强度 衍射质量 无衍射 多镶嵌晶体Multiple mosaic crystal 弱衍射10埃 镶嵌晶体 衍射3.5-6埃 多晶体 衍射>2.8埃 单晶体 材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS）：目的蛋白、结晶板、凡士林、硅化盖玻片等耗材 器械（EQUIPMENT）：恒温培养箱、体视显微镜
实验步骤（PROCEDURE）1.确定晶体生长条件。本实验室自已配制的晶体母液，因缺少某些试剂，该试剂可能由其他试剂替代。建议在确定晶体生长条件时以母液管壁上标注的说明为准。2.拟定优化方案。一般情况下将沉淀剂浓度拉梯度（当然也有其他方法，下文中会有所涉及），具体的做法是先设定梯度的两端值（即沉淀剂的最小浓度和最大浓度），随即配制好相应的两份母液，然后吸取两份母液按不同比例混合以完成梯度设置（例如，出晶的条件中沉淀剂是2.0M的硫酸铵，那么可以将梯度设置在1.5M至2.5M之间，配制两份结晶母液其含有沉淀剂浓度分别为SolutionA（1.5M）和SolutionB（2.5M），注意这两份结晶母液中只改变了沉淀的浓度而其他成分的浓度和原始结晶条件一致。如果准备点6个孔的话，可以按如下比例分别吸取两份母液混合于相应孔中，如下表：3452610500400300200100Solution A (μL)0100200300400500Solution B (μL)3.当然也可以按照每50μL为基础变量进行递减/递增，这样会产生11个条件。4.如果要以pH为优化变量，或者设置条件组合，方法同上述类似。5.根据目的蛋白初筛时出晶的大概时间，对优化的条件进行显微镜观察，如果能够观察到单个晶体应该尽快将晶体冻存起来，留待衍射。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.如何将多块镶嵌晶体制成单块晶体？一些多晶体可以使用玻璃纤维轻轻分开。拍摄新鲜的晶体。晶体在生长后的几天内就会变质。镶嵌晶体需要仔细的数据收集。如果镶嵌性不会导致斑点彼此重叠，则可以进行数据收集。2.如何使弱衍射晶体进一步衍射？注意辐射损伤。有些冻存的晶体在X射线照射下会衰减。晶体死亡表现在第一幅衍射图像上有微弱的衍射，第二幅图像上的衍射更少。拍摄新鲜的晶体。轻轻地处理晶体，使用大环来冷冻。脱水。将晶体置于较高的沉淀剂条件下使细胞收缩。这可以在分辨率上产生惊人的提高。退火。把晶体冷冻在低温流中（不要射击），把它们放回室温，把它们放回结晶溶液中几分钟，然后重新冷冻。相关文献及书籍：J.M.Harp，D.E.TimmandG.J.Bunick（1998).MacromolecularCrystalAnnealing:OvercomingIncreasedMosaicityAssociatedwithCryocrystallography.ActaCryst.D54,622628.以及J.1I.YehandW.G.J.Hol(1998).Aflash-annealingtechniquetoimprovediffractionlimitsandlowermosaicityincrystalsofglycerolkinase.ActaCryst.(1998).D54,479-4805.5.3晶体冻存
实验步骤（PROCEDURE） 1. 确定晶体生长条件。本实验室自己配制的晶体母液，因缺少某些试剂，该试剂可能由其他试剂替 代。建议在确定晶体生长条件时以母液管壁上标注的说明为准。 2. 拟定优化方案。一般情况下将沉淀剂浓度拉梯度（当然也有其他方法，下文中会有所涉及），具体 的做法是先设定梯度的两端值（即沉淀剂的最小浓度和最大浓度），随即配制好相应的两份母液，然后吸 取两份母液按不同比例混合以完成梯度设置（例如，出晶的条件中沉淀剂是2.0 M的硫酸铵，那么可以将梯 度设置在 1.5 M 至 2.5 M之间，配制两份结晶母液其含有沉淀剂浓度分别为Solution A（1.5 M）和Solution B（2.5 M），注意这两份结晶母液中只改变了沉淀的浓度而其他成分的浓度和原始结晶条件一致。如果准 备点6个孔的话，可以按如下比例分别吸取两份母液混合于相应孔中，如下表： 1 2 3 4 5 6 Solution A (μL) 500 400 300 200 100 0 Solution B (μL) 0 100 200 300 400 500 3. 当然也可以按照每50 μL为基础变量进行递减/递增，这样会产生11个条件。 4. 如果要以pH为优化变量，或者设置条件组合，方法同上述类似。 5. 根据目的蛋白初筛时出晶的大概时间，对优化的条件进行显微镜观察，如果能够观察到单个晶体， 应该尽快将晶体冻存起来，留待衍射。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 如何将多块镶嵌晶体制成单块晶体？ 一些多晶体可以使用玻璃纤维轻轻分开。 拍摄新鲜的晶体。晶体在生长后的几天内就会变质。 镶嵌晶体需要仔细的数据收集。如果镶嵌性不会导致斑点彼此重叠，则可以进行数据收集。 2. 如何使弱衍射晶体进一步衍射？ 注意辐射损伤。有些冻存的晶体在X射线照射下会衰减。晶体死亡表现在第一幅衍射图像上有微弱的 衍射，第二幅图像上的衍射更少。 拍摄新鲜的晶体。轻轻地处理晶体，使用大环来冷冻。 脱水。将晶体置于较高的沉淀剂条件下使细胞收缩。这可以在分辨率上产生惊人的提高。 退火。把晶体冷冻在低温流中（不要射击），把它们放回室温，把它们放回结晶溶液中几分钟，然后 重新冷冻。 相 关 文 献 及 书 籍 ： J. M. Harp, D. E. Timm and G. J. Bunick (1998). Macromolecular Crystal Annealing: Overcoming Increased Mosaicity Associated with Cryocrystallography. Acta Cryst. D54, 622 - 628. 以及J. I. Yeh and W. G. J. Hol (1998). A flash-annealing technique to improve diffraction limits and lower mosaicity in crystals of glycerol kinase. Acta Cryst. (1998). D54, 479 – 480. 5.5.3 晶体冻存
简介（INTRODUCTION）当获得了自的蛋自的晶体后，我们如让它能够忽受得了X-Ray一定时间内的持续照射，并获得较好的衍射数据呢？因为晶体直接被暴露在X-Ray的照射下，在极短的时间内，晶体内部的排列顺序就会受到破坏而无法获得足够的衍射数据，因此就需要一定手段来保护晶体。研究发现当晶体处于超低温的环境中，可以延长晶体暴露于X-Ray的时间，维持内部分子的排列顺序。因此，现普遍采用低温冷却的方式来保护晶体以获得更多的衍射数据。然而，直接低温冷却晶体会致使晶体内部产生冰晶，以至于破坏了蛋白晶体内部的有序结构，因此保护晶体的各种防冻剂被科学家们逐渐通过测试而挖掘出来，成为晶体学实验不可或缺的重要一环。防冻剂的选择是需要实验人员根据经验和实际情况多次摸索，也可以凭经验自由组合一些防冻成分已达到实验目的。常用晶体防冻液CryoprotectantConcentration>25%GlycerolEthylene glycol>25%PEG-400>25%>25%2R,3R-(-)-Butane-2,3-diolParaffin>25%>25%2-propanol>25%2-Methyl-2,4-pentandiol (MPD)>25%Glucose>25%XyloseSucrose>25%Li2S04>2 M材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）：防冻剂、结晶母液、Puck、Cryopin、枪头等耗材器械（EQUIPMENT）：液氮（罐）、绝热盒、显微镜、钳子、移液枪实验步骤（PROCEDURE）1.防冻剂的选择非常关键。虽然上表多种化合物都有防冻效果，但是用法有些不同。首先尽量采用相似原则，也就是说选取与结晶条件相同或者接近的组分。比如如果晶体是在含有PEG条件长的，通过增加PEG的浓度或者添加高浓度小分子量的PEG，达到防冻效果。如果晶体是在高盐条件长的，可以首选具有防冻作用盐，比如锂盐，其次是小分子糖类葡萄糖、木糖、蔗糖等。甘油具有降低电导的作用，往往对在高盐条件下的晶体不利。其次，通过混合多种组分防冻剂，最大限度减少对晶体造成损伤。比如10%日油，10%PEG，10%蔗糖等。防冻剂的选择还要考虑的防冻剂在结晶条件下的溶解度。比如硫酸锂溶解度较低，很难达到防冻效果。2.配制防冻液时，需要保持原条件沉淀剂浓度相同或者适当增加。不能简单在原条件里加防冻剂，这样会造成沉淀剂浓度降低。防冻液的成分是所有成分的最终浓度，配制时需要考虑体积的改变，以最终体积为准
简介（INTRODUCTION） 当获得了目的蛋白的晶体后，我们如何让它能够忍受得了X-Ray一定时间内的持续照射，并获得较好 的衍射数据呢？ 因为晶体直接被暴露在X-Ray的照射下，在极短的时间内，晶体内部的排列顺序就会受到破坏而无法 获得足够的衍射数据，因此就需要一定手段来保护晶体。研究发现当晶体处于超低温的环境中，可以延长 晶体暴露于X-Ray的时间，维持内部分子的排列顺序。因此，现普遍采用低温冷却的方式来保护晶体以获得 更多的衍射数据。然而，直接低温冷却晶体会致使晶体内部产生冰晶，以至于破坏了蛋白晶体内部的有序 结构，因此保护晶体的各种防冻剂被科学家们逐渐通过测试而挖掘出来，成为晶体学实验不可或缺的重要 一环。防冻剂的选择是需要实验人员根据经验和实际情况多次摸索，也可以凭经验自由组合一些防冻成分 已达到实验目的。 常用晶体防冻液 Cryoprotectant Concentration Glycerol >25% Ethylene glycol >25% PEG-400 >25% 2R,3R-(-)-Butane-2,3-diol >25% Paraffin >25% 2-propanol >25% 2-Methyl-2,4-pentandiol (MPD) >25% Glucose >25% Xylose >25% Sucrose >25% Li2SO4 >2 M 材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS）：防冻剂、结晶母液、Puck、Cryopin、枪头 等耗材 器械（EQUIPMENT）：液氮（罐）、绝热盒、显微镜、钳子、移液枪 实验步骤（PROCEDURE） 1. 防冻剂的选择非常关键。虽然上表多种化合物都有防冻效果，但是用法有些不同。首先尽量采用相 似原则，也就是说选取与结晶条件相同或者接近的组分。比如如果晶体是在含有PEG条件长的，通过增加 PEG的浓度或者添加高浓度小分子量的PEG，达到防冻效果。如果晶体是在高盐条件长的，可以首选具有 防冻作用盐，比如锂盐，其次是小分子糖类葡萄糖、木糖、蔗糖等。甘油具有降低电导的作用，往往对在 高盐条件下的晶体不利。其次，通过混合多种组分防冻剂，最大限度减少对晶体造成损伤。比如10%甘 油，10% PEG，10%蔗糖等。防冻剂的选择还要考虑的防冻剂在结晶条件下的溶解度。比如硫酸锂溶解度 较低，很难达到防冻效果。 2. 配制防冻液时，需要保持原条件沉淀剂浓度相同或者适当增加。不能简单在原条件里加防冻剂，这 样会造成沉淀剂浓度降低。防冻液的成分是所有成分的最终浓度，配制时需要考虑体积的改变，以最终体 积为准