生物技术制药实验2018年3月
生物技术制药实验 2018 年3 月
实验相关注意事项精确的实验技术，良好的实验习惯，是基因工程实验获得成功的有效保证：分子生物学是一门新兴学科，可以解决生物学中许多以前解决不了的问题。随着分子生物学的发展，其应用范围也越来越广，做基因工程实验的人也日益增多，但许多实验人员在实验中经常犯这样那样的错误。这里，我们根据本实验室以前的经验，总结了一些常见的错误供同行借鉴以减少同样的错误，使大家更有效、更愉快地开展工作。(一)心理素质问题做基因工程实验实际上也是一种人的活动，所以个人的心理素质对实验是有影响的，一般来讲，平常心态稳定、习惯良好的人，实验的成功率要高，反之则低些。下面我们例举的是实验中遇到的实验人员心理问题。1.不能正确对待基因工程实验分子生物学是一门年轻的学科，40余年。应用十分广泛，发展特别快，已开始形成了一套完整而成熟的基础理论和实验体系。涉及的知识领域广泛，许多学科的新进展都很快与它联系起来，有一定的神秘性，没有进分子生物学这个门的人，有一些畏惧心理。实际上基础理论本身还是比较简明具体，同时它的实验操作也都有专门的书籍详细介绍（如《分子克隆》），读上几本基础书，再到有经验的实验室去实践，在较短的时间内是可以入门的。另一方面，有些已具有部分分子生物学知识的人，很多实验的实验步骤经过前人的不断改进，变得十分的简便，有些大的实验在几天内即可完成，便认为基因工程实验简单，产生轻视心理，这种心理同样也是有害的。因为基因工程实验的操作是精细而微量的，本身中间步骤多且用直观方法难以检测，实验中的每一种试剂，每一个步骤出错都可能是致命的，可导致实验完全失败，所以基因工程实验是不能完全按实验流程来计算时间的。例如在本实验室做基因拼接，按标准实验程序，合成完寡聚核苷酸片段后只需10天即可完成拼接、克隆及测序鉴定，但在实际中，还没有人能在10天内做完。由于各种各样的原因（包括试剂、操作及个人心理素质等），平均要2个月左右才能完成这样一个工作。所以，轻视心理也是必须纠正的。总之，对待基因工程实验，引用伟人毛泽东的一句话“在战略上渺视它，在战术上重视它”，才是正确的态度。2.用微量试剂不习惯在基因工程实验中，试剂的用量往往很少，液体常常可用到1微升即1X10”毫升，而普通的一滴水就有20～100微升；固体物质可用到微克甚至纳克级，这是平常肉眼看不见的。1
I 实验相关注意事项 精确的实验技术，良好的实验习惯，是基因工程实验获得成功的有效保证：分子生物学 是一门新兴学科，可以解决生物学中许多以前解决不了的问题。随着分子生物学的发展，其 应用范围也越来越广，做基因工程实验的人也日益增多，但许多实验人员在实验中经常犯这 样那样的错误。这里，我们根据本实验室以前的经验，总结了一些常见的错误供同行借鉴， 以减少同样的错误，使大家更有效、更愉快地开展工作。 (一)心理素质问题 做基因工程实验实际上也是一种人的活动，所以个人的心理素质对实验是有影响的，一 般来讲，平常心态稳定、习惯良好的人，实验的成功率要高，反之则低些。下面我们例举的 是实验中遇到的实验人员心理问题。 1．不能正确对待基因工程实验 分子生物学是一门年轻的学科， 40 余年。应用十分广泛，发展特别快，已开始形成了 一套完整而成熟的基础理论和实验体系。涉及的知识领域广泛，许多学科的新进展都很快与 它联系起来，有一定的神秘性，没有进分子生物学这个门的人，有一些畏惧心理。实际上基 础理论本身还是比较简明具体，同时它的实验操作也都有专门的书籍详细介绍(如《分子克 隆》)，读上几本基础书，再到有经验的实验室去实践，在较短的时间内是可以入门的。 另一方面，有些已具有部分分子生物学知识的人，很多实验的实验步骤经过前人的不断 改进，变得十分的简便，有些大的实验在几天内即可完成，便认为基因工程实验简单，产生 轻视心理，这种心理同样也是有害的。因为基因工程实验的操作是精细而微量的，本身中间 步骤多且用直观方法难以检测，实验中的每一种试剂，每一个步骤出错都可能是致命的，可 导致实验完全失败，所以基因工程实验是不能完全按实验流程来计算时间的。例如在本实验 室做基因拼接，按标准实验程序，合成完寡聚核苷酸片段后只需 10 天即可完成拼接、克隆及 测序鉴定，但在实际中，还没有人能在 10 天内做完。由于各种各样的原因(包括试剂、操作 及个人心理素质等)，平均要 2 个月左右才能完成这样一个工作。所以，轻视心理也是必须纠 正的。 总之，对待基因工程实验，引用伟人毛泽东的一句话“在战略上渺视它，在战术上重视 它’’才是正确的态度。 2．用微量试剂不习惯 在基因工程实验中，试剂的用量往往很少，液体常常可用到 l 微升即 1X10”毫升，而普 通的一滴水就有 20～100 微升；固体物质可用到微克甚至纳克级，这是平常肉眼看不见的
所以刚刚接触基因工程实验的人，总是担心要取的东西能否取到，准不准确，操作的样品是不是会丢失。总是加大用量，认为多总比少好，实际上这些顾虑是多余的。在基因工程实验中，一般都有专门的仪器设备检测和观察样品，有一整套方法保证取样的正确。许多样品的量很少，肉眼看不见，而肉眼看不见通常意味着样品纯度好，不带杂质，超量使用酶等试剂反而会干扰正确的结果。所以实验人员必须在心理上逐渐适应用这些微量概念。3.粗心大意在基因工程实验中，由于粗心大意造成的错误可说是“千奇万怪”，在每一个实验中几乎都可以举出实例。在一个课题的研究中，可能要用到一系列的实验，每一个实验中又包含几个小实验，小实验中又有许多具体的步骤，每一个步骤中又用到许多试剂，在这些过程中因为粗心大意都有出错的可能，产生的后果小则重做某一步骤，大则整个课题必须重新开头。主要表现为试剂配制错误；样品取错：实验顺序颠倒；样品混；样品意外去失：加错试剂；看错实验条件等等不一而足。例如某人大量制备DNA，所有的细菌培养、扩增及碱法抽提、分步纯化、乙醇沉淀DNA都已做完，最后离心收集DNA时，不小心将离心管碰翻在地上，样品全部丢失，一周成果全部损失。我们建议实验人员要克服粗心大意的不良习惯，严格细心地做每一步操作，以保证整体实验的顺利进行。4.缺乏整体实验的概念许多实验人员在刚开始一项新的实验时，对整个实验过程缺少全面的了解，对实验需要多少时间？要用何种试剂?用量多少？要用到何种实验材料？何种实验设备等都没有概念，往往实验做到中途，再急匆来寻找缺少的东西。基因工程实验中，所用到的试剂、药品通常都价钱昂贵，一般实验室不可能储备得种类齐全而又充足，另外许多试剂还依赖进口，购买周期长，这就会迫使实验中途停止，致使实验效率严重降低，有的实验不能中途停顿，就可能使整个实验全部失败。我们建议实验人员在做分子生物学实验之前，应在基础知识、实验方法、实验材料及实验试剂上有充分的准备，在实验时间上做好充分的安排，以保证实验的顺利开展。5.侥幸心理侥幸心理是基因工程实验中致使实验人员犯错误最多的原因，想省时间、省步骤及因对前一步实验盲目自信是产生这种心理的主要原因。因为基因工程实验方法是在依据分子生物学基础理论的基础上，辅以前人大量的实验经验而建立的，实验条件的细小改变，不一定会使实验失败，但几个步骤的细小改变，累积起来必出大错。做基因工程实验每个步骤的结果，在能够检测的条件下都应检测，否则不应进入下一步实验。由于各种原因，实验人员经常省略检测这一步，从表面看省了事，实际上使后面的实验失去了保证，最后实验失败且连原因II
II 所以刚刚接触基因工程实验的人，总是担心要取的东西能否取到，准不准确，操作的样品是 不是会丢失。总是加大用量，认为多总比少好，实际上这些顾虑是多余的。在基因工程实验 中，一般都有专门的仪器设备检测和观察样品，有一整套方法保证取样的正确。许多样品的 量很少，肉眼看不见，而肉眼看不见通常意味着样品纯度好，不带杂质，超量使用酶等试剂 反而会干扰正确的结果。所以实验人员必须在心理上逐渐适应用这些微量概念。 3. 粗心大意 在基因工程实验中，由于粗心大意造成的错误可说是“千奇万怪”，在每一个实验中几乎 都可以举出实例。在一个课题的研究中，可能要用到一系列的实验，每一个实验中又包含几 个小实验，小实验中又有许多具体的步骤，每一个步骤中又用到许多试剂，在这些过程中因 为粗心大意都有出错的可能，产生的后果小则重做某一步骤，大则整个课题必须重新开头。 主要表现为试剂配制错误；样品取错；实验顺序颠倒；样品混淆；样品意外丢失；加错试剂； 看错实验条件等等不一而足。例如某人大量制备 DNA，所有的细菌培养、扩增及碱法抽提、 分步纯化、乙醇沉淀 DNA 都已做完，最后离心收集 DNA 时，不小心将离心管碰翻在地上，样 品全部丢失，一周成果全部损失。我们建议实验人员要克服粗心大意的不良习惯，严格细心 地做每一步操作，以保证整体实验的顺利进行。 4．缺乏整体实验的概念 许多实验人员在刚开始一项新的实验时，对整个实验过程缺少全面的了解，对实验需要 多少时间?要用何种试剂?用量多少?要用到何种实验材料?何种实验设备等都没有概念，往往 实验做到中途，再急匆匆来寻找缺少的东西。基因工程实验中，所用到的试剂、药品通常都 价钱昂贵，一般实验室不可能储备得种类齐全而又充足，另外许多试剂还依赖进口，购买周 期长，这就会迫使实验中途停止，致使实验效率严重降低，有的实验不能中途停顿，就可能 使整个实验全部失败。我们建议实验人员在做分子生物学实验之前，应在基础知识、实验方 法、实验材料及实验试剂上有充分的准备，在实验时间上做好充分的安排，以保证实验的顺 利开展。 5．侥幸心理 侥幸心理是基因工程实验中致使实验人员犯错误最多的原因，想省时间、省步骤及因对 前一步实验盲目自信是产生这种心理的主要原因。因为基因工程实验方法是在依据分子生物 学基础理论的基础上，辅以前人大量的实验经验而建立的，实验条件的细小改变，不一定会 使实验失败，但几个步骤的细小改变，累积起来必出大错。做基因工程实验每个步骤的结果， 在能够检测的条件下都应检测，否则不应进入下一步实验。由于各种原因，实验人员经常省 略检测这一步，从表面看省了事，实际上使后面的实验失去了保证，最后实验失败且连原因
都找不出，对重做实验也无补益。结果是花费更多的时间，还浪费了宝贵的样品和试剂。例如某人从克隆载体上分离基因，限制性内切酶酶切后没有检测是否切动、是否完全，即进入电泳分离基因，电泳完在紫外光下收割基因片段时，才看到载体DNA根本没有切断，只好重做。还有的人在前面的情况下，抱一种侥幸心理，认为可能会有少量基因切下，在基因DNA电泳应出现的位置割胶分离，将假想分离到的基因直接进行克隆。当然这些人的侥幸心理是有基础的，因为基因DNA分子太少，在EB染色中是看不到的，但这样做实验成功的机会甚微从我们实验室统计的情况看，花的时间成倍地多。总之，侥幸心理是导致实验失败最大的原因，是实验人员最总讳的事，所有的人都应加以杜绝。我们建议实验人员充分安排好实验，严格按照每一实验步骤的要求操作。当实验中出现没有把握的情况时，应停止实验，寻找原因加以克服，或找有经验的同行来解决问题，直到有把握再进入下一步实验。我们之所以在这里一再强调这一点，是因为在这方面犯错误的人太多太多，有经验的和没经验的人都不例外。（二）操作问题在基因工程实验中，经常要进行微生物学方面、生物化学方面及仪器方面等等的操作，不解这些操作的要求，也会影响实验人员的实验工作，甚至可能使实验室造成重大损失，所以每个实验人员进入实验室时，必须参阅有关的书籍，或请有经验的人员演示说明，方可开展实验。另外要着重说明的一点是做标签，由于实验室做实验的人员通常都很多，每人自己的样品较易与他人的样品混淆，自己的样品之间太多时也易混淆：许多样品需要保存的时间较长，到时可能找不到，所以手头的样品、试剂应随手标好。标签应写明样品名称、日期和配制人姓名，应牢靠、不能模糊。（三）试剂问题在基因工程实验中，要用到多种试剂，并且对试剂的要求十分严格，主要表现为：1，试剂等级不够，如应该用分析纯的误用了化学纯；2．试剂配制不当，如有的化学试剂结晶体，含有水分子，在称量时没有扣除它的份额，配制的试剂浓度过低；3.除菌条件不对，某些试剂应过滤除菌，另一些试剂应高温高压灭菌；4.试剂污染，如称量时，取用试剂时，别人污染时都可能造成污染；5.试剂储存时间过长，如测序用的丙烯酰胺胶母液，在4℃条件下只能存放一个月；6.试剂保存不当，如有的试剂应保存在-20℃下，另一些试剂则只能在室温下保存。所以实验人员在配制试剂时，要严格按各个特定试剂的配制要求来操作。（四）背景知识问题第一是对研究课题的背景知识了解不够。实验人员不知道实验要解决何种问题，怎样解决问题，不知道采用何种技术路线最有效地解决问题，这一现象是够严重的；第二是对具体IⅢI
III 都找不出，对重做实验也无补益。结果是花费更多的时间，还浪费了宝贵的样品和试剂。例 如某人从克隆载体上分离基因，限制性内切酶酶切后没有检测是否切动、是否完全，即进入 电泳分离基因，电泳完在紫外光下收割基因片段时，才看到载体 DNA 根本没有切断，只好重 做。还有的人在前面的情况下，抱一种侥幸心理，认为可能会有少量基因切下，在基因 DNA 电 泳应出现的位置割胶分离，将假想分离到的基因直接进行克隆。当然这些人的侥幸心理是有 基础的，因为基因 DNA 分子太少，在 EB 染色中是看不到的，但这样做实验成功的机会甚微， 从我们实验室统计的情况看，花的时间成倍地多。总之，侥幸心理是导致实验失败最大的原 因，是实验人员最忌讳的事，所有的人都应加以杜绝。我们建议实验人员充分安排好实验， 严格按照每一实验步骤的要求操作。当实验中出现没有把握的情况时，应停止实验，寻找原 因加以克服，或找有经验的同行来解决问题，直到有把握再进入下一步实验。我们之所以在 这里一再强调这一点，是因为在这方面犯错误的人太多太多，有经验的和没经验的人都不例 外。 (二)操作问题 在基因工程实验中，经常要进行微生物学方面、生物化学方面及仪器方面等等的操作， 不解这些操作的要求，也会影响实验人员的实验工作，甚至可能使实验室造成重大损失，所 以每个实验人员进入实验室时，必须参阅有关的书籍，或请有经验的人员演示说明，方可开 展实验。另外要着重说明的一点是做标签，由于实验室做实验的人员通常都很多，每人自己 的样品较易与他人的样品混淆， 自己的样品之间太多时也易混淆；许多样品需要保存的时 间较长，到时可能找不到，所以手头的样品、试剂应随手标好。标签应写明样品名称、日期 和配制人姓名，应牢靠、不能模糊。 (三)试剂问题 在基因工程实验中，要用到多种试剂，并且对试剂的要求十分严格，主要表现为：1，试 剂等级不够，如应该用分析纯的误用了化学纯；2．试剂配制不当，如有的化学试剂结晶体， 含有水分子，在称量时没有扣除它的份额，配制的试剂浓度过低；3．除菌条件不对，某些试 剂应过滤除菌，另一些试剂应高温高压灭菌；4．试剂污染，如称量时，取用试剂时，别人污 染时都可能造成污染；5．试剂储存时间过长，如测序用的丙烯酰胺胶母液，在 4℃条件下只 能存放一个月；6．试剂保存不当，如有的试剂应保存在-20℃下，另一些试剂则只能在室温 下保存。所以实验人员在配制试剂时，要严格按各个特定试剂的配制要求来操作。 (四)背景知识问题 第一是对研究课题的背景知识了解不够。实验人员不知道实验要解决何种问题，怎样解 决问题，不知道采用何种技术路线最有效地解决问题，这一现象是够严重的；第二是对具体
的实验原理不懂，以至不能正确地分析实验现象，不能灵活地解决实验中遇到的问题。我们建议实验人员尽可能多地占有有关课题的背景资料，详细地阅读和理解有关的实验资料（五）安全问题在生物实验中，实验人员经常要接触到一些对人体有害的实验试剂，如溴化乙锭（EB）、内烯酰胺等，它们或者可能诱发癌症，或者对人神经系统产生累积毒害。因此，为了实验人员的人身安全，每一个人都应严格按照实验安全操作的有关要求进行操作。另一个问题是，实验室经常要使用酒精、有机溶剂、水及电器，有可能导致爆炸或人员中毒死亡，实验室水龙头未关，下水道堵塞造成实验室水灾，实验室人员触电等时有发生，所以每一个实验人员在离开实验室时都应注意检查水、电、煤气，有关用电设备都应按操作说明使用，以防止不必要的人身意外伤亡。IV
IV 的实验原理不懂，以至不能正确地分析实验现象，不能灵活地解决实验中遇到的问题。我们 建议实验人员尽可能多地占有有关课题的背景资料，详细地阅读和理解有关的实验资料。 (五)安全问题 在生物实验中，实验人员经常要接触到一些对人体有害的实验试剂，如溴化乙锭（EB）、 丙烯酰胺等，它们或者可能诱发癌症，或者对人神经系统产生累积毒害。因此，为了实验人 员的人身安全，每一个人都应严格按照实验安全操作的有关要求进行操作。另一个问题是， 实验室经常要使用酒精、有机溶剂、水及电器，有可能导致爆炸或人员中毒死亡，实验室水 龙头未关，下水道堵塞造成实验室水灾，实验室人员触电等时有发生，所以每一个实验人员 在离开实验室时都应注意检查水、电、煤气，有关用电设备都应按操作说明使用，以防止不 必要的人身意外伤亡