重复以上步骤，保证光束于最小和最大状态下都位于荧光屏中心。B.C2聚光镜象散矫正若光斑呈椭圆形，则说明c2聚光镜有象散，需要矫正选择Stigmator功能（如下图），点Condenser。WorkseSetupSearch|CoreraTuneAlignnStigrLitractionCondensarCbioctvNoneStepsize0.075710.00000.103510.00000D.0DO00如下图，使用面板中的多功能按钮，调节X和Y方向上的象散校正线圈的强度，使光束变圆并且能够同心散开。C.点击调节页中的None按钮，结束象散调节。(5)Directalignment如下图所示，转到用户界面中的调节页，选择直接调节项目。A. Beam tilt pivot point依次选择下图中红框内的每一项，使用控制面板上的多功能调节旋钮，使荧光屏中的两束光重合，且颤动最小
重复以上步骤，保证光束于最小和最大状态下都位于荧光屏中心。 B. C2聚光镜象散矫正 若光斑呈椭圆形，则说明C2聚光镜有象散，需要矫正选择Stigmator功能（如下图），点Condenser。 如下图，使用面板中的多功能按钮，调节X和Y方向上的象散校正线圈的强度，使光束变圆并且能够同心散 开。 C. 点击调节页中的None按钮，结束象散调节。 （5）Direct alignment 如下图所示，转到用户界面中的调节页，选择直接调节项目。 A. Beam tilt pivot point 依次选择下图中红框内的每一项，使用控制面板上的多功能调节旋钮，使荧光屏中的两束光重合，且颤动 最小
DirectAlignmentsGun Tit-Gun ShiftBeamtppxBeammppYBeamshiTomo Boam ghitRotofion centerTomo Potation center-DoneB.Beam shift选择Beamshift项目，使用多功能调节旋钮，将光束移动至荧光屏中央（6）物镜光栏居中及物镜象散矫正A.物镜光栏居中在diffraction模式下插入物镜光栏（一般生物样品用三号光栏）调节物镜光栏上的X/Y旋钮将物镜光栏居中。.CCD/TVCamnraTioCed司ControlletcoACemera0.0625ugrationtine (s)1024X1024ImagetremeBinnrgSearchPrautewAcqureM吸行B.物镜象散矫正在有碳膜区域，稍欠焦状态下，CCD观察，如上图，激活LiveFFT,Stigma-→objective→MFX/Y将傅立叶环调成圆形。(7）Gainreference（选做，做ET必须要做的一步）A.去除暗电流：（a）找一个空白区域，光散开。(b）关掉column。(c)CCD/TV CameraBiasgain reference-All Bias。B.Gain reference(a）开column。（b）在空白区域，光散开至整个荧屏。（c）点击Allgain。C.检测gainreference的效果(a）Acquire—张图。(b）点击TIA软件右边的Auto-Correlation(做的好的状态是只有中间有一个亮点)。注：做冷冻电镜时，上述的电镜基础调节步骤需要在Exposure模式下做
B. Beam shift 选择Beam shift项目，使用多功能调节旋钮，将光束移动至荧光屏中央。 （6）物镜光栏居中及物镜象散矫正 A. 物镜光栏居中 在diffraction模式下插入物镜光栏（一般生物样品用三号光栏），调节物镜光栏上的X/Y旋钮将物镜光栏居 中。 B. 物镜象散矫正 在有碳膜区域，稍欠焦状态下，CCD观察，如上图，激活Live FFT,Stigma→objective→MF X/Y将傅立叶 环调成圆形。 （7）Gain reference（选做，做ET必须要做的一步） A. 去除暗电流： （a）找一个空白区域，光散开。 （b）关掉column。 （c）CCD/TV Camera→Bias gain reference→All Bias。 B. Gain reference （a）开column。 （b）在空白区域，光散开至整个荧屏。 （c）点击All gain。 C. 检测gain reference的效果 （a）Acquire一张图。 （b）点击TIA软件右边的Auto-Correlation(做的好的状态是只有中间有一个亮点)。 注：做冷冻电镜时，上述的电镜基础调节步骤需要在Exposure模式下做
5.样品观察lowdose（1）选定Search、Focus和Exposure所需要的放大倍数及Spotsize及所需要的光斑大小。（2）Search模式与Exposure模式位置对准，找一个明显的样品参照物，在Exposure模式下用样品扭杆将参照物移到视眼中央，在切换到Search模式下，点击lowdose→option→searchshift,调节MFX/Y，将参照物移到视眼中央。（3）在Search模式下寻找样品，Focus模式下调节焦距，Exposure模式下拍照。5.4冷冻电镜样品制备简介（INTRODUCTION）在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，就叫做冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜（cryoelectronmicroscopy,cryo-EM)。冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包括样品制备、透射电子显微镜成像，图像处理及结构解析等几个基本步骤（图1）在透射电子显微镜成像中，电子枪产生的电子在高压电场中被加速至亚光速并在高真空的显微镜内部运动。根据高速运动的电子在磁场中发生偏转的原理，透射电子显微镜中的一系列电磁透镜对电子进行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作用的电子进行聚焦成像以及放大，最后在记录介质上形成样品放大几干倍至几十万倍的图像，利用计算机对这些放大的图像进行处理分析即可获得样品的精细结构。样品需求量少：一个冷冻样品只需要3~5μL0.1~1μmol的蛋白质溶液：更接近生理状态：冷冻电子显微学通过将样品快速冷却至玻璃态冰达到固定生物含水样品的目的，其观察的结构信息基本上反映样品冷却前的瞬时状态：适用研究对象广泛：从细胞、细胞器到分子量在200kD以上（最近的一些工作报道了分子量在200kD以下的蛋白质分子的冷冻电镜结构）的大分子复合体。样品溶液冰冻含水样品嵌膜载网薄碳膜具载网液氨冷却冷冻电镜观察计算机图像处理与三维重构数字化电子显微图像收集电子豆微图像材料（MATERIALS)器械（EQUIPMENT）Vitrobot实验步骤（PROCEDURE）Vitrobot制样基本操作
5. 样品观察 low dose （1）选定Search、Focus和Exposure所需要的放大倍数及Spot size及所需要的光斑大小。 （2）Search模式与Exposure模式位置对准，找一个明显的样品参照物，在Exposure模式下用样品扭杆将 参照物移到视眼中央，在切换到Search模式下，点击low dose→option→search shift,调节MF X/Y，将参照物移 到视眼中央。 （3）在Search模式下寻找样品，Focus模式下调节焦距，Exposure模式下拍照。 5.4 冷冻电镜样品制备 简介（INTRODUCTION） 在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，就叫做冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜(cryoelectron microscopy，cryo-EM)。 冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包括样品制备、透 射电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤（图1）。在透射电子显微镜成像中，电子枪产生的电 子在高压电场中被加速至亚光速并在高真空的显微镜内部运动。根据高速运动的电子在磁场中发生偏转的原 理，透射电子显微镜中的一系列电磁透镜对电子进行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作用的电子进 行聚焦成像以及放大,最后在记录介质上形成样品放大几千倍至几十万倍的图像，利用计算机对这些放大的图像 进行处理分析即可获得样品的精细结构。 样品需求量少：一个冷冻样品只需要3~5 μL 0.1~1 μmol 的蛋白质溶液；更接近生理状态：冷冻电子显微 学通过将样品快速冷却至玻璃态冰达到固定生物含水样品的目的，其观察的结构信息基本上反映样品冷却前的 瞬时状态；适用研究对象广泛：从细胞、细胞器到分子量在200 kD以上（最近的一些工作报道了分子量在200 kD以下的蛋白质分子的冷冻电镜结构）的大分子复合体。 材料（MATERIALS） 器械（EQUIPMENT） Vitrobot 实验步骤（PROCEDURE） Vitrobot制样基本操作
1.加水：用针筒从下面软管注入纯水，大约20~30mL。2.装滤纸：打开机器，装上滤纸，点击Resetblotpaper。Blot污点。3.设置参数（1）Console下设置：温度（一般设置为22C），湿度（设为100%）（2）Options下设置：A.Miscellaneous:选上"UseFootpedal"、"HumidifierOffduringProcess”、“SkipGridTransfer"B.Processpaprameter下设置以下参数Blottime（S）：滤纸吸附铜网液体时间Blotforce：滤纸夹铜网的力度Waittime（S）：吸附前的等待时间Blottotal：滤纸吸附次数Draintime（S）：Blot后的等待时间Skipapplication：跳过加样4.EthaneContainer准备工作从中间的孔加液氮，充满整个EthaneContainer，让其冷却。等中间孔中液氮挥发完后再向孔中加少许液氮再次冷却，同时将孔外面液氮加满。等孔中的液氮完全挥发后开始通乙烷，乙烷加八分满。待乙烷固液共存状态时移走导热杆。注：等孔中液氮完全挥发后开始通乙烷。液氮干净新鲜，液氮罐干燥。5.制样（1）装镊子镊子夹好铜网后（铜网需事先做glowdischarge），装在vitrobot上，让铜网正面朝右，镊子有字一面朝向操作者。踩一下脚踏板，将镊子升上去注：铜网要夹紧（2）将EthaneContainer放在操作台上，踩一下脚踏板，将EthaneContainer升上去（3）打开Humidity，将湿度升到100%后关掉。（4）踩一下脚踏板，镊子掉下一点，加样品。（5）踩一下脚踏板，滤纸吸附多余样品一镊子快速掉进乙烷中一EthaneContainer降下来（6）补充液氮，取下镊子。注意不能碰撞铜网，也不能将铜网离开乙烷。（7）将EthaneContainer转移至桌面，松开镊子上的固定圈，将铜网迅速转移到液氮中然后转移至样品盒内。6.收尾工作取出滤纸，镊子用电吹风吹干，将Container中的液氮和乙烷倒掉后放入通风橱风干，退出程序关机，关闭Vitrobo的电源。抽出剩余的纯水。将所有物品归位，登记使用记录。5.5蛋白结晶实验5.5.1结晶筛选简介（INSTRUCTION）蛋白结晶是一个有序化过程：即蛋白质由在溶液中随机状态转变成有规则排列的状态。当蛋白质溶液达到过饱和状态时，能够形成一定大小的晶核，溶液中分子失去自由运动的能量，不断结合到形成的晶核上而长成适合X射线衍射的晶体。结晶过程分为两步：首先形成晶核，而后形成晶体。其中形成晶核是一个关键的步
1. 加水：用针筒从下面软管注入纯水，大约20~30 mL。 2. 装滤纸：打开机器，装上滤纸，点击Resetblotpaper。Blot污点。 3. 设置参数 （1）Console下设置：温度（一般设置为22 °C），湿度（设为100%） （2）Options下设置： A. Miscellaneous： 选上“Use Footpedal”、“ Humidifier Off during Process”、“ Skip Grid Transfer” B. Process paprameter下设置以下参数： Blot time（S）：滤纸吸附铜网液体时间 Blot force：滤纸夹铜网的力度 Wait time（S）：吸附前的等待时间 Blot total：滤纸吸附次数 Drain time（S）：Blot后的等待时间 Skip application：跳过加样 4. Ethane Container准备工作 从中间的孔加液氮，充满整个Ethane Container，让其冷却。等中间孔中液氮挥发完后再向孔中加少许液 氮再次冷却，同时将孔外面液氮加满。等孔中的液氮完全挥发后开始通乙烷，乙烷加八分满。待乙烷固液共存 状态时移走导热杆。 注：等孔中液氮完全挥发后开始通乙烷。液氮干净新鲜，液氮罐干燥。 5. 制样 （1）装镊子 镊子夹好铜网后（铜网需事先做glow discharge），装在vitrobot上，让铜网正面朝右，镊子有字一面朝向 操作者。踩一下脚踏板，将镊子升上去。 注：铜网要夹紧 （2）将Ethane Container放在操作台上，踩一下脚踏板，将Ethane Container升上去。 （3）打开Humidity，将湿度升到100%后关掉。 （4）踩一下脚踏板，镊子掉下一点，加样品。 （5）踩一下脚踏板，滤纸吸附多余样品→镊子快速掉进乙烷中→Ethane Container降下来 （6）补充液氮，取下镊子。注意不能碰撞铜网，也不能将铜网离开乙烷。 （7）将Ethane Container转移至桌面，松开镊子上的固定圈，将铜网迅速转移到液氮中然后转移至样品盒 内。 6. 收尾工作 取出滤纸，镊子用电吹风吹干，将Container中的液氮和乙烷倒掉后放入通风橱风干，退出程序关机，关闭 Vitrobot的电源。抽出剩余的纯水。将所有物品归位，登记使用记录。 5.5 蛋白结晶实验 5.5.1 结晶筛选 简介（INSTRUCTION） 蛋白结晶是一个有序化过程：即蛋白质由在溶液中随机状态转变成有规则排列的状态。当蛋白质溶液达到 过饱和状态时，能够形成一定大小的晶核，溶液中分子失去自由运动的能量，不断结合到形成的晶核上而长成 适合 X 射线衍射的晶体。结晶过程分为两步：首先形成晶核，而后形成晶体。其中形成晶核是一个关键的步
骤。以蛋白结晶的相变过程简要介绍结晶的一般方法以及涉及到的关键因素。有4种主要的蛋白结晶方法(I）批量结晶法（Microbatch）；（1）气相扩散法（VaporDiffusion）；（Il）透析法（Dialysis）；(IV)自由界面扩散法（FreeInterfaceDiffusion）。尤以气相扩散法最为常用，又细分为悬滴法（HangingDrop）和坐滴法（图SittingDrop）。蛋白浓度、沉淀剂浓度、添加剂浓度、pH、温度等都是影响蛋白结晶的关键因素这里以气相扩散法来说明蛋白结晶的相变过程（图PhaseDiagram），假定浓缩的蛋白溶液与母液以一定比例混合后形成的液滴刚开始是澄清的，也就是说蛋白质分子尚处于非饱和状态，由于混合的液滴与下槽的母液都处于封闭环境中，并且母液的浓度要高于液滴的浓度，因此随看时间的延长，借助水蒸气的扩散，液滴的水分会逐渐减少，意味着其中的蛋白质浓度与沉淀剂浓度都会逐渐升高，直到条件变化至Nucleationzone中，晶核形成，随后溶液中的蛋白分子不断自发地结合到形成的晶核上从而长成适合X射线衍射的晶体，即相变至MetastablezoneNucleationzone至Metastablezone的过程中可以看到液滴中的蛋白浓度是直线下降的。CoverslipCoverslipwithprotein2solution (red)NRHigh-vacuumCCgreaseProtein solutior2Reservoirwitr1Reservoir solutiorprecipitantSittingdropHanging dropSunereatursolubilitcurvetasnaSolubility curveAdjustableparameters材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）目的蛋白、结晶板、凡士林、硅化盖玻片等耗材器械（EQUIPMENT）恒温培养箱、体视显微镜实验步骤（PROCEDURE）1.评估蛋白样品：浓度范围：5~25mg/mL；MBP融合蛋白尽量浓缩至30mg/mL，甚至50mg/mL以上。一般水溶性好的蛋白，初始浓度要求高一些。分子量小的蛋白，浓度要求高一些。分子量大的的蛋白，浓度要求低一些。在纯化到自的蛋日之后，点晶体之前，需要对自的蛋自做尽量多的状态评估，以提高实验效率。通常蛋自状态评估常见问题。（1）蛋白纯度。纯度是结晶性能最重要的前提条件。纯蛋白意味着翻译后修饰不存在异质性，也意味着杂质占总蛋白质的含量较低，如1%。可通过运行一块过载的凝胶电泳来检测蛋白纯度。如果要结晶蛋白-蛋白复合物，在建立结晶前需要进一步纯化，使形成复合物的蛋白从未形成复合物的蛋白中分离。（2）蛋白折叠。可检测蛋白活性，也可检测蛋白的圆二色谱（CD）来反应蛋白是否正确折叠
骤。以蛋白结晶的相变过程简要介绍结晶的一般方法以及涉及到的关键因素。有4种主要的蛋白结晶方法： （Ⅰ）批量结晶法（Microbatch）；（Ⅱ）气相扩散法（Vapor Diffusion）；（Ⅲ）透析法（Dialysis）；（Ⅳ） 自由界面扩散法（Free Interface Diffusion）。尤以气相扩散法最为常用，又细分为悬滴法（Hanging Drop）和 坐滴法（图Sitting Drop）。蛋白浓度、沉淀剂浓度、添加剂浓度、pH、温度等都是影响蛋白结晶的关键因素。 这里以气相扩散法来说明蛋白结晶的相变过程（图Phase Diagram），假定浓缩的蛋白溶液与母液以一定比例 混合后形成的液滴刚开始是澄清的，也就是说蛋白质分子尚处于非饱和状态，由于混合的液滴与下槽的母液都 处于封闭环境中，并且母液的浓度要高于液滴的浓度，因此随着时间的延长，借助水蒸气的扩散，液滴的水分 会逐渐减少，意味着其中的蛋白质浓度与沉淀剂浓度都会逐渐升高，直到条件变化至Nucleation zone中，晶核 形成，随后溶液中的蛋白分子不断自发地结合到形成的晶核上从而长成适合X射线衍射的晶体，即相变至 Metastable zone Nucleation zone至Metastable zone 的过程中可以看到液滴中的蛋白浓度是直线下降的。 材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS） 目的蛋白、结晶板、凡士林、硅化盖玻片等耗材 器械（EQUIPMENT） 恒温培养箱、体视显微镜 实验步骤（PROCEDURE） 1. 评估蛋白样品： 浓度范围：5~25 mg/mL；MBP 融合蛋白尽量浓缩至 30 mg/mL，甚至50 mg/mL以上。一般水溶性好的蛋 白，初始浓度要求高一些。分子量小的蛋白，浓度要求高一些。分子量大的的蛋白，浓度要求低一些。在纯化 到目的蛋白之后，点晶体之前，需要对目的蛋白做尽量多的状态评估，以提高实验效率。通常蛋白状态评估常 见问题。 （1）蛋白纯度。纯度是结晶性能最重要的前提条件。纯蛋白意味着翻译后修饰不存在异质性，也意味着杂 质占总蛋白质的含量较低，如1%。可通过运行一块过载的凝胶电泳来检测蛋白纯度。如果要结晶蛋白-蛋白复 合物，在建立结晶前需要进一步纯化，使形成复合物的蛋白从未形成复合物的蛋白中分离。 （2）蛋白折叠。可检测蛋白活性，也可检测蛋白的圆二色谱（CD）来反应蛋白是否正确折叠