每一种软件都可以在https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html上活得对应的manual材料（MATERIALS)试剂(REAGENTS)60μL高纯度蛋白样品（浓度在1~10mg/mL范围内、根据分子量、分子量越小浓度需要高一些、分子量越大浓度需要低一些），如果是胞内蛋白可以加2~10mMDTT作为radiationdamage保护剂。10mL严格对应的buffer器械（EQUIPMENT）同步辐射加速器19U2线站实验步骤（PROCEDURE）Data reduction1.将蛋白在1~10mg/mL之间用对应的buffer稀释三种梯度，并放在线站内的样品托盘上。2.在线站的软件上设置样品的名称，收集顺序以及保存路径关键步骤：这里需要注意的是，该软件是在linu环境下工作的，因此在样品名称中不得出现空格和/等符号，如果一定要用分割则用”下划线符号。还有，如果是在新的文件夹中开始收集，在NexttubeNo.上填写“1”，如果是在原来的路径中继续收集的话干万不要更改，不然同一个序号的数据后者会覆盖前者，这就意味看之前收集的数据需要重新收。3.打开光源，并点击run”，开始收集数据，在线站的ALBRA软件上检查detector收集的散射光图片是否正常，如果是圆形的光斑那就是正常的，如果边缘上有刺头那说明光路有问题，需要找线站的工作人员重新调整光路。4.收集好的数据传到线站中的另一台WindoWs电脑上，此电脑上已经安装好了RAW、ATSAS等分析软件。每一次收数据之前，线站的工作人员会帮我们调整好光路和设置，并保存一个cfg文件，打开RAW，先将路径调整至cfg文件所在的位置，并双击该文件，这样才可以导入当天的参数。5.然后将文件过滤成tif文件，每一个样品我们一般收集20张数据，选择某一个样品的20个数据，点击“plot”，此时旁边的窗口会显示20个曲线并且正常情况下会几乎重叠在一起，如果没有，将不重叠的那些数据删除，剩余的数据选择后点击"average"。平均出来的数据我们需要自行保存。6.一股每一个样品前后都会测对应的buffer，因此可以选择前面或者后面紧摸看的数据作为该样品的背景并扣除。将样品和buffer都进行平均后，在buffer数据旁边点亮“★”，并选择样品，点击"substract。此时得到的数据是将背景扣除后的样品纯粹的信息。同样，substract后的数据也需要保存，一般文章中提供的原始数据都是从substract开始展示，并且后面的一系列分析也都是基于这个原始数据来进行的。因此这一步要做好，不然后面的分析都不可信。7.substract后的数据可以用记事本打开，里面的数据可以用prism去重新绘图。Data analysis1.打开ATSAS软件中的"SASDataAnalysis”，将通过datareduction得到的substract数据拖到界面中2.一股比较三种浓度梯度的信号强度，保证S小的地方信号没有过度的条件下S大的地方信号尽可能少的波动。如果数据从头到尾都是信号很强的状态，那么这种数据偏artifitial。如果三种浓度梯度信号没有一个能满足这个条件，可以将高浓度的尾部和低浓度的头部进行merge，方法是通过软件中的"processing"中的"scale将高低浓度的数据进行拟合，使两个数据在某一点有重叠，再点击"merge"，这时软件会自动生成一个新的数据，而这数据可以用来后面的进一步分析。3.初步分析，一般需要看样品的回旋半径是否是浓度依赖的？Dmax是不是浓度依赖的？
每一种软件都可以在https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html上活得对应的manual。 材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS） 60 μL高纯度蛋白样品（浓度在1~10 mg/mL范围内、根据分子量、分子量越小浓度需要高一些、分子量越 大浓度需要低一些），如果是胞内蛋白可以加2~10 mM DTT作为radiation damage保护剂。 10 mL严格对应的buffer 器械（EQUIPMENT） 同步辐射加速器19U2线站 实验步骤（PROCEDURE） Data reduction 1. 将蛋白在1~10 mg/mL之间用对应的buffer稀释三种梯度，并放在线站内的样品托盘上。 2. 在线站的软件上设置样品的名称，收集顺序以及保存路径。 关键步骤：这里需要注意的是，该软件是在linux环境下工作的，因此在样品名称中不得出现空格和/等符 号，如果一定要用分割则用“_”下划线符号。还有，如果是在新的文件夹中开始收集，在Next tube No.上填 写“1”，如果是在原来的路径中继续收集的话千万不要更改，不然同一个序号的数据后者会覆盖前者，这就意味 着之前收集的数据需要重新收。 3. 打开光源，并点击“run”，开始收集数据，在线站的ALBRA软件上检查detector收集的散射光图片是否正 常，如果是圆形的光斑那就是正常的，如果边缘上有刺头那说明光路有问题，需要找线站的工作人员重新调整 光路。 4. 收集好的数据传到线站中的另一台Windows电脑上，此电脑上已经安装好了RAW、ATSAS等分析软件。 每一次收数据之前，线站的工作人员会帮我们调整好光路和设置，并保存一个cfg文件，打开RAW，先将路径调 整至cfg文件所在的位置，并双击该文件，这样才可以导入当天的参数。 5. 然后将文件过滤成tif文件，每一个样品我们一般收集20张数据，选择某一个样品的20个数据，点 击“plot”，此时旁边的窗口会显示20个曲线并且正常情况下会几乎重叠在一起，如果没有，将不重叠的那些数据 删除，剩余的数据选择后点击“average”。平均出来的数据我们需要自行保存。 6. 一般每一个样品前后都会测对应的buffer，因此可以选择前面或者后面紧挨着的数据作为该样品的背景并 扣除。将样品和buffer都进行平均后，在buffer数据旁边点亮“★”，并选择样品，点击“substract”。此时得到的数 据是将背景扣除后的样品纯粹的信息。同样，substract后的数据也需要保存，一般文章中提供的原始数据都是 从substract开始展示，并且后面的一系列分析也都是基于这个原始数据来进行的。因此这一步要做好，不然后 面的分析都不可信。 7. substract后的数据可以用记事本打开，里面的数据可以用prism去重新绘图。 Data analysis 1. 打开ATSAS软件中的“SAS Data Analysis”，将通过data reduction得到的substract数据拖到界面中。 2. 一般比较三种浓度梯度的信号强度，保证s小的地方信号没有过度的条件下s大的地方信号尽可能少的波 动。如果数据从头到尾都是信号很强的状态，那么这种数据偏artifitial。如果三种浓度梯度信号没有一个能满足 这个条件，可以将高浓度的尾部和低浓度的头部进行merge，方法是通过软件中的“processing”中的“scale”将高 低浓度的数据进行拟合，使两个数据在某一点有重叠，再点击“merge”，这时软件会自动生成一个新的数据，而 这数据可以用来后面的进一步分析。 3. 初步分析，一般需要看样品的回旋半径是否是浓度依赖的？Dmax是不是浓度依赖的？
TablexIs of the studied proteinsstructural paratProteinPDBuseAD.afmgyAD(KD.(3)(am)LD(%)(%）3生员员公公区医药育社学司H530321o.±0.0255 ±0.15733ohn资城研限医风院± 0.02Pum±00.660.062华甲甲营505±0.7± 0.1#503#R313.53±13215.85± 0.407.56 ± 0.1953.01±18814.6PrimusGuinierWeaPrimus-GuinierWearGoins sasinsbeCainr sattastod100020000Maa601D95.gw.00.0o0.0003.0050.00.00. 00.00050.00.0104.0,00050.0006.0.00c1.因为回旋半径就跟蛋白的等电点一样是样品的固有属性，原则上它不可能随着样品的浓度的变化而变化。Dmax是样品的最大直径，如果溶液中的样品是一个均匀的介质，那么这个也不会是浓度依赖的。如果Dmax随着浓度高而变大，那么极有可能是样品有很强的聚集能力，这种情况下我们只能用低浓度的数据。这里放一张回旋半径和对样的分子量的表格，回旋半径和分子量是呈正比的，分子量越大回旋半径也越大。回旋半径可以通过软件中的"radiusofgyration"即回旋半径，来进行计算，这里用到的是guinier公式，因此需要满足，并且需要让实际的样品曲线尽量和拟合后的线性曲线重叠。同时也要保证绿色的曲线的上下分布是均匀的，避免多数在上面或者下面。2.下面是Dmax的计算，点击"distancedistribution"，会出现如下图。我们需要关注的是p(r)vsr曲线的尾部需要平缓地往下走，如果是很陡的那种需要人为地在range中改变包括的点的数目来变化。上面的quality是表征这套数据的质量的标准，当然，这个数值越高越好，但我们更多还是要看圆圈中的图形。点的数目不需要太多，如果好的数据可以留很多点，但如果s很大的地方噪音很高的话，可以只留400~500个点，即到s在0.2左右的数据也是可以的。点击“finish"后会提醒保存数据，保存后可以用记事本打开，将里面的数据用prism重新画图。Modeling1.做完初级分析后，后面完全是根据实验目的来选择特定的软件，在SASDataAnalysis中已经整合了dammif、crysol、oligomer、Bodies等常用的软件。其他的软件全部都可以在ATSAS软件包中能找到，不同的软件在Embl-hamburg网站上都能找到manual，因此这里用dammif来介绍如何建模。2.点击“dammif，选择"manual"，在计算Rg中选择合适的点，在Dmax上参考第11步，也可以在前面把数据记下来，直接在这里输入，点击“next”，直到最后界面上。如果直到该样品的对称性可以选择，如果不知道默认是P1对称性。在anisometry上可以选择是球形还是长棍形，以及在angularscale上可以选择是nanometer还是angstrom级别的，默认都是unknown。在mode上可以选择fast或者slow，区别是计算时间上fast更快，并且模型中球的数量更少，但轮廓更明显。如果是slow模式的话，计算时间很长，模型中球的数量更多，轮廓不明显。在repetition上可以选择计算的轮数，可以自定义计算几轮，每一轮的计算产生一个模型，最后通过damaver和dammin进行refine后可以通过RMS比较来选择最优的值
1. 因为回旋半径就跟蛋白的等电点一样是样品的固有属性，原则上它不可能随着样品的浓度的变化而变 化。Dmax是样品的最大直径，如果溶液中的样品是一个均匀的介质，那么这个也不会是浓度依赖的。如果 Dmax随着浓度高而变大，那么极有可能是样品有很强的聚集能力，这种情况下我们只能用低浓度的数据。这里 放一张回旋半径和对样的分子量的表格，回旋半径和分子量是呈正比的，分子量越大回旋半径也越大。回旋半 径可以通过软件中的“radius of gyration”即回旋半径，来进行计算，这里用到的是guinier公式，因此需要满足， 并且需要让实际的样品曲线尽量和拟合后的线性曲线重叠。同时也要保证绿色的曲线的上下分布是均匀的，避 免多数在上面或者下面。 2. 下面是Dmax的计算，点击“distance distribution”，会出现如下图。我们需要关注的是p(r) vs r曲线的尾部 需要平缓地往下走，如果是很陡的那种需要人为地在range中改变包括的点的数目来变化。上面的quality是表征 这套数据的质量的标准，当然，这个数值越高越好，但我们更多还是要看圆圈中的图形。点的数目不需要太 多，如果好的数据可以留很多点，但如果s很大的地方噪音很高的话，可以只留400~500个点，即到s在0.2左右 的数据也是可以的。点击“finish”后会提醒保存数据，保存后可以用记事本打开，将里面的数据用prism重新画 图。 Modeling 1. 做完初级分析后，后面完全是根据实验目的来选择特定的软件，在SAS Data Analysis中已经整合了 dammif、crysol、oligomer、Bodies等常用的软件。其他的软件全部都可以在ATSAS软件包中能找到，不同的 软件在Embl-hamburg网站上都能找到manual，因此这里用dammif来介绍如何建模。 2. 点击“dammif”，选择“manual”，在计算Rg中选择合适的点，在Dmax上参考第11步，也可以在前面把数 据记下来，直接在这里输入，点击“next”，直到最后界面上。如果直到该样品的对称性可以选择，如果不知道默 认是P1对称性。在anisometry上可以选择是球形还是长棍形，以及在angular scale上可以选择是nanometer还 是angstrom级别的，默认都是unknown。在mode上可以选择fast或者slow，区别是计算时间上fast更快，并且 模型中球的数量更少，但轮廓更明显。如果是slow模式的话，计算时间很长，模型中球的数量更多，轮廓不明 显。在repetition上可以选择计算的轮数，可以自定义计算几轮，每一轮的计算产生一个模型，最后通过 damaver和dammin进行refine后可以通过RMS比较来选择最优的值
istaoeietrabatia/hn/lysytla/s7t:092000500.20.250.30.2an:Kisis针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.首先要明确实验自的，小角散射不像晶体衍射能解释到原子层次上，不同的自的需要用到的软件也是不一样的，如果只是为了数据，那么我还是建议大家把更多的心思放在长晶体上，不要觉得小角散射是个投机取巧的捷径。大部分情况下，小分子（小于80kD）且单体蛋白不适合做小角散射，前面也提到了蛋白越大越好，当然也不能是aggregate。如果是有规则的多聚体，那么可以用WAxS。2.其次，小角散射一般是辅助型实验，比较适合与晶体结构或者NMR联用，如果只是单纯SAXS数据因为其分辨率很低的因素，无法得到具体的结果，但有一点需要强调的是，它是检测蛋白在溶液中的构象的很方便的手段。因为同是溶液样品，NMR只能用在很小的样品，而SAXS在这一点没有什么限制。3.如果只要确定蛋白的形状，可以只去前面的数据，不需要取那么多数据。5.3负染简介（INTRODUCTION）负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧轴）对铺展在载网上的样品进行染色：吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果。可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。材料（MATERIALS）试剂(REAGENTS)2%或者3%醋酸铀器械（EQUIPMENT）Gatenplasmasystern、铜网、精细镊子、格式化的U盘、TecnaiG2120kv电镜实验步骤（PROCEDURE）一、TecnaiG2120kv电镜基本操作步骤1.准备步骤向冷阱中加液氮，如右图所示：电镜在在使用之前需要提前冷却，冷阱冷却镜桶大概需要1小时以上。（1）进入电镜控制系统（操作者需要进入自己的User账户），检查电脑屏幕右下角托盘中如右图图标是否为绿色（），按顺序启动，按顺序启动TUI（TecnaiUserInterface）和TIA（TEMImageandAnalysis）系统
针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 首先要明确实验目的，小角散射不像晶体衍射能解释到原子层次上，不同的目的需要用到的软件也是不 一样的，如果只是为了凑数据，那么我还是建议大家把更多的心思放在长晶体上，不要觉得小角散射是个投机 取巧的捷径。大部分情况下，小分子（小于80 kD）且单体蛋白不适合做小角散射，前面也提到了蛋白越大越 好，当然也不能是aggregate。如果是有规则的多聚体，那么可以用WAXS。 2. 其次，小角散射一般是辅助型实验，比较适合与晶体结构或者NMR联用，如果只是单纯SAXS数据因为 其分辨率很低的因素，无法得到具体的结果，但有一点需要强调的是，它是检测蛋白在溶液中的构象的很方便 的手段。因为同是溶液样品，NMR只能用在很小的样品，而SAXS在这一点没有什么限制。 3. 如果只要确定蛋白的形状，可以只去前面的数据，不需要取那么多数据。 5.3 负染 简介（INTRODUCTION） 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥 后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果。可以显示生物大分 子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。 材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS） 2%或者3%醋酸铀 器械（EQUIPMENT）Gaten plasma systern、铜网、精细镊子、格式化的U盘、Tecnai G2120kv电镜 实验步骤（PROCEDURE） 一、 Tecnai G2120kv电镜基本操作步骤 1. 准备步骤 向冷阱中加液氮，如右图所示：电镜在在使用之前需要提前冷却，冷阱冷却镜桶大概需要1小时以上。 （1）进入电镜控制系统（操作者需要进入自己的User账户），检查电脑屏幕右下角托盘中如右图图标是否 为绿色（ ），按顺序启动，按顺序启动TUI（Tecnai User Interface）和TIA（TEM Image and Analysis） 系统
（2）升高压，点HighTesion，将高压升至120kv。（3）开灯丝，点Filament（注：当长时间离开时，需关闭灯丝）。2.准备样品常规常温样品准备（1）制备带有样品的铜网。用Gatanplasmasystem等离子清洗机处理铜网，氢气氧气处理10秒将自锁镊子夹住铜网，正面朝上，加5μL样品，静置1min吸附。用滤纸边缘吸去多余样品，加5μL醋酸铀，静置1min染色。用滤纸边缘吸去多余染液，灯下烤干15min以上。注：样品多且对温度不敏感时，可在封口膜上多个样品同时操作。样品可保存一周。（2）按下图将样品铜网固定在样品杆上。（3）取出下图红色箭头处的工具（4）使用该工具将样品杆末端的弹簧夹起，用镊子把样品铜网放入样品。注：铜网插入电镜前，必须完全干燥。3.插入样品杆Vacuum (Expert)4Status:COL.VALVESPressureGun/ColLogb14LogComaraBufferterk36LogLogBackingtineCol ValvesClosed常温常规样品杆（1）设置抽真空时间：Vacuum>setting>pumpingtime>120s(2）检查镜筒阀是否关闭，黄色（Col.ValvesClosed）表示关闭。Setup>Col.ValvesClosedPi?Dpin positionC?6
（2）升高压，点High Tesion，将高压升至120 kv。 （3）开灯丝，点Filament（注：当长时间离开时，需关闭灯丝）。 2. 准备样品 常规常温样品准备 （1） 制备带有样品的铜网。 用Gatan plasma system等离子清洗机处理铜网，氢气氧气处理10秒。 将自锁镊子夹住铜网，正面朝上，加5 μL样品，静置1 min吸附。用滤纸边缘吸去多余样品，加5 μL醋酸 铀，静置1 min染色。用滤纸边缘吸去多余染液，灯下烤干15 min以上。 注：样品多且对温度不敏感时，可在封口膜上多个样品同时操作。样品可保存一周。 （2） 按下图将样品铜网固定在样品杆上。 （3） 取出下图红色箭头处的工具。 （4） 使用该工具将样品杆末端的弹簧夹掀起，用镊子把样品铜网放入样品。 注：铜网插入电镜前，必须完全干燥。 3. 插入样品杆 常温常规样品杆 （1）设置抽真空时间：Vacuum>setting>pumping time>120 s （2）检查镜筒阀是否关闭，黄色（Col.Valves Closed）表示关闭。Setup>Col.Valves Closed
（3）将样品末端的细小针尖（下图中红色箭头所示位置）对准样品台上的细缝（五点钟位置），插入样品杆。预抽循环将会自动开始，请等待直至样品台上红色指示灯熄灭。下图箭头所示红灯熄灭后，将样品杆逆时针旋转至少十二点钟位置，然后小心缓缓将样品放入。（4）检查设置页中镜筒真空读数，即Column值是否为20以下，若在20以下，即可打开镜筒阀，点击"Col.ValvesClosed"按钮，此时V4和V7阀会被打开，即可开始观察样品。4.电镜基础调节(1)EucentricFocus做alignment前，必须按下EucentricFocus，如下图所示：用Intensity改变光斑大小的时候，最好顺时照明（即顺时扩大光斑）WobblerEucentDiffractio06Fine CoarseFine Coa8+amshifsFoOCBeiltX-NFocussterZ-height3IntensityMagnification（2）调节Z-high，使样品位于Eucentricheight寻找样品中一特定物体作为参照物，激活AlphaWobbler，样品台正负15°摆动，调节Z轴按钮使荧光屏上的目标物近似不动，如下图所示aWobblerEucentricfocusDiffraction0ondJoysticlFocusZ-heightFocus stepMagnification(3)Guntilt激活Directalignment中的guntilt功能后，用MultifunctionX/Y旋钮将荧光屏上的电流值（screencurrent）调到最大，肉眼观察是调至光斑最亮时。（4）C2聚光镜光栏对中及象散矫正A.聚光镜光栏居中，插入聚光镜光栏（一般生物样品用3号光栏），Intensity逆时针聚拢电子束，BeamShift移光到中心，顺时散开电子束，若光斑与荧光屏不是同心相切则调节C2光栏上的XY（如下图所示）旋钮使光斑同心相切
（3）将样品末端的细小针尖（下图中红色箭头所示位置）对准样品台上的细缝（五点钟位置），插入样品 杆。预抽循环将会自动开始，请等待直至样品台上红色指示灯熄灭。下图箭头所示红灯熄灭后，将样品杆逆时 针旋转至少十二点钟位置，然后小心缓缓将样品放入。 （4）检查设置页中镜筒真空读数,即Column值是否为20以下，若在20以下，即可打开镜筒阀，点 击“Col.Valves Closed”按钮，此时V4和V7阀会被打开，即可开始观察样品。 4. 电镜基础调节 （1）Eucentric Focus 做alignment前，必须按下Eucentric Focus，如下图所示：用Intensity改变光斑大小的时候，最好顺时照明 （即顺时扩大光斑） （2）调节Z-high，使样品位于Eucentric height 寻找样品中一特定物体作为参照物，激活Alpha Wobbler，样品台正负15°摆动，调节Z轴按钮使荧光屏上的 目标物近似不动，如下图所示： （3）Gun tilt 激活Direct alignment中的gun tilt 功能后，用Multifunction X/Y旋钮将荧光屏上的电流值（screen current） 调到最大，肉眼观察是调至光斑最亮时。 （4）C2聚光镜光栏对中及象散矫正 A. 聚光镜光栏居中，插入聚光镜光栏（一般生物样品用3号光栏）， Intensity逆时针聚拢电子束，Beam Shift移光到中心，顺时散开电子束，若光斑与荧光屏不是同心相切， 则调节C2光栏上的X/Y（如下图所示）旋钮使光斑同心相切