1、mRMA的化 6分离纯化目的基因的mRNA是极其困难的,细胞 内含有3种以上的RNA,mRNA占细胞内总RNA总 量的2%~5%,相对分子质量大小很不一致,由 几百到几千个核苷酸组成。 6在真核细胞中mRNA的3末端常常含有一多聚 腺苷酸ρoA组成的末端,长达20~250个腺苷酸, 可采用 Oligo dT纤维素,以亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法是高浓度盐 溶液使mRNA特异结合于寡聚dT,再以低盐溶液 和蒸馏水将其洗脱,经过两次寡聚dT,可得到较 纯的mRNA
1、mRNA的纯化 分离纯化目的基因的mRNA是极其困难的，细胞 内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总 量的2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由 几百到几千个核苷酸组成。 在真核细胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚 腺苷酸polyA组成的末端，长达20~250个腺苷酸， 可采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法是高浓度盐 溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液 和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较 纯的mRNA
2、cDMA第一链的合成 6一般mRNA都带有3‘- polyA,所以可用寡聚dT 作为引物,在逆转录酶的催化下,开始CDNA链 的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记 的dNTP,在反应中以及反应后可通过测定放射 性标记的dNTP掺入量,计算出CDNA的合成效率; 在凝胶电泳后,进行放射自显影分析产物的分子 大小,探索最佳反应条件 6一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的mRNA有 5%~30%被拷贝
2、cDNA第一链的合成 一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT 作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链 的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记 的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射 性标记的dNTP掺入量，计算出cDNA的合成效率； 在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子 大小，探索最佳反应条件。 一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的mRNA有 5%~30%被拷贝
3、cDMA第二链的合成 6先用碱解或 RNaseh酶解的方法除去CDNA mRNA杂交链中的mRNA链,然后以CDNA第 链为模板合成第二链。由于第一链CDNA链 3‘末端往往形成一个发夹形结构,所以,可以 从这一点开始合成CDNA第二链。此反应是在 DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切 除单链DNA,因此用它可以切除发夹结构。发 夹结构结构切除后,双链CDNA分子的大小常用 变性琼脂糖凝胶电泳进行测定
3、cDNA第二链的合成 先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNAmRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一 链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链 3‘末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以 从这一点开始合成cDNA第二链。此反应是在 DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切 除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发 夹结构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用 变性琼脂糖凝胶电泳进行测定
4、cDMA克隆 用于CDNA克隆的载体有两类:质粒DNA(如pUC、 pBR322等)和噬菌体DNA(如λgt10、λgt1等)。根 据重组后插入的CDNA是否能够表达、能否经转录和翻 译合成蛋白质,又将载体分为表达型和非表达型载体 6pUC及λgt11为表达型载体,在CDNA插入位置的上游具 有启动基因顺序;而pBR322及gt10为非表达型载体 在CDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载 体 6CDNA插入片段小于10kb,可选质粒载体,如大于10kb 则应选用噬菌体DNA为载体。 6选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于 目的基因的筛选
4、cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、 pBR322等）和噬菌体DNA（如gt10、 gt11等）。根 据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻 译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体。 pUC及gt11为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具 有启动基因顺序；而pBR322及gt10为非表达型载体。 在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载 体。 cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb 则应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于 目的基因的筛选
CDMA文库 R. Young和 R Davis设计的gt10和gt11是噬菌 体克隆载体,可用于构建cDNA文库。一方面它 们具有较高的克隆效率,1 ng CDNA可产生5000 个克隆,另一方面又可容纳较大分子量的外源 DNA片段 因为筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更 方便,因此λgt10和λgt11类载体在构建文库时优 于质粒载体pBR322
cDNA文库 R. Young和R. Davis设计的gt10和gt11是噬菌 体克隆载体，可用于构建cDNA文库。一方面它 们具有较高的克隆效率，1ng cDNA可产生5000 个克隆，另一方面又可容纳较大分子量的外源 DNA片段。 因为筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更 方便，因此gt10和gt11类载体在构建文库时优 于质粒载体pBR322