(五)实验诊断方法 1.病原学检查 粪便直接涂片法、毛蚴孵化法、透明法、直肠活组织检査等,见教材PI43 2.免疫诊断法 (1)环卵沉淀试验:(示教) 实验方法参照教材P143 判断标准 虫卵周围沉淀物的直径小于10um +:虫卵周围的泡状沉淀物直径大于10um,累计面积小于虫卵面积的1/2,或 指状细长卷沉淀物不超过虫卵的长径。 ++:虫卵周围的沉淀物面积大于虫卵面积的1/2,指状沉淀物相当于或超过虫卵 的长径 十十+:沉淀物的面积大于虫卵的面积,指状沉淀物相当于或超过虫卵长径的二倍。 (2)快速ELSA法(小组操作) 实验原理 酶联免疫吸附试验( Enzyme-linked Immunologysorbent Assay, ELISA)已广泛用 于多种寄生虫感染的检测, FAST-ELISA是在 ELISA的基础上发展起来的一种快 速检测方法,它是用已知日本血吸虫可溶性抗原包被在特制的聚苯乙烯反应板孔 内,将待测血清加到反应孔内,如血清中含有相应的特异性抗体,即可形成抗原抗 体复合物。此时,如在反应孔内加入酶标记羊抗人IgG,再通过底物的显色反应即 可判断实验结果 特点:灵敏、快速、准确、简便 试剂盒内试剂名称:①号液:酶结合物②号液:洗涤液 ③号液:底物溶液 ④号液:显色剂⑤号液:血清稀释液⑥号液:终止液 检测程序
15 （五） 实验诊断方法 1. 病原学检查 粪便直接涂片法、毛蚴孵化法、透明法、直肠活组织检查等，见教材 P143 2. 免疫诊断法 (1) 环卵沉淀试验：(示教) 实验方法参照教材 P143 判断标准： －： 虫卵周围沉淀物的直径小于 10μm。 ＋： 虫卵周围的泡状沉淀物直径大于 10μm，累计面积小于虫卵面积的 1/2，或 指状细长卷沉淀物不超过虫卵的长径。 ＋＋：虫卵周围的沉淀物面积大于虫卵面积的 1/2，指状沉淀物相当于或超过虫卵 的长径。 ＋＋＋：沉淀物的面积大于虫卵的面积，指状沉淀物相当于或超过虫卵长径的二倍。 (2) 快速 ELISA 法（小组操作） 实验原理： 酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunologysorbent Assay, ELISA)已广泛用 于多种寄生虫感染的检测，FAST-ELISA 是在 ELISA 的基础上发展起来的一种快 速检测方法，它是用已知日本血吸虫可溶性抗原包被在特制的聚苯乙烯反应板孔 内，将待测血清加到反应孔内，如血清中含有相应的特异性抗体，即可形成抗原抗 体复合物。此时，如在反应孔内加入酶标记羊抗人 IgG，再通过底物的显色反应即 可判断实验结果。 特点：灵敏、快速、准确、简便。 试剂盒内试剂名称：①号液：酶结合物 ②号液：洗涤液 ③号液：底物溶液 ④号液：显色剂 ⑤号液：血清稀释液 ⑥号液：终止液 检测程序：
(1)样本稀释:8滴蒸馏水中加Ⅰ滴待测血清及1滴血清稀释液,混匀。对照阴 阳性血清作同样稀释。(此步已做) (2)加样:分别加稀释的待测血清和参考阴阳性血清各1滴于反应板孔中,室温放 置3~5分钟。抛尽后加1滴②号液,立即用自来水冲洗3次,抛尽,在吸水 纸上拍干 (3)反应:加①号液1滴,置室温3~5分钟,抛尽,加②号液1滴,立即用自来水 洗5次,抛尽,在吸水纸上拍干。 (4)显色:加③号液和④号液各1滴于孔中,室温静置30秒~3分钟(待阳性对 照显色而阴性对照未显色为准)后,加⑥号液1滴观察结果。 (5)结果判断:在白色背景下观察蓝色的深浅 :浅于阴性或与阴性对照一致;+:深于阴性对照,浅于阳性对 照 十十:与阳性对照相近:+++~++++:明显深于阳性对照。 (6)注意事项:①试剂置2~8℃保存,用前轻轻摇匀;②严格按检测程序操作 所有试剂应加入孔中,避免粘在壁上,加样后轻轻摇匀:③自来水冲时,水 流不能过猛,每次抛干后,在吸水纸上轻轻拍干;④室温低于15℃时,显色 时间应适当延长,以阳性对照出现明显蓝色而阴性对照孔基本无色为准。 (六)流行病学(示教) 1.晚期血吸虫病人照片。 2.血吸虫病流行区照片 3.灭螺方法照片。 (七)作业 1.标注成虫基本形态图
16 (1) 样本稀释：8 滴蒸馏水中加 1 滴待测血清及 1 滴血清稀释液，混匀。对照阴、 阳性血清作同样稀释。（此步已做） (2) 加样：分别加稀释的待测血清和参考阴阳性血清各 1 滴于反应板孔中，室温放 置 3～5 分 钟。抛尽后加 1 滴②号液，立即用自来水冲洗 3 次，抛尽，在吸水 纸上拍干。 (3) 反应:加①号液 1 滴，置室温 3～5 分钟，抛尽，加②号液 1 滴，立即用自来水 洗 5 次，抛尽，在吸水纸上拍干。 (4) 显色：加③号液和④号液各 1 滴于孔中，室温静置 30 秒～3 分钟（待阳性对 照显色而阴性对照未显色为准）后，加⑥号液 1 滴观察结果。 (5) 结果判断：在白色背景下观察蓝色的深浅 －：浅于阴性或与阴性对照一致； ＋：深于阴性对照，浅于阳性对 照； ＋＋：与阳性对照相近； ＋＋＋～＋＋＋＋：明显深于阳性对照。 (6) 注意事项：① 试剂置 2～8℃保存，用前轻轻摇匀；② 严格按检测程序操作， 所有试剂应加入孔中，避免粘在壁上，加样后轻轻摇匀；③ 自来水冲时，水 流不能过猛，每次抛干后，在吸水纸上轻轻拍干；④ 室温低于 15℃时，显色 时间应适当延长，以阳性对照出现明显蓝色而阴性对照孔基本无色为准。 （六） 流行病学（示教） 1．晚期血吸虫病人照片。 2．血吸虫病流行区照片。 3．灭螺方法照片。 （七） 作业 1．标注成虫基本形态图
2.绘虫卵形态图 3.写出解剖动物(兔)实验报告。 4.写出快速ELSA法检测日本血吸虫感染实验报告 思考: (1)根据动物感染结果,理解日本血吸虫对宿主可造成什么损害? (2)从生活史过程比较日本血吸虫与其它吸虫的感染方式和感染途径有何不同? (3)日本血吸虫的防治措施与其它吸虫比较有何不同?为什么? 参考资料 组织内各期血吸虫卵的性状: 由于虫卵发育的程度和虫卵死亡时间的不同,沉积在肠粘膜和其他组织内的 虫卵可有不同性状。通常可分为活卵,近期变性卵和死卵。 活卵:淡黄色,毛蚴轮廓清楚,壳薄、胚胎清楚。 近期变性卵:黄色带灰白或黄褐色,毛蚴萎缩成块状,壳稍厚但均匀,胚膜尚 清楚。 死卵:灰白色至黑色,内容物模糊或成块状裂开、壳厚而不平整,甚或破裂 2.虫卵分离方法: 以1500~2000条日本血吸虫尾蚴感染家兔。感染后42天将家兔处死,取 出肝脏,冲洗。除去成虫,把肝脏剪成小块,除去结缔组织,血管等。放入组 织捣碎机内,加1~2%盐水,用12,000转/分的速度捣碎,每次3分钟,间 歇5分钟,通常捣碎3~4次即可。 将捣碎的肝组织悬液加100毫升1%盐水调匀,用80、120目的铜筛过滤, 去渣将滤液分别盛装在尖底离心管内,1500转/分离心3分钟。此时管内分三 层,上层是清液,中层为肝组织碎片,下层为金黄色的虫卵和肝组织的混合物 吸去中、上层。将各管底层沉淀物加盐水制成悬液,然后合并,如此反复离心 沉淀,除去中上层,最后获得较纯净的虫卵
17 2．绘虫卵形态图。 3．写出解剖动物（兔）实验报告。 4．写出快速 ELISA 法检测日本血吸虫感染实验报告。 思考： (1) 根据动物感染结果，理解日本血吸虫对宿主可造成什么损害？ (2) 从生活史过程比较日本血吸虫与其它吸虫的感染方式和感染途径有何不同？ (3) 日本血吸虫的防治措施与其它吸虫比较有何不同？为什么？ 参考资料 1. 组织内各期血吸虫卵的性状： 由于虫卵发育的程度和虫卵死亡时间的不同，沉积在肠粘膜和其他组织内的 虫卵可有不同性状。通常可分为活卵，近期变性卵和死卵。 活卵：淡黄色，毛蚴轮廓清楚，壳薄、胚胎清楚。 近期变性卵：黄色带灰白或黄褐色，毛蚴萎缩成块状，壳稍厚但均匀，胚膜尚 清楚。 死卵：灰白色至黑色，内容物模糊或成块状裂开、壳厚而不平整，甚或破裂。 2. 虫卵分离方法： 以 1500～2000 条日本血吸虫尾蚴感染家兔。感染后 42 天将家兔处死，取 出肝脏，冲洗。除去成虫，把肝脏剪成小块，除去结缔组织，血管等。放入组 织捣碎机内，加 l～2％盐水，用 12，000 转／分的速度捣碎，每次 3 分钟，间 歇 5 分钟，通常捣碎 3～4 次即可。 将捣碎的肝组织悬液加 1000 毫升 1％盐水调匀，用 80、120 目的铜筛过滤， 去渣将滤液分别盛装在尖底离心管内，1500 转／分离心 3 分钟。此时管内分三 层，上层是清液，中层为肝组织碎片，下层为金黄色的虫卵和肝组织的混合物。 吸去中、上层。将各管底层沉淀物加盐水制成悬液，然后合并，如此反复离心 沉淀，除去中上层，最后获得较纯净的虫卵
3.荧光显微技术在寄生虫学方面的应用 几乎所有寄生虫(包括原虫、蠕虫等)都可用荧光显微技术进行研究。例如: 抗原抗体反应在组织和细胞的定位研究,追踪寄生虫在人体的转移过程,形态变 化和寄生虫病发病机理等。还可利用荧光抗体的免疫学特性研究抗体对寄生虫虫 体作用部位及宿主抵抗寄生虫侵袭的免疫反应机制等 免疫荧光法可检出特异性抗体或抗原。此法敏感性高,特异性同其他血清学 方法类似。现在较常用于血吸虫病,丝虫病和疟疾的研究和诊断。 4.死卵与活卵的染色鉴别法: 吖啶橙染色法原理:用吖啶橙处理后的生物标本,在荧光显微镜下含DNA 的成份发出绿色荧光,含RNA的成份发出红色荧光。因此,血吸虫卵经吖啶橙处 理后,初产期虫卵和空泡期虫卵因含丰富的RNA,故卵内呈现粗细不等的红色荧 光亮点。以后虫胚逐渐发育DMA迅速增加,分布在虫胚四周,形成黄绿色荧光的 胚团。虫卵内毛蚴发育成熟后,含丰富RNA的头腺发出明亮的橙红色荧光,而生 殖细胞和神经中枢发绿色荧光,整个虫卵呈红绿相嵌的荧光色彩。虫卵死亡后, 核酸逐渐分解,橙红色或绿色的特异荧光也相继消失。 方法:将带有血吸虫卵的肠粘膜(或其它组织)碎片置康氏管内,加入0.5 1.0毫升1:10,000吖啶橙溶液,摇荡,置37℃温箱内染色2小时,用P7.4PBS 洗涤两次。将组织碎片置载玻片上,覆以盖玻片,在荧光显微镜下检査 结果:活卵呈橙红色或红绿相嵌的荧光。 死卵无橙红色荧光亮点,或因吖啶橙不着色而使虫卵呈黄色自发荧 光 5.毛蚴孵化法 原理:成熟虫卵在适宜条件下,24h~48h可孵出毛蚴,且毛蚴具有向光性,向上性, 多在水面表层作直线运动。 方法:取新鲜受检粪便约30g,先经浓集法沉淀处理,将得到的沉渣倒入500ml 的三角烧瓶中,加清水(自来水要去氯)至瓶口,在20~30℃条件下孵化12 h~48h,用肉眼或放大镜观察结果 毛蚴:双目镜下观察,体表披棘毛,前端突出。主要根据以下特征辨认:()针尖大 小,长圆形,大小一致。(2)半透明,灰白色,有折光。(3)作直线的斜向或横 向运动。(4)一般在水面下1~4cm处 6.间接免疫荧光实验(IFA) 间接免疫荧光实验是敏感性高、特异性强、操作简便、所需反应物(抗原、 抗体)量少的一种免疫学实验。1FA系将已知抗原(组织切片)固定在玻片上,将待
18 3. 荧光显微技术在寄生虫学方面的应用 几乎所有寄生虫(包括原虫、蠕虫等)都可用荧光显微技术进行研究。例如： 抗原抗体反应在组织和细胞的定位研究，追踪寄生虫在人体的转移过程，形态变 化和寄生虫病发病机理等。还可利用荧光抗体的免疫学特性研究抗体对寄生虫虫 体作用部位及宿主抵抗寄生虫侵袭的免疫反应机制等。 免疫荧光法可检出特异性抗体或抗原。此法敏感性高，特异性同其他血清学 方法类似。现在较常用于血吸虫病，丝虫病和疟疾的研究和诊断。 4. 死卵与活卵的染色鉴别法： 吖啶橙染色法原理：用吖啶橙处理后的生物标本，在荧光显微镜下含 DNA 的成份发出绿色荧光，含 RNA 的成份发出红色荧光。因此，血吸虫卵经吖啶橙处 理后，初产期虫卵和空泡期虫卵因含丰富的 RNA，故卵内呈现粗细不等的红色荧 光亮点。以后虫胚逐渐发育 DNA 迅速增加，分布在虫胚四周,形成黄绿色荧光的 胚团。虫卵内毛蚴发育成熟后，含丰富 RNA 的头腺发出明亮的橙红色荧光，而生 殖细胞和神经中枢发绿色荧光,整个虫卵呈红绿相嵌的荧光色彩。虫卵死亡后， 核酸逐渐分解，橙红色或绿色的特异荧光也相继消失。 方法：将带有血吸虫卵的肠粘膜(或其它组织)碎片置康氏管内，加入 0.5～ 1.0 毫升 1：10，000 吖啶橙溶液，摇荡，置 37℃温箱内染色 2 小时，用 PH7.4PBS 洗涤两次。将组织碎片置载玻片上，覆以盖玻片，在荧光显微镜下检查。 结果：活卵呈橙红色或红绿相嵌的荧光。 死卵无橙红色荧光亮点，或因吖啶橙不着色而使虫卵呈黄色自发荧 光。 5.毛蚴孵化法 原理：成熟虫卵在适宜条件下，24h~48h 可孵出毛蚴，且毛蚴具有向光性，向上性， 多在水面表层作直线运动。 方法：取新鲜受检粪便约 30 g，先经浓集法沉淀处理，将得到的沉渣倒入 500ml 的三角烧瓶中，加清水（自来水要去氯）至瓶口，在 20~30℃条件下孵化 12 h~48 h，用肉眼或放大镜观察结果。 毛蚴：双目镜下观察，体表披棘毛，前端突出。主要根据以下特征辨认：⑴针尖大 小，长圆形，大小一致。⑵半透明，灰白色，有折光。⑶作直线的斜向或横 向运动。⑷一般在水面下 1~4cm 处。 6. 间接免疫荧光实验(IFA) 间接免疫荧光实验是敏感性高、特异性强、操作简便、所需反应物(抗原、 抗体)量少的一种免疫学实验。lFA 系将已知抗原(组织切片)固定在玻片上,将待
测抗体滴加到玻片上,如血清含有相应抗体,即可在特定部位与抗原起反应形成 抗原抗体复合物,此种复合物再与荧光色素标记的抗体反应,形成带荧光的抗原 抗体第二抗体的第二复合物,在荧光光源激发下,特异复合物呈现特异荧光。如待 测血清无特异抗体,则不形成特异复合物而不显荧光:如抗体特异性不同,则形成 特异复合物的位置不同,特异荧光可在组织切片不同部位显示出来。此法可用于 诊断或抗原定位 材料 ①抗原:感染日本血吸虫尾蚴约50天的家兔,解剖后取出肝脏及门脉系统中的血 吸虫虫体,洗净后置 Rossman’液中过夜,取出,在75%乙醇中洗去残存 Rossman’s液并在75%乙醇中贮存。按常规制成5微米切片,脱蜡后备用 ②第一抗体:感染日本血吸虫的家兔血清 ③第二抗体:异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG。 ④对比染色液:溶解10mg伊文思蓝于10ml磷酸盐缓冲液中,置冰箱待用 ⑤缓冲液:0.05MpH7.8磷酸盐缓冲液(PBS) ⑥正常家兔血清:用作对照。 反应步骤: ①用油性笔在玻片上组织切片周围划一小圈,加10μ1第一抗体于切片上,置湿 盒中在37℃温箱下反应30分钟。另一组织切片滴加正常家兔血清做对照 ②用0.05MpH7.8PBS轻轻彻底洗去第一抗体(注意切勿用力冲洗以免切片脱落) 玻片自然干燥。 ③预先用伊文思蓝液及PBS稀释第二抗体至工作浓度,使第二抗体工作液的伊文 思蓝最终浓度为2/10,000。加10μ1于切片上,置湿盒中37℃反应30分钟。 ④用PBS彻底洗去第二抗体,玻片自然干燥。 ⑤用0.MpH7.8PBS1ml加甘油9ml制成缓冲甘油液。加一滴于切片上,加盖玻 片。(注意勿使切片上残留小气泡,否则会影响观察)。 ⑥置荧光显微镜下观察结果。(用通过BG12十BG38滤光片产生的紫蓝光作激发 在紫蓝光的激发下,经荧光素标记第二抗体所形成的特异复合物的部位显现明 亮的黄绿色荧光,不形成特异复合物的部位因伊文思蓝着色的关系,呈现暗红色荧 光。依特异荧光的强弱及出现部位的不同,可对抗原的特异性和定位做出估计。与 阳性血清起反应的抗原按感染进程出现的先后顺序依次为肠相关抗原(GA)、膜相 关抗原(MAA)、虫卵可溶性抗原(SEA)及体抗原(SA) GAA:属诊断性抗原,定位于血吸虫成虫的肠上皮组织,有时在肠内容物中亦可见 到。呈现明亮的黄绿色荧光。在感染过程中最早出现(尾蚴感染后约4~5周),最 迟消退。MAA:主要为保护性抗原,定位于成虫表膜,在感染尾蚴后约5~6周出现, 荧光较弱,反应不够稳定。MA在诱发血吸虫保护性免疫中具有重要作用
19 测抗体滴加到玻片上，如血清含有相应抗体,即可在特定部位与抗原起反应形成 抗原抗体复合物,此种复合物再与荧光色素标记的抗体反应,形成带荧光的抗原 抗体第二抗体的第二复合物,在荧光光源激发下,特异复合物呈现特异荧光。如待 测血清无特异抗体,则不形成特异复合物而不显荧光；如抗体特异性不同,则形成 特异复合物的位置不同,特异荧光可在组织切片不同部位显示出来。此法可用于 诊断或抗原定位。 材料: ① 抗原：感染日本血吸虫尾蚴约 50 天的家兔，解剖后取出肝脏及门脉系统中的血 吸虫虫体，洗净后置 Rossman’液中过夜，取出,在 75％乙醇中洗去残存 Rossman’s 液并在 75％乙醇中贮存。按常规制成 5 微米切片，脱蜡后备用。 ② 第一抗体：感染日本血吸虫的家兔血清。 ③ 第二抗体：异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔 IgG。 ④ 对比染色液：溶解 10mg 伊文思蓝于 10ml 磷酸盐缓冲液中，置冰箱待用。 ⑤ 缓冲液：0．05M pH7.8 磷酸盐缓冲液(PBS)。 ⑥ 正常家兔血清：用作对照。 反应步骤: ① 用油性笔在玻片上组织切片周围划一小圈，加 10μl 第一抗体于切片上，置湿 盒中在 37℃温箱下反应 30 分钟。另一组织切片滴加正常家兔血清做对照。 ② 用 0.05M pH7.8PBS 轻轻彻底洗去第一抗体(注意切勿用力冲洗以免切片脱落)， 玻 片自然干燥。 ③ 预先用伊文思蓝液及 PBS 稀释第二抗体至工作浓度，使第二抗体工作液的伊文 思蓝最终浓度为 2／10，000。加 10 μl 于切片上，置湿盒中 37℃反应 30 分钟。 ④ 用 PBS 彻底洗去第二抗体，玻片自然干燥。 ⑤ 用 0.lM pH7.8PBS lml 加甘油 9ml 制成缓冲甘油液。加一滴于切片上，加盖玻 片。(注意勿使切片上残留小气泡，否则会影响观察)。 ⑥ 置荧光显微镜下观察结果。(用通过 BG12 十 BG38 滤光片产生的紫蓝光作激发 光)。 结果： 在紫蓝光的激发下，经荧光素标记第二抗体所形成的特异复合物的部位显现明 亮的黄绿色荧光，不形成特异复合物的部位因伊文思蓝着色的关系，呈现暗红色荧 光。依特异荧光的强弱及出现部位的不同，可对抗原的特异性和定位做出估计。与 阳性血清起反应的抗原按感染进程出现的先后顺序依次为肠相关抗原(GAA)、膜相 关抗原(MAA)、虫卵可溶性抗原(SEA)及体抗原(SA)。 GAA: 属诊断性抗原，定位于血吸虫成虫的肠上皮组织，有时在肠内容物中亦可见 到。呈现明亮的黄绿色荧光。在感染过程中最早出现(尾蚴感染后约 4～5 周)，最 迟消退。MAA：主要为保护性抗原，定位于成虫表膜，在感染尾蚴后约 5～6 周出现， 荧光较弱，反应不够稳定。 MAA 在诱发血吸虫保护性免疫中具有重要作用