《天津科技大学学报》：肿瘤免疫细胞治疗研究进展（天津科技大学生物工程学院）

网络出版时间:2017-12-1515:11:58 网络出版地址:htp/ kns cnki net/kcmsdetail/12.1355N.20171215.1511004html 第卷第期 天津科技大学学报 年月 Journal of Tianjin University of Science Technology DO:10.13364/jssn.l672-651020170183 肿瘤免疫细胞治疗研究进展 刁爱坡,赵青 (天津科技大学生物工程学院,天津300457) 摘要:肿瘤免疫细胞治疗是一种新型的肿瘤治疗模式,属于肿瘤免疫治疗范畴,旨在通过调节杋体的免疫细胞激活 状态达到治疗肿瘤的目的.随着肿瘤免疫学理论和技术的发展,肿瘤免疫细胞治疗在血液系统肿瘸和实体瘤的临床治 疗上均取得了显著的疗效,有望成为继手术、化疗、放疗和靶向治疗后恶性肿瘤治疗领域的又一场革新.本文仅就肿瘤 免疫细胞治疗中以嵌合抗原受体T细胞、自然杀伤细胞以及巨噬细胞为核心的免疫细胞治疗技术的囯内外研究情况 进行综述. 关键词:肿瘤免疫细胞治疗;嵌合抗原受体T细胞;自然杀伤细胞;巨噬细胞 中图分类号:R730.51文献标志码:A 文章编号:1672-6510(000000000-00 Research Progress in Immune Cell-mediated Cancer Therapy DIAO Aipo, ZHAO Qing ( College of Biotechnology, Tianjin University of Science Technology, Tianjin 300457, China Abstract: Immune cell-mediated cancer therapy is an innovative treatment for cancers which therapy and aims to treat tumor through regulating the immune response. Immune cell-mediated cancer therapy has achieved remarkable clinical effects on both hematological malignancies and solid tumors nological theory and technology. It make great advancements in cancer treatment after surgery, chemotherapy radiotherapy and targeted therapy. Here we summarized the research progress in immune cell-mediated cancer therapy using chimeric antigen receptor(CAR)T cells, natural killer(NK) cells or macrophage Key words: immune cell-mediated cancer therapy chimeric antigen receptor T cell; natural killer cells; macrophage 恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之 免疫和体液免疫,增强机体抗肿瘤能力,预防术后扩 近年来,随着生物技术的迅速发展,以调动机体的免散和复发.治疗肿瘤常用的肿瘤疫苗包括多肽疫苗 疫功能来清除肿瘤微小残留病灶或明显抑制肿瘤细核酸疫苗、重组病毒疫苗、细菌疫苗、树突细胞 胞增殖为基础的肿瘤免疫治疗,已被广泛研究和应用 (dendritic cel,DC)疫苗等免疫检查点阻断治疗 于临床并取得了一定疗效,成为继手术、放疗和化疗是通过阻断肿瘤微环境中的免疫抑制信号,即免疫检 之后的又一重要的肿瘤治疗手段 查点,解除免疫细胞活性抑制,增强抗肿瘤活性.目 肿瘤免疫治疗按照治疗的原理可分为非特异性前硏究最为深入的免疫检査点为细胞程序性死亡受 免疫调节剂治疗、肿瘤疫苗治疗、免疫检查点阻断治体1( programmed death1,PD-)/程序性死亡配体 疗和免疫细胞治疗.非特异性免疫调节剂治疗是通1( programmed death ligand 1,PDL1),以及细胞毒性 过使用干扰素、白细胞介素-2(I-2)、胸腺肽、胸腺肽淋巴T细胞抗原4( cytotoxic T-lymphocyte-associated α、香菇多糖、猪苓多糖、酵母多糖等增强机体免疫功 protein4,CTLA-4)67.免疫细胞治疗(cl- mediated 能,激活机体的抗肿瘤免疫应答.肿瘤疫苗治疗 immunotherapy)则是通过采集人体自身免疫细胞,经 是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性过体外修饰和培养,使其数量扩増成千倍增多,靶向 收稿日期:2017-06-28;修回日期:2017-11-10 基金项目:国家自然科学基金资助项目(31471335) 作者简介:刁爱坡(1971—),男,吉林人,教授;通信作者:赵青,讲师,zhaoqing@tust.edu.cn

第 卷 第 期 年 月 天津科技大学学报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. No. 收稿日期：2017-06-28；修回日期：2017-11-10 基金项目：国家自然科学基金资助项目(31471335) 作者简介：刁爱坡（1971—），男，吉林人，教授；通信作者：赵 青，讲师，zhao_qing@tust.edu.cn 肿瘤免疫细胞治疗研究进展 刁爱坡，赵 青 (天津科技大学生物工程学院，天津 300457) 摘 要：肿瘤免疫细胞治疗是一种新型的肿瘤治疗模式，属于肿瘤免疫治疗范畴，旨在通过调节机体的免疫细胞激活 状态达到治疗肿瘤的目的．随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，肿瘤免疫细胞治疗在血液系统肿瘤和实体瘤的临床治 疗上均取得了显著的疗效，有望成为继手术、化疗、放疗和靶向治疗后恶性肿瘤治疗领域的又一场革新．本文仅就肿瘤 免疫细胞治疗中以嵌合抗原受体 T 细胞、自然杀伤细胞以及巨噬细胞为核心的免疫细胞治疗技术的国内外研究情况 进行综述． 关键词：肿瘤免疫细胞治疗；嵌合抗原受体 T 细胞；自然杀伤细胞；巨噬细胞 中图分类号：R730.51 文献标志码：A 文章编号：1672-6510(0000)00-0000-00 Research Progress in Immune Cell-mediated Cancer Therapy DIAO Aipo，ZHAO Qing (College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China) Abstract：Immune cell-mediated cancer therapy is an innovative treatment for cancers，which belongs to tumor immuno￾therapy and aims to treat tumor through regulating the immune response．Immune cell-mediated cancer therapy has achieved remarkable clinical effects on both hematological malignancies and solid tumors with the development of tumor immu￾nological theory and technology．It might make great advancements in cancer treatment after surgery，chemotherapy， radiotherapy and targeted therapy．Here we summarized the research progress in immune cell-mediated cancer therapy using chimeric antigen receptor(CAR)T cells，natural killer(NK)cells or macrophage. Key words：immune cell-mediated cancer therapy；chimeric antigen receptor T cell；natural killer cells；macrophage 恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一. 近年来，随着生物技术的迅速发展，以调动机体的免 疫功能来清除肿瘤微小残留病灶或明显抑制肿瘤细 胞增殖为基础的肿瘤免疫治疗，已被广泛研究和应用 于临床并取得了一定疗效，成为继手术、放疗和化疗 之后的又一重要的肿瘤治疗手段． 肿瘤免疫治疗按照治疗的原理可分为非特异性 免疫调节剂治疗、肿瘤疫苗治疗、免疫检查点阻断治 疗和免疫细胞治疗．非特异性免疫调节剂治疗是通 过使用干扰素、白细胞介素–2(IL-2)、胸腺肽、胸腺肽 、香菇多糖、猪苓多糖、酵母多糖等增强机体免疫功 能，激活机体的抗肿瘤免疫应答[1–4]．肿瘤疫苗治疗 是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性 免疫和体液免疫，增强机体抗肿瘤能力，预防术后扩 散和复发．治疗肿瘤常用的肿瘤疫苗包括多肽疫苗、 核 酸 疫 苗 、重 组 病 毒 疫 苗 、细 菌 疫 苗 、树 突 细 胞 (dendritic cell，DC)疫苗等[5]．免疫检查点阻断治疗 是通过阻断肿瘤微环境中的免疫抑制信号，即免疫检 查点，解除免疫细胞活性抑制，增强抗肿瘤活性．目 前研究最为深入的免疫检查点为细胞程序性死亡受 体 1(programmed death 1，PD-1)/程序性死亡配体 1(programmed death ligand 1，PD-L1)，以及细胞毒性 淋巴 T 细胞抗原 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)[6–7]．免疫细胞治疗(cell-mediated immunotherapy)则是通过采集人体自身免疫细胞，经 过体外修饰和培养，使其数量扩增成千倍增多，靶向 DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20170183 网络出版时间：2017-12-15 15:11:58 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20171215.1511.004.html

天津科技大学学报第卷第期 性杀伤功能增强,然后再回输到患者体内,从而杀灭合区与胞内信号区进行信号转导的作用.胞内信号 血液及组织中的肿瘤细胞.免疫细胞治疗能够靶向转导区主要由T细胞受体 TCR/CD3链、免疫球蛋 肿瘤细胞而不伤及正常组织细胞,并可产生免疫记白Fc受体的y链或CD3e链构成,通常包含免疫受 忆,预防胂瘤复发.肿瘤免疫学研究及其临床应用已体酪氨酸活化基序( immunoreceptor tyrosine based 成为肿瘤治疗研究中开展最广泛、最深入的领域之 activation motifs, ITAMS),负责信号转导12 ,本文仅就肿瘤免疫细胞治疗中以嵌合抗原受体T 自1989年起,CAR结构不断改进,目前已发展 细胞、自然杀伤细胞以及巨噬细胞为核心的免疫细胞到第四代,如图2所示 疗技术的研究情况进行综述. 1“CAR2CAR 4 CARTRUCK AD△D 细胞因子 1嵌合抗原受体T细胞疗法 嵌合抗原受体( chimeric antigen receptor,CAR)T e gaewegmegwwmgoa 细胞免疫疗法是一种新型肿瘤免疫细胞疗法,1989 年由 Gross等提出,近几年被改良并应用到临床 中.它是将抗原抗体的高亲和性与T淋巴细胞的杀 伤作用相结合,通过构建特异性嵌合抗原受体,经基 因转导使T淋巴细胞表达特异性嵌合抗原受体,特 异性识别靶抗原从而杀伤靶细胞.目前,临床上CAR 图2四代CAR的嵌合受体组成 技术在血液系统肿瘤和实体瘤的治疗上均取得了明 Fig 2 1-4 generation of CARs 显的效果 第一代CAR胞内信号转导区只包含单一的 CART细胞的嵌合抗原受体的基础结构如图1TCR/CD3c链或Fe受体的y链或CD3链结构域,在 所示,其基础设计组成包括抗原结合区、跨膜区和胞体外实验中可以识别靶抗原并有效杀伤肿瘤细胞,同 内信号转导区. 时分泌INF-y,但是在临床试验中表现出体内存活时 链接肽 间短,回输3周后,外周血中无法检测到第一代 CART细胞13.第二代CAR胞内信号转导区除了 TCR/CD3c链结构域外,串联了一个协同刺激分子结 铰链区 构域(co- simulation domain,CSD),例如CD27、 CD28、CD34(OX40)或CD37(4-BB)等14-15 加入协同刺激分子后,第二代CAR-T细胞可以分泌 更多的I-2,细胞凋亡信号通路处于抑制状态,抗 原刺激后CAR-T细胞大量扩增15-16,弥补了第 图1嵌合抗原受体基础结构 代CAR-T细胞随着时间延长数量减少的缺陷.其 Fig 1 Schema of chimeric antigen receptor structure 中,加入CD28共刺激结构域,除了增强细胞持续活 抗原结合区由单链抗体( single chain fragment化外,还有效解除了调节性T细胞( regulatory T variable,cy)与铰链区(spce连接形成.单链抗体clTr)对CART的抑制作用,使第二代CAR 由轻链可变区(ⅥL)、重链可变区(Ⅴ⊕以及它们之间T细胞在肿瘤微环境中能够更好地发挥杀伤功能.第 的15个氨基酸(Gly4Ser)3, linker)链接肽组成,铰三代CAR是在 TCR/CD3链结构域的基础上,同时 链区通常来源于CD8四或者lgG抗原结合区对特串联了两个协同刺激分子结构域,可使T细胞持续 定肿瘤相关抗原( (tumor associated antigen,TAA)有特活化增殖,细胞因子持续分泌,增强杀伤肿瘤细胞作 异识别功能,其与TAA间的亲和力决定了CART用.体外分析二代与三代CAR-T细胞的功能并无明 细胞与靶细胞的结合能力.跨膜区 transmembrane显区别,但在针对不同肿瘤类型的小鼠模型中,它们 domain,TD)通常由同源或异源二聚体膜蛋白,如表现出不同的治疗活性..第四代CAR( T cells CD3、CD4、CD8、CD28组成,主要起着连接抗原结 redirected for universal cytokine killing, TRUCKs)除

·2· 天津科技大学学报 第 卷 第 期 性杀伤功能增强，然后再回输到患者体内，从而杀灭 血液及组织中的肿瘤细胞．免疫细胞治疗能够靶向 肿瘤细胞而不伤及正常组织细胞，并可产生免疫记 忆，预防肿瘤复发．肿瘤免疫学研究及其临床应用已 成为肿瘤治疗研究中开展最广泛、最深入的领域之 一，本文仅就肿瘤免疫细胞治疗中以嵌合抗原受体 T 细胞、自然杀伤细胞以及巨噬细胞为核心的免疫细胞 治疗技术的研究情况进行综述． 1 嵌合抗原受体 T细胞疗法 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T 细胞免疫疗法是一种新型肿瘤免疫细胞疗法，1989 年由 Gross 等[8]提出，近几年被改良并应用到临床 中．它是将抗原抗体的高亲和性与 T 淋巴细胞的杀 伤作用相结合，通过构建特异性嵌合抗原受体，经基 因转导使 T 淋巴细胞表达特异性嵌合抗原受体，特 异性识别靶抗原从而杀伤靶细胞．目前，临床上 CAR 技术在血液系统肿瘤和实体瘤的治疗上均取得了明 显的效果． CAR-T 细胞的嵌合抗原受体的基础结构如图 1 所示，其基础设计组成包括抗原结合区、跨膜区和胞 内信号转导区． 图 1 嵌合抗原受体基础结构 Fig. 1 Schema of chimeric antigen receptor structure 抗原结合区由单链抗体(single chain fragment variable，scFv)与铰链区(spacer)连接形成．单链抗体 由轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)以及它们之间 的 15 个氨基酸((Gly4,Ser)3，linker)链接肽组成，铰 链区通常来源于 CD8[9]或者 IgG[10]．抗原结合区对特 定肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)有特 异识别功能，其与 TAA 间的亲和力决定了 CAR-T 细胞与靶细胞的结合能力[11]．跨膜区(transmembrane domain，TD)通常由同源或异源二聚体膜蛋白，如 CD3、CD4、CD8、CD28 组成，主要起着连接抗原结 合区与胞内信号区进行信号转导的作用．胞内信号 转导区主要由 T 细胞受体 TCR/CD3ζ 链、免疫球蛋 白 Fc 受体的 γ 链或 CD3ε 链构成，通常包含免疫受 体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine_based activation motifs，ITAMs)，负责信号转导[12]． 自 1989 年起，CAR 结构不断改进，目前已发展 到第四代，如图 2 所示． 图 2 四代 CAR的嵌合受体组成 Fig. 2 1st -4th generation of CARs 第一代 CAR 胞内信号转导区只包含单一的 TCR/CD3ζ 链或 Fc 受体的 γ 链或 CD3ε 链结构域，在 体外实验中可以识别靶抗原并有效杀伤肿瘤细胞，同 时分泌 INF-γ，但是在临床试验中表现出体内存活时 间短，回输 3 周后，外周血中无法检测到第一代 CAR-T 细胞[13]．第二代 CAR 胞内信号转导区除了 TCR/CD3ζ 链结构域外，串联了一个协同刺激分子结 构域(co-simulation domain，CSD)，例如 CD27、 CD28、CDl34(OX40)或 CDl37(4-1BB)等[14–15]． 加入协同刺激分子后，第二代 CAR-T 细胞可以分泌 更多的 IL-2，细胞凋亡信号通路处于抑制状态，抗 原刺激后 CAR-T 细胞大量扩增[15–16]，弥补了第一 代 CAR-T 细胞随着时间延长数量减少的缺陷．其 中，加入 CD28 共刺激结构域，除了增强细胞持续活 化外，还有效解除了调节性 T 细胞(regulatory T cells，Treg)对 CAR-T 的抑制作用[17]，使第二代 CAR￾T 细胞在肿瘤微环境中能够更好地发挥杀伤功能．第 三代 CAR 是在 TCR/CD3ζ 链结构域的基础上，同时 串联了两个协同刺激分子结构域，可使 T 细胞持续 活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤细胞作 用．体外分析二代与三代 CAR-T 细胞的功能并无明 显区别，但在针对不同肿瘤类型的小鼠模型中，它们 表现出不同的治疗活性[15, 18]．第四代 CAR (T cells redirected for universal cytokine killing，TRUCKs)除

刁爱坡,等:肿瘤免疫细胞治疗研究进展 了嵌合抗原受体基因外,整合表达免疫因子、整合共 虽然CAR-T疗法的临床试验效果良好,但治疗 刺激因子配体,如促炎性细胞因子白细胞介素-过程中也存在着潜在的毒副作用,如较为常见的发 12(I-12)等,成功激活CAR的信号通路这种被热、皮疹、寒颤、低血压等,严重时可引起细胞因子释 改造后的T细胞可以在CAR识别靶抗原后,通过激放综合症、肿瘤溶解综合症等的.因此,为提高 活下游转录因子NFAT( nuclear factor activated T CAR-T的有效性和安全性,一系列可控型CART及 cels)来诱导表达ⅡL-12,从而招募环境中的其他免疫其他新型基因修饰T细胞技术应运而生,包括嵌合 细胞(树突状细胞、吞噬细胞和自然杀伤细胞等),参共刺激受体( chimeric co- stimulating receptors, 与对不表达靶抗原的肿瘤细胞的清除.同时,被募集CCRs)T细胞3、抗原特异性抑制受体 (antigen 在肿瘤附近的免疫细胞还可以通过分泌某些细胞因 specific inhibitory receptors,CARs)T细胞和基于 子(如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、I-4和I-5等) Notch的合成受体( Notch-based receptors, synNotch) 来调节肿瘤附近的微环境,解除其免疫抑制性,通过T细胞技术等.如 Prosser等即3将PD-1胞外结构 调动机体自身免疫力参与对肿瘤细胞的杀伤作用. 域串联CD28跨膜结构域与胞內信号转导区,得到嵌 CAR结构基因需要借助特殊的方法整合到T细合共刺激受体(CCR),将T细胞中PD-1/PDL1抑制 胞基因中以实现表达,如使用病毒载体、电穿孔、转性信号通路逆转为共刺激信号通路,进而加强CCR- 座子以及直接转入mRNA或蛋白202.成功表达T细胞的细胞毒性 Notch蛋白是一种参与多种有机 CAR的T细胞需要在体外扩增到足够的数量才能输体中细胞间通讯的蛋白质,对正常发育至关重要, 入体内产生治疗效果.体外扩增的方法通常用抗 Fedorov等基于 Notch蛋白研制出 synNotch受体 CD3和抗CD28抗体或是基因修饰过的表达靶抗原 synNotch受体一端伸出T细胞外,作为传感器组件 的抗原提呈细胞等激活T细胞扩增.最近又有研究特异性地识别多种不同类型的疾病信号;而另一端在 将一段编码10个氨基酸的肽段基因序列作为表位标细胞内,作为效应器组件,经设计后能够让细胞执行 签添加到CAR结合区,然后使用针对这个表位标签多种多样的反应.这些新技术可以更精确地调节T 的单抗特异性选择修饰CART细胞扩增与纯化2.细胞的激活,从而降低治疗风险 目前临床应用研究最为深入的代表性CART疗 CAR-T细胞疗法是当今最先进的肿瘤免疫细胞 法为靶向CDl9的CAR-T细胞免疫治疗,该疗法在治疗技术,在淋巴瘤中已经取得了显著的成果.它的 治疗儿童和成人复发B细胞急性淋巴细胞白血病岀现使得肿瘤免疫治疗进入一个新阶段,但是基于 (B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞非霍CAR的治疗方法在技术和大规模临床应用方面仍然 奇金淋巴瘤(B-NHL)方面表现出稳定高效的抗肿瘤存在着巨大的挑战.随着对人体免疫系统和肿瘤免 效果2.在各种临床研究中,虽然CAR的设计有所疫治疗的研究更加深入,相关临床数据不断积累.其 不同,但是从临床响应数据(表1)中可以看出,靶向中:凯特制药公司( Kite pharma)的CAR-T项目 CD19的CAR-T细胞治疗是复发雉治B细胞恶性肿 Lxicabtagene Ciloleucel(KTEC19)于2016年经欧洲 瘤的一种非常有效的治疗方法 药品管理局(EMA)人用医药产品委员会(CHMP)和 先进疗法委员会(CAT)准许,进入新成立的重点药物 表1靶向CD19的CART细胞治疔临床研究情况 Tab. 1 Clinical responses to CD19 CAR therapy PRIME)审批计划朱诺治疗公司( Juno Therapeutics Inc.)CART疗法JCAR015在2016年和2017年的 适应症 CAR 解率%文献临床试验中分别导致3位和2位患者死亡,被迫叫 急性淋巴白血病(成人) 急性淋巴白血病(儿童)4BB2590[27 停.2017年8月30日,美国FDA批准诺华 急性淋巴白血病(儿童)CD28216828 ( Novartis)旗下CAR-T疗法明星药物 Tisagenle 急性淋巴白血病(成人)41BB2993129 cleuch(曾用名CTL019)上市,商品名为 Kymric,用 急性淋巴白血病(儿童) 4-1BB2 0 于治疗复发滩治25岁以下B细胞急性淋巴性白血 非霍奇金淋巴瘤幔慢性 淋巴白血病 CD2815 53B31 病(B-ALL)患者.相信CART细胞治疗技术将日趋 大B细胞淋巴瘤 CD28203032 完善,并有望成为恶性肿瘤的克星,为医学发展及人 非霍奇金淋巴瘤 4-1BB32 类健康作出贡献

年 月 刁爱坡，等：肿瘤免疫细胞治疗研究进展 ·3· 了嵌合抗原受体基因外，整合表达免疫因子、整合共 刺激因子配体，如促炎性细胞因子白细胞介素– 12(IL-12)等，成功激活 CAR 的信号通路[19]. 这种被 改造后的 T 细胞可以在 CAR 识别靶抗原后，通过激 活下游转录因子 NFAT(nuclear factor activated T cells)来诱导表达 IL-12，从而招募环境中的其他免疫 细胞(树突状细胞、吞噬细胞和自然杀伤细胞等)，参 与对不表达靶抗原的肿瘤细胞的清除．同时，被募集 在肿瘤附近的免疫细胞还可以通过分泌某些细胞因 子(如干扰素–γ、肿瘤坏死因子–、IL-4 和 IL-5 等) 来调节肿瘤附近的微环境，解除其免疫抑制性，通过 调动机体自身免疫力参与对肿瘤细胞的杀伤作用． CAR 结构基因需要借助特殊的方法整合到 T 细 胞基因中以实现表达，如使用病毒载体、电穿孔、转 座子以及直接转入 mRNA 或蛋白[20–23]．成功表达 CAR 的 T 细胞需要在体外扩增到足够的数量才能输 入体内产生治疗效果．体外扩增的方法通常用抗 CD3 和抗 CD28 抗体或是基因修饰过的表达靶抗原 的抗原提呈细胞等激活 T 细胞扩增．最近又有研究 将一段编码 10 个氨基酸的肽段基因序列作为表位标 签添加到 CAR 结合区，然后使用针对这个表位标签 的单抗特异性选择修饰 CAR-T 细胞扩增与纯化[24]． 目前临床应用研究最为深入的代表性 CAR-T 疗 法为靶向 CD19 的 CAR-T 细胞免疫治疗，该疗法在 治疗儿童和成人复发 B 细胞急性淋巴细胞白血病 (B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和 B 细胞非霍 奇金淋巴瘤(B-NHL)方面表现出稳定高效的抗肿瘤 效果[25]．在各种临床研究中，虽然 CAR 的设计有所 不同，但是从临床响应数据(表 1)中可以看出，靶向 CD19 的 CAR-T 细胞治疗是复发/难治 B 细胞恶性肿 瘤的一种非常有效的治疗方法． 表 1 靶向 CD19的 CAR-T细胞治疗临床研究情况 Tab. 1 Clinical responses to CD19 CAR therapy 适应症 CAR 人数 完全缓 解率/%, 参考 文献 急性淋巴白血病(成人) CD28 16 88 [26] 急性淋巴白血病(儿童) 4-1BB 25 90 [27] 急性淋巴白血病(儿童) CD28 21 68 [28] 急性淋巴白血病(成人) 4-1BB 29 93 [29] 急性淋巴白血病(儿童) 4-1BB 2 100 [30] 非霍奇金淋巴瘤/慢性 淋巴白血病 CD28 15 53 [31] 大 B 细胞淋巴瘤 CD28 20 30 [32] 非霍奇金淋巴瘤 4-1BB 32 79 [33] 虽然 CAR-T 疗法的临床试验效果良好，但治疗 过程中也存在着潜在的毒副作用，如较为常见的发 热、皮疹、寒颤、低血压等，严重时可引起细胞因子释 放综合症、肿瘤溶解综合症等[25]．因 此 ，为提高 CAR-T 的有效性和安全性，一系列可控型 CAR-T 及 其他新型基因修饰 T 细胞技术应运而生，包括嵌合 共刺激受体 (chimeric co-stimulating receptors ， CCRs)T 细胞[34–35]、抗原特异性抑制受体(antigen￾specific inhibitory receptors，iCARs)T 细胞[36]和基于 Notch 的合成受体(Notch-based receptors，synNotch) T 细胞技术[37]等．如 Prosser 等[35]将 PD-1 胞外结构 域串联 CD28 跨膜结构域与胞内信号转导区，得到嵌 合共刺激受体(CCR)，将 T 细胞中 PD-1/PD-L1 抑制 性信号通路逆转为共刺激信号通路，进而加强 CCR￾T 细胞的细胞毒性．Notch 蛋白是一种参与多种有机 体中细胞间通讯的蛋白质，对正常发育至关重要， Fedorov 等[37]基于 Notch 蛋白研制出 synNotch 受体， synNotch 受体一端伸出 T 细胞外，作为传感器组件， 特异性地识别多种不同类型的疾病信号；而另一端在 细胞内，作为效应器组件，经设计后能够让细胞执行 多种多样的反应．这些新技术可以更精确地调节 T 细胞的激活，从而降低治疗风险． CAR-T 细胞疗法是当今最先进的肿瘤免疫细胞 治疗技术，在淋巴瘤中已经取得了显著的成果．它的 出现使得肿瘤免疫治疗进入一个新阶段，但是基于 CAR 的治疗方法在技术和大规模临床应用方面仍然 存在着巨大的挑战．随着对人体免疫系统和肿瘤免 疫治疗的研究更加深入，相关临床数据不断积累．其 中 ：凯 特 制 药 公 司(Kite Pharma)的 CAR-T 项 目 Axicabtagene Ciloleucel(KTE-C19)于 2016 年经欧洲 药品管理局(EMA)人用医药产品委员会(CHMP)和 先进疗法委员会(CAT)准许，进入新成立的重点药物 (PRIME)审批计划．朱诺治疗公司(Juno Therapeutics Inc.)CAR-T 疗法 JCAR015 在 2016 年和 2017 年的 临床试验中分别导致 3 位和 2 位患者死亡，被迫叫 停 ．2017 年 8 月 30 日 ，美 国 FDA 批准诺华 (Novartis)旗 下 CAR-T 疗法明星药物 Tisagenle￾cleucel(曾用名 CTL019)上市，商品名为 Kymriah，用 于治疗复发/难治 25 岁以下 B 细胞急性淋巴性白血 病(B-ALL)患者．相信 CAR-T 细胞治疗技术将日趋 完善，并有望成为恶性肿瘤的克星，为医学发展及人 类健康作出贡献．

天津科技大学学报第卷第期 体移植的器官与组织等.它无需抗原预先致敏,即可 2自然杀伤细胞疗法 直接杀伤靶细胞,故在机体抗肿瘤、早期抗病毒或胞 内细菌感染的免疫应答中有重要作用近几年,随 自然杀伤( natural killer,NK)细胞是独立于T、B着肿瘤分子机制的深入研究,NK细胞的抗肿瘤作用 细胞的第三类淋巴细胞亚群,属于固有免疫细胞,是备受关注,已形成多种不同的研究方法,包括同种异 机体防御的第一道防线,不仅具有抗感染、免疫调节体NK细胞过继免疫治疗、清除NK细胞的抑制因 和抗肿瘤等多重作用,而且在某些情况下参与超敏反素、基因修饰NK细胞表达嵌合抗原受体(CAR)等 应和自身免疫性疾病的发生 NK细胞的表型为CD3℃CD56+,主要分布于骨 NK细胞杀伤的靶细胞主要包括肿瘤细胞、病毒髓、外周血和脾脏当中,占外周血淋巴细胞的10% 感染细胞、较大的病原体如真菌和寄生虫)、同种异20%9.NK细胞杀伤肿瘤细胞的机制如图3所示 基于毒性颗粒的肿瘤杀伤 死亡受体介导的肿瘤杀伤 △△ NK细胞 NK细胞 瘤细胞 激活受体 活化配体 CDI6 抗体 细胞表面抗原 TRAL受体 TNF-a受体 ●毒性颗粒 TNF-a ①穿孔素和颗粒酶介导的细胞毒性作用;②死亡受体介导的靶细胞凋亡;③分泌细胞因子促进杀伤活性;④抗体依赖的细胞毒性作用 图3NK细胞对肿瘤的杀伤机制 Fig 3 Mechanism of NK cell cytotoxicity 由图3可知,NK细胞杀伤肿瘤细胞机制包括:CAR)技术应用于NK细胞,使NK细胞能够特异地 ①穿孔素和颗粒酶介导的细胞毒性作用;②死亡受体识别靶细胞,提高其杀伤靶细胞毒性作用,即CAR 介导的靶细胞凋亡;③分泌细胞因子促进杀伤活性;NK免疫疗法.相比于T细胞,NK细胞是一种安全 ④抗体依赖的细胞毒性作用( antibody-dependent cell-的效应细胞,它的使用能够避免CAR-T细胞治疗中 mediated cytotoxicity,ADC)向NK细胞的活性取带来的细胞因子风暴、肿瘤溶解综合症等副作用,并 决于其活化受体和抑制受体间的动态平衡,其且CAR修饰后的NK细胞与CART细胞一样,可以 中活化受体NKG2 D(natural killer group2 member高效地实现对靶细胞的特异杀伤但研究发现 D)、NKp30、NKp44和NKp46为NK细胞的活化提CAR-NK细胞的转导技术及其增殖能力均不及 供激活信号,最终引发细胞毒性和产生细胞因子;典CAR-T细胞.因此,开发新一代的CAR-NK细胞对 型的抑制性受体为KIR( killer inhibitory receptor,NK细胞的过继性治疗具有重要意义 KIR),KIR识别“自我”,随后传递负调控信号,最 终通过抑制信号通路来抑制NK细胞的活化此3巨噬细胞疗法 外,细胞因子对于NK细胞的发育、存活和功能行驶 也具有重要的调节作用,如L1-15在NK细胞发育和 巨噬细胞是机体固有免疫反应的重要组分,是一 信号激活中发挥关键作用46,-12、-15和 类具有可塑性、异质性的细胞群体,通过清除异常细 18促进NK细胞寿命延长,且二次刺激可增强NK胞保持正常组织的稳态,在机体的非特异免疫功能中 细胞功能 发挥重要作用32 在临床应用中,NK细胞过继性治疗肿瘤已取得 巨噬细胞可通过多途径、多步骤发挥广谱抗瘤作 定的成果,但同时也存在一些缺陷,如NK细胞的用.细菌细胞壁成分和细胞因子可以活化巨噬细胞, 靶向性、自体移植NK细胞失活问题等明为此,研活化的巨噬细胞可以高效、专一地识别并裂解肿瘤细 究者开始尝试将应用于T细胞的嵌合抗原受体胞,包括那些对细胞毒性药物有抗性的肿瘤细胞,但

·4· 天津科技大学学报 第 卷 第 期 2 自然杀伤细胞疗法 自然杀伤(natural killer，NK)细胞是独立于 T、B 细胞的第三类淋巴细胞亚群，属于固有免疫细胞，是 机体防御的第一道防线，不仅具有抗感染、免疫调节 和抗肿瘤等多重作用，而且在某些情况下参与超敏反 应和自身免疫性疾病的发生． NK 细胞杀伤的靶细胞主要包括肿瘤细胞、病毒 感染细胞、较大的病原体(如真菌和寄生虫)、同种异 体移植的器官与组织等．它无需抗原预先致敏，即可 直接杀伤靶细胞，故在机体抗肿瘤、早期抗病毒或胞 内细菌感染的免疫应答中有重要作用[38]．近几年，随 着肿瘤分子机制的深入研究，NK 细胞的抗肿瘤作用 备受关注，已形成多种不同的研究方法，包括同种异 体 NK 细胞过继免疫治疗、清除 NK 细胞的抑制因 素、基因修饰 NK 细胞表达嵌合抗原受体(CAR)等． NK 细胞的表型为 CD3- CD56+ ，主要分布于骨 髓、外周血和脾脏当中，占外周血淋巴细胞的 10%,～ 20%[39]．NK 细胞杀伤肿瘤细胞的机制如图 3 所示. 图 3 NK细胞对肿瘤的杀伤机制 Fig. 3 Mechanism of NK cell cytotoxicity 由图 3 可知，NK 细胞杀伤肿瘤细胞机制包括： ①穿孔素和颗粒酶介导的细胞毒性作用；②死亡受体 介导的靶细胞凋亡；③分泌细胞因子促进杀伤活性； ④抗体依赖的细胞毒性作用(antibody-dependent cell￾mediated cytotoxicity，ADCC)[40]．NK 细胞的活性取 决于其活化受体和抑制受体间的动态平衡[41–44]，其 中活化受体 NKG2D(natural killer group 2,member D)、NKp30、NKp44 和 NKp46 为 NK 细胞的活化提 供激活信号，最终引发细胞毒性和产生细胞因子；典 型的抑制性受体为 KIR(killer inhibitory receptor， KIR)，KIR 识别“自我”，随后传递负调控信号，最 终通过抑制信号通路来抑制 NK 细胞的活化[45]．此 外，细胞因子对于 NK 细胞的发育、存活和功能行驶 也具有重要的调节作用，如 IL-15 在 NK 细胞发育和 信号激活中发挥关键作用[46–47]，IL-12、IL-15 和 IL- 18 促进 NK 细胞寿命延长，且二次刺激可增强 NK 细胞功能[48]． 在临床应用中，NK 细胞过继性治疗肿瘤已取得 一定的成果，但同时也存在一些缺陷，如 NK 细胞的 靶向性、自体移植 NK 细胞失活问题等[49]．为此，研 究者开始尝试将应用于 T 细胞的嵌合抗原受体 (CAR)技术应用于 NK 细胞，使 NK 细胞能够特异地 识别靶细胞，提高其杀伤靶细胞毒性作用，即 CAR￾NK 免疫疗法．相比于 T 细胞，NK 细胞是一种安全 的效应细胞，它的使用能够避免 CAR-T 细胞治疗中 带来的细胞因子风暴、肿瘤溶解综合症等副作用，并 且 CAR 修饰后的 NK 细胞与 CAR-T 细胞一样，可以 高效地实现对靶细胞的特异杀伤[50]．但研究[51]发现， CAR-NK 细胞的转导技术及其增殖能力均不及 CAR-T 细胞．因此，开发新一代的 CAR-NK 细胞对 NK 细胞的过继性治疗具有重要意义． 3 巨噬细胞疗法 巨噬细胞是机体固有免疫反应的重要组分，是一 类具有可塑性、异质性的细胞群体，通过清除异常细 胞保持正常组织的稳态，在机体的非特异免疫功能中 发挥重要作用[52]． 巨噬细胞可通过多途径、多步骤发挥广谱抗瘤作 用．细菌细胞壁成分和细胞因子可以活化巨噬细胞， 活化的巨噬细胞可以高效、专一地识别并裂解肿瘤细 胞，包括那些对细胞毒性药物有抗性的肿瘤细胞，但

刁爱坡,等:肿瘤免疫细胞治疗研究进展 对正常细胞的损伤却很少.巨噬细胞和肿瘤细胞直长因此,目前研究者们正尝试通过使用CD47的 接接触1~3d后可分泌释放一些细胞毒性物质(如特异性抗体激活巨噬细胞昋噬肿瘤细胞,相关硏究已 INF-α、NO、丝氨酸蛋白酶、溶酶体酶、活性氧等),进入临床阶段. 可导致所结合的肿瘤细胞溶解或调亡,此过程缓慢并 且需要细胞之间直接接触例巨噬细胞也可以通过4其他肿瘤免疫细胞疗法 抗体依赖的细胞毒性作用( antibody- dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)直接杀伤肿瘤细胞.巨 除了以上3种最受关注的疗法外,肿瘤免疫细胞 噬细胞膜表面表达 leg fc受体(FcRI和FcRⅢ),治疗还涉及淋巴因子激活的杀伤细胞LAK)、肿瘤 抗肿瘤抗体Fab段与肿瘤表面抗原结合,Fc段与巨浸润淋巴细胞( tumor infiltrating lymphocyte,TL) 噬细胞上 lgg fc受体结合,在与Fc受体交联过程中树突状细胞 endritic cells,DC)、细胞因子诱导的杀 巨噬细胞被活化并分泌TNF-a、中性蛋白酶、活性氧伤细胞( cytokine-induced killer,CK)等.LAK细胞即 和Ⅱ-12等细胞溶解物质,将肿瘤细胞溶解并吞淋巴因子激活的杀伤细胞,是一类重要的细胞毒性淋 噬.活化的巨噬细胞可以处理和呈递肿瘤抗原、激巴细胞群,平时处于抑制状态,在诱导因子Ⅱ2刺激 活T细胞并刺激机体对肿瘤细胞产生特异性免疫应下激活增殖,对人体内的肿瘤细胞具有很强的杀伤作 答.与T细胞相比,巨噬细胞杀伤肿瘤细胞与肿瘤细用,具有广谱高效的杀瘤效应LAK细胞疗法开发 胞的免疫原性、转移潜能和对药物的敏感性无关因于20世纪80年代后期,经过多年的临床研究,目前 此,对于绝大多数肿瘤细胞,尤其是那些肿瘤抗原易仅作为肿瘤治疗的辅助疗法. 发生变异的转移肿瘤细胞,在体内特异性T细胞难 TIL细胞即肿瘤浸润淋巴细胞,是从肿瘤组织中 以发挥效应时,其对活化的巨噬细胞的杀伤作用却极分离出的CD4+、CD8*T细胞,在体外经ⅡL-2的刺 少出现抗性 激、活化、扩增后可应用于临床肿瘤过继性细胞治 在肿瘤发生初期,来自健康组织的巨噬细胞活化疗.临床上进行TIL过继性治疗之前,需要对患者进 后可以抑制肿瘤细胞的生长,但是在胂瘤恶化阶段,行全身放疗,使患者体内的淋巴细胞清除,同时联合 来自肿瘤微环境浸润的巨噬细胞,即肿瘤相关巨噬细化疗药治疗可提高疗效 胞( tumor associated macrophages,TAMs)却促进肿瘤 DC即树突状细胞,为体内专职抗原提呈细胞 细胞的生长.实体肿瘤不仅包括肿瘤细胞成分,肿瘤是抗微生物、肿瘤和自身抗原免疫应答时重要的启动 组织当中还有相当多的其他非肿瘤细胞成分,这些细子和调控子.在DC发育和发挥作用的过程中,未 胞成分构成了所谓肿瘤微环境,在肿瘤的浸润、增殖成熟DC具有较强的迁移能力,成熟DC能有效激活 和转移中发挥重要的作用肿瘤微环境中包含多样初始型T细胞,是启动、调控并维持免疫应答的中心 细胞成分,有组织本身固有的脂肪细胞、成纤维细环节.DC亚群在体内抗肿瘤免疫应答的动物模型中 胞,也有血源性细胞成分,包括巨噬细胞、中性粒细广泛研究,DC通常在体外被分离出来,并负载肿瘤 胞和肥大细胞等炎性细胞,这些血源性细胞在肿瘤的抗原,注射到同系动物中作为肿瘤疫苗6 进展、侵袭和转移中发挥重要作用65.TAMs是肿 CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞,是人体外 瘤微环境当中最丰富的细胞成分,在肿瘤微环境中发周血中单个核细胞在体外经多种细胞因子如Ⅱ2 挥多项功能,包括分泌金属基质蛋白酶消化细胞外基CD3单抗、干扰素-1、重组人纤维蛋白等共同刺激后 质促进肿瘤细胞浸润迁移、分泌多种生长因子及血管获得的一群异质细胞,具有识别、杀伤肿瘤的特性 生成因子促进肿瘤增殖、分泌抑制性细胞因子抑制机增殖能力强,细胞毒作用强,同时也具有一定的免疫 体肿瘤免疫等与肿瘤细胞不同的是,TAMs的基特性.将CK细胞与DC细胞在体外共同培养,在 因表达更稳定,所以采取针对巨噬细胞作为靶点治疗促进DC细胞成熟的同时,更加强了CIK细胞的抗 肿瘤具有很大的可行性.此外,随着研究的深入,研肿瘤活性,即 DC-CIK. DC-CIK既能凸显出特异性的 究者发现了TAMs促进肿瘤生长的调节机制,多种免疫杀伤,又能展现其强大的非特异性抗瘤效应,除 肿瘤细胞表面均表达一种膜糖蛋白CD47.当CD47了杀瘤活性高及杀瘤范围广的特点外,还具有降低免 与巨噬细胞的 SIRPa和TSPl受体分别结合后,巨疫耐受的特性,可以有效地预防某些自身免疫性疾 噬细胞便会停止吞噬肿瘤细胞,反而促进肿瘤的生病

年 月 刁爱坡，等：肿瘤免疫细胞治疗研究进展 ·5· 对正常细胞的损伤却很少．巨噬细胞和肿瘤细胞直 接接触 1～3,d 后可分泌释放一些细胞毒性物质(如 TNF-、NO、丝氨酸蛋白酶、溶酶体酶、活性氧等)， 可导致所结合的肿瘤细胞溶解或调亡，此过程缓慢并 且需要细胞之间直接接触[53]．巨噬细胞也可以通过 抗体依赖的细胞毒性作用(antibody-dependent cell￾mediated cytotoxicity，ADCC)直接杀伤肿瘤细胞．巨 噬细胞膜表面表达 IgG Fc 受体(FcγRⅠ和 FcγRⅢ)， 抗肿瘤抗体 Fab 段与肿瘤表面抗原结合，Fc 段与巨 噬细胞上 IgG Fc 受体结合，在与 Fc 受体交联过程中 巨噬细胞被活化并分泌 TNF-、中性蛋白酶、活性氧 和 IL-12 等细胞溶解物质，将肿瘤细胞溶解并吞 噬[54]．活化的巨噬细胞可以处理和呈递肿瘤抗原、激 活 T 细胞并刺激机体对肿瘤细胞产生特异性免疫应 答．与 T 细胞相比，巨噬细胞杀伤肿瘤细胞与肿瘤细 胞的免疫原性、转移潜能和对药物的敏感性无关．因 此，对于绝大多数肿瘤细胞，尤其是那些肿瘤抗原易 发生变异的转移肿瘤细胞，在体内特异性 T 细胞难 以发挥效应时，其对活化的巨噬细胞的杀伤作用却极 少出现抗性[55]． 在肿瘤发生初期，来自健康组织的巨噬细胞活化 后可以抑制肿瘤细胞的生长，但是在肿瘤恶化阶段， 来自肿瘤微环境浸润的巨噬细胞，即肿瘤相关巨噬细 胞(tumor associated macrophages，TAMs)却促进肿瘤 细胞的生长．实体肿瘤不仅包括肿瘤细胞成分，肿瘤 组织当中还有相当多的其他非肿瘤细胞成分，这些细 胞成分构成了所谓肿瘤微环境，在肿瘤的浸润、增殖 和转移中发挥重要的作用．肿瘤微环境中包含多样 细胞成分，有组织本身固有的脂肪细胞、成纤维细 胞，也有血源性细胞成分，包括巨噬细胞、中性粒细 胞和肥大细胞等炎性细胞，这些血源性细胞在肿瘤的 进展、侵袭和转移中发挥重要作用[56–57]．TAMs 是肿 瘤微环境当中最丰富的细胞成分，在肿瘤微环境中发 挥多项功能，包括分泌金属基质蛋白酶消化细胞外基 质促进肿瘤细胞浸润迁移、分泌多种生长因子及血管 生成因子促进肿瘤增殖、分泌抑制性细胞因子抑制机 体肿瘤免疫等[58]．与肿瘤细胞不同的是，TAMs 的基 因表达更稳定，所以采取针对巨噬细胞作为靶点治疗 肿瘤具有很大的可行性．此外，随着研究的深入，研 究者发现了 TAMs 促进肿瘤生长的调节机制，多种 肿瘤细胞表面均表达一种膜糖蛋白 CD47．当 CD47 与巨噬细胞的 SIRP 和 TSP1 受体分别结合后，巨 噬细胞便会停止吞噬肿瘤细胞，反而促进肿瘤的生 长[59]．因此，目前研究者们正尝试通过使用 CD47 的 特异性抗体激活巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，相关研究已 进入临床阶段． 4 其他肿瘤免疫细胞疗法 除了以上 3 种最受关注的疗法外，肿瘤免疫细胞 治疗还涉及淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤 浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、 树突状细胞(dendritic cells，DC)、细胞因子诱导的杀 伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)等．LAK 细胞即 淋巴因子激活的杀伤细胞，是一类重要的细胞毒性淋 巴细胞群，平时处于抑制状态，在诱导因子 IL-2 刺激 下激活增殖，对人体内的肿瘤细胞具有很强的杀伤作 用，具有广谱高效的杀瘤效应[60]．LAK 细胞疗法开发 于 20 世纪 80 年代后期，经过多年的临床研究，目前 仅作为肿瘤治疗的辅助疗法． TIL 细胞即肿瘤浸润淋巴细胞，是从肿瘤组织中 分离出的 CD4+ 、CD8+ ,T 细胞，在体外经 IL-2 的刺 激、活化、扩增后可应用于临床肿瘤过继性细胞治 疗．临床上进行 TIL 过继性治疗之前，需要对患者进 行全身放疗，使患者体内的淋巴细胞清除，同时联合 化疗药治疗可提高疗效[61]． DC 即树突状细胞，为体内专职抗原提呈细胞， 是抗微生物、肿瘤和自身抗原免疫应答时重要的启动 子和调控子[62]．在 DC 发育和发挥作用的过程中，未 成熟 DC 具有较强的迁移能力，成熟 DC 能有效激活 初始型 T 细胞，是启动、调控并维持免疫应答的中心 环节．DC 亚群在体内抗肿瘤免疫应答的动物模型中 广泛研究，DC 通常在体外被分离出来，并负载肿瘤 抗原，注射到同系动物中作为肿瘤疫苗[63]． CIK 细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，是人体外 周血中单个核细胞在体外经多种细胞因子如 IL-2、 CD3 单抗、干扰素–1、重组人纤维蛋白等共同刺激后 获得的一群异质细胞，具有识别、杀伤肿瘤的特性， 增殖能力强，细胞毒作用强，同时也具有一定的免疫 特性[64]．将 CIK 细胞与 DC 细胞在体外共同培养，在 促进 DC 细胞成熟的同时，更加强了 CIK 细胞的抗 肿瘤活性，即 DC-CIK．DC-CIK 既能凸显出特异性的 免疫杀伤，又能展现其强大的非特异性抗瘤效应，除 了杀瘤活性高及杀瘤范围广的特点外，还具有降低免 疫耐受的特性，可以有效地预防某些自身免疫性疾 病[65]．