第57卷第3期 土壤学报 Vol. 57. No. 3 2020年5月 ACTA PEDOLOGICA SINICA May,2020 DOI10.11766/trxb201912060662 谢祖彬,张燕辉,王慧,稻田生物固氮研究进展及方向[土壤学报,2020,57(3):540-546 XIE Zubin. ZHANG Yanhui, WANG Hui. Advances and Perspectives in Paddy Biological Nitrogen Fixation []. Acta Pedologica Sinica 2020,57(3):540-546. 稻田生物固氮研究进展及方向 谢祖彬,张燕辉12,王慧 1,2 (1.土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所),南京210008;2.中国科学院大学,北京100049) 摘要:稻田淹水产生的合适pH和氧化还原条件为固氮微生物的固氮提供了适宜环境条件,使得稻田在多年不施氮肥条 件下仍能维持一定产量,而旱地产量则逐年下降。随着化学氮肥用量的增加,导致了严重的环境污染,迫切需要增加生物固 氮来保证粮食生产和减少环境污染。为发挥稻田生物固氮功能,我们对稻田生物固氮的研究方法、固氮量、固氮微生物、影 响因素、调控及其研究方向进行综述,以期为稻田生物固氮研究提供参考。 关键词:稻田;生物固氮;固氮微生物;稳定性同位素探针;二次离子质谱 中图分类号:Q143;S154.3文献标志码:A Advances and Perspectives in Paddy biological Nitrogen Fixation XIE Zubin't ZHANG Yanhui, 2 WANG Hui,2 (1. State Key laboratory of soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of sciences, Nanjing 210008, China 2. University of Chinese Academy of sciences, Beijing 100049, China Abstract: Suitable pH and oxy-reduction conditions in paddy induced by flooding supply optimal conditions for diazotrophs to do n2 fixation. Paddy biological N2 fixation makes paddy be different from upland. Paddy can sustain certain productivity under no N fertilization, while upland productivity decreases year by year. Along with an increase of chemical active N application, environment becomes severely polluted. To secure food production and decrease environmental pollution, biological N2 fixation is urgently to be increased to reduce chemical N fertilizer application. In order to better explore capacities of paddy biological N fixation, we make the reviews on progresses of quantification techniques, controlling factors, enhancement techniques and perspectives in paddy N2 fixation. We hope this review can offer some helps for further studies on paddy N2 fixation Key words: Paddy; Biological N2 fixation, Diazotrophs, Stable isotope probing; NanoSIMS 稻田生态系统具有保持土壤肥力、提供粮食保达145亿hm2,是世界约1/2人口的主要粮食;我 障和生态调节等多种功能。目前全球水稻种植面积国水稻土面积约3000万hm2,约占全国耕地面积的 国家科技基础性工作专项(2015FY110700)和国家自然科学基金项目(31870500,41501273,40871146)共同资助 Supported by the Special Project on the Basis of National Science and Technology of China( No. 2015FY 110700 )and the National Natural Science Foundation f china(Nos.31870500,41501273,40871146) ↑通讯作者 Corresponding author,Emal: zexie@issas ac,cn 作者简介:谢祖彬(1964—),男,江苏南通人,博士,研究员,主要从事土壤微生物生态学研究。E-mail: zbxieaissas.ac.cn 收稿日期:2019-12-06;收到修改稿日期:2020-02-21;优先数字出版日期(www.cnkinet):2020-03-11 http://pedologica.issas.ac.cn
第 57 卷 第 3 期 土 壤 学 报 Vol. 57，No. 3 2020 年 5 月 ACTA PEDOLOGICA SINICA May，2020 * 国家科技基础性工作专项（2015FY110700）和国家自然科学基金项目（31870500，41501273，40871146）共同资助 Supported by the Special Project on the Basis of National Science and Technology of China（No. 2015FY110700）and the National Natural Science Foundation of China（Nos. 31870500，41501273，40871146） † 通讯作者 Corresponding author，E-mail：zbxie@issas.ac.cn 作者简介：谢祖彬（1964—），男，江苏南通人，博士，研究员，主要从事土壤微生物生态学研究。E-mail：zbxie@issas.ac.cn 收稿日期： 2019–12–06；收到修改稿日期：2020–02–21；优先数字出版日期（www.cnki.net）：2020–03–11 http://pedologica.issas.ac.cn DOI：10.11766/trxb201912060662 谢祖彬，张燕辉，王慧. 稻田生物固氮研究进展及方向[J]. 土壤学报，2020，57（3）：540–546. XIE Zubin，ZHANG Yanhui，WANG Hui. Advances and Perspectives in Paddy Biological Nitrogen Fixation [J]. Acta Pedologica Sinica， 2020，57（3）：540–546. 稻田生物固氮研究进展及方向* 谢祖彬1† ，张燕辉1，2 ，王 慧1，2 （1. 土壤与农业可持续发展国家重点实验室（中国科学院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中国科学院大学，北京 100049） 摘 要：稻田淹水产生的合适 pH 和氧化-还原条件为固氮微生物的固氮提供了适宜环境条件，使得稻田在多年不施氮肥条 件下仍能维持一定产量，而旱地产量则逐年下降。随着化学氮肥用量的增加，导致了严重的环境污染，迫切需要增加生物固 氮来保证粮食生产和减少环境污染。为发挥稻田生物固氮功能，我们对稻田生物固氮的研究方法、固氮量、固氮微生物、影 响因素、调控及其研究方向进行综述，以期为稻田生物固氮研究提供参考。 关键词：稻田；生物固氮；固氮微生物；稳定性同位素探针；二次离子质谱 中图分类号：Q143；S154.3 文献标志码：A Advances and Perspectives in Paddy Biological Nitrogen Fixation XIE Zubin1†, ZHANG Yanhui1, 2, WANG Hui1, 2 (1. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China) Abstract: Suitable pH and oxy-reduction conditions in paddy induced by flooding supply optimal conditions for diazotrophs to do N2 fixation. Paddy biological N2 fixation makes paddy be different from upland. Paddy can sustain certain productivity under no N fertilization, while upland productivity decreases year by year. Along with an increase of chemical active N application, environment becomes severely polluted. To secure food production and decrease environmental pollution, biological N2 fixation is urgently to be increased to reduce chemical N fertilizer application. In order to better explore capacities of paddy biological N2 fixation, we make the reviews on progresses of quantification techniques, controlling factors, enhancement techniques and perspectives in paddy N2 fixation. We hope this review can offer some helps for further studies on paddy N2 fixation. Key words: Paddy; Biological N2 fixation; Diazotrophs; Stable isotope probing; NanoSIMS 稻田生态系统具有保持土壤肥力、提供粮食保 障和生态调节等多种功能。目前全球水稻种植面积 达 1.45 亿 hm2 ，是世界约 1/2 人口的主要粮食；我 国水稻土面积约 3 000 万 hm2 ，约占全国耕地面积的
3期 谢祖彬等:稻田生物固氮研究进展及方向 541 1/4,是我国60%人口的主要粮食。在不施氮肥条件能进行光合作用的生物生活在一起,利用光合生物提 下,种植水稻提供的蛋白质是种植玉米的1.5倍2,供的碳水化合物为能源,并利用其驱动固氮酶将大气 其主要原因是稻田生态系统能进行生物固氮而不断中的氮气转化为氨,并反过来为光合生物提高氮素的 为水稻生长提供氮素。稻田还具有蓄水防洪、涵过程,典型的有豆科植物-根瘤菌共生、满江红-鱼腥 养地下水源、气温调节、水质净化、生物多样性维蓝细菌共生。联合固氮是固氮微生物与植物生活在 持和景观文化价值等功能。 起,不形成根瘤,以植物提供的碳水化合物为能源, 没有氮素就没有生命。氮是生物生长发育的关并反过来为植物提高氮索和(或)激素类物质而进行 键生命元素,又是陆地生态系统最不能满足生物生的固氮过程,如甘蔗-固氮螺菌( Azospirillum)联合固 长需要的元素。在合成氨技术发明以前,生物固定氮。自生固氮是自由生长的固氮微生物独立进行的固 的氮是陆地生态系统氮的主要来源。生物固氮是固氮过程,如蓝细菌( Cyanobacteria)、褐球固氮菌 氮微生物在固氮酶催化下将空气中的氮气转化成( Azotobacter chroococcum)和梭菌( Clostridium 氨的过程。自1913年 Haber-bosch合成氨技术发 prazmowsa 明以来,人工合成氨不断增加,到2010年达到1.2 在本文中,我们将生物固氮主要分为豆科生物 亿吨N,但陆地生态系统每年固氮量估计约为16固氮和非豆科生物固氮,详见图1 亿~4亿吨,其中自然生态系统固氮1亿~29亿吨6 农田每年固氮6000万吨~1亿吨(豆类作物每年固 生物固氮 氮2150万吨,草地、稻田等其他农田固氮约3870 豆科生物固氮 非豆科生物固氮 万~7100万吨)。可见,无论过去、现在或将来 (共生固氮) 物固定的氮均为陆地生态系统的重要氮源。 自养固氮 异养固氮 考古资料表明大约7000年前亚洲开始种植水 稻,3100年前中国开始种植大豆。大约2100年前 光能自养 化能自养 自生联合 我国劳动人民就初步总结了生物固氮的基本现象, 固氮固氮 古农籍《汜胜之书》记载了“瓜与小豆间作”为宜 自生自生 的耕作方式,反映了古代劳动人民对生物固氮的朴 图1生物固氮类型 素认识;1838年 Boussingault发现豆科作物能将活 g 1 Types of biological N2 fixation 性氮(相对于惰性N2而言)富集在土壤中,并认 为豆科作物能生产活性氮,但仍然不知道为什么水2稻田生物固氮定量方法优缺点 稻和大豆能增加氮素供给。直至1888年, Herman Hellriegel和 Hermann wilfarth才发现土壤中微生物 生物固氮的定量方法分为直接定量法和间接定 参与了生物固氮过程,而且与豆科作物存在共生关 量法。直接定量法为1N2气体饲喂法。间接定量法 系。稻田的淹水环境为光合固氮菌和异养固氮菌 有总氮差异法、1N自然丰度法、1N同位素稀释法 的生物固氮提供了合适的pH、氧化还原状况等条和乙炔还原法。 件。本文拟对稻田生物固氮研究方法、固氮量、 N2气体饲喂法是测定生物固氮的最直接方 固氮微生物、影响因素、调控及其研究方向进行综法。该方法向固氮系统中充入N标记的氮气,通 述,以期为稻田生物固氮研究提供帮助。 过测定系统中氮总量和1N丰度,来计算固氮量。 该方法直接、准确、技术要求高、试验成本大。卑 稻田生物固氮类型 其成、谢祖彬等发明了田间原位智能气密植物生长 控制技术(授权专利号ZL2009102321843),并成 生物固氮一般分为共生固氮( symbiotic功用于生物固氮研究。该系统能自动控制系统内 biological n2 fixation)、联合固氮( plant- associated温度和CO2浓度,并且有很好密封性(图2) biological N2 fixation)和自生固氮(ree- living 总氮差异法是计算一个系统试验前后总氮的差 biological N2 fixation)。共生固氮是固氮微生物与异来定量该系统在一定时间内生物固定的氮量。该 http://pedologica.issas.ac.cn
3 期 谢祖彬等：稻田生物固氮研究进展及方向 541 http://pedologica.issas.ac.cn 1/4，是我国 60%人口的主要粮食。在不施氮肥条件 下，种植水稻提供的蛋白质是种植玉米的 1.5 倍[1-2]， 其主要原因是稻田生态系统能进行生物固氮而不断 为水稻生长提供氮素[3]。稻田还具有蓄水防洪、涵 养地下水源、气温调节、水质净化、生物多样性维 持和景观文化价值等功能[4]。 没有氮素就没有生命。氮是生物生长发育的关 键生命元素，又是陆地生态系统最不能满足生物生 长需要的元素。在合成氨技术发明以前，生物固定 的氮是陆地生态系统氮的主要来源。生物固氮是固 氮微生物在固氮酶催化下将空气中的氮气转化成 氨的过程。自 1913 年 Haber-Bosch 合成氨技术发 明以来，人工合成氨不断增加，到 2010 年达到 1.2 亿吨 N [5]，但陆地生态系统每年固氮量估计约为 1.6 亿～4亿吨，其中自然生态系统固氮1亿～2.9亿吨[6]， 农田每年固氮 6 000 万吨～1 亿吨（豆类作物每年固 氮 2 150 万吨，草地、稻田等其他农田固氮约 3 870 万～7 100 万吨）[7]。可见，无论过去、现在或将来 生物固定的氮均为陆地生态系统的重要氮源。 考古资料表明大约 7 000 年前亚洲开始种植水 稻，3 100 年前中国开始种植大豆。大约 2 100 年前， 我国劳动人民就初步总结了生物固氮的基本现象， 古农籍《汜胜之书》记载了“瓜与小豆间作”为宜 的耕作方式，反映了古代劳动人民对生物固氮的朴 素认识；1838 年 Boussingault 发现豆科作物能将活 性氮（相对于惰性 N2 而言）富集在土壤中，并认 为豆科作物能生产活性氮，但仍然不知道为什么水 稻和大豆能增加氮素供给。直至 1888 年，Herman Hellriegel 和 Hermann Wilfarth 才发现土壤中微生物 参与了生物固氮过程，而且与豆科作物存在共生关 系[3]。稻田的淹水环境为光合固氮菌和异养固氮菌 的生物固氮提供了合适的 pH、氧化还原状况等条 件[8]。本文拟对稻田生物固氮研究方法、固氮量、 固氮微生物、影响因素、调控及其研究方向进行综 述，以期为稻田生物固氮研究提供帮助。 1 稻田生物固氮类型 生物固氮一般分为共生固氮（ symbiotic biological N2 fixation）、联合固氮（plant-associated biological N2 fixation）和自生固氮（free-living biological N2 fixation）[7]。共生固氮是固氮微生物与 能进行光合作用的生物生活在一起，利用光合生物提 供的碳水化合物为能源，并利用其驱动固氮酶将大气 中的氮气转化为氨，并反过来为光合生物提高氮素的 过程，典型的有豆科植物-根瘤菌共生、满江红-鱼腥 蓝细菌共生。联合固氮是固氮微生物与植物生活在一 起，不形成根瘤，以植物提供的碳水化合物为能源， 并反过来为植物提高氮素和（或）激素类物质而进行 的固氮过程，如甘蔗-固氮螺菌（Azospirillum）联合固 氮。自生固氮是自由生长的固氮微生物独立进行的固 氮过程，如蓝细菌（Cyanobacteria）、褐球固氮菌 （Azotobacter chroococcum）和梭菌（Clostridium prazmowski）。 在本文中，我们将生物固氮主要分为豆科生物 固氮和非豆科生物固氮，详见图 1。 图 1 生物固氮类型 Fig. 1 Types of biological N2 fixation 2 稻田生物固氮定量方法优缺点 生物固氮的定量方法分为直接定量法和间接定 量法。直接定量法为 15N2 气体饲喂法。间接定量法 有总氮差异法、15N 自然丰度法、15N 同位素稀释法 和乙炔还原法。 15N2 气体饲喂法是测定生物固氮的最直接方 法。该方法向固氮系统中充入 15N 标记的氮气，通 过测定系统中氮总量和 15N 丰度，来计算固氮量。 该方法直接、准确、技术要求高、试验成本大。卑 其成、谢祖彬等发明了田间原位智能气密植物生长 控制技术（授权专利号 ZL200910232184.3），并成 功用于生物固氮研究[9]。该系统能自动控制系统内 温度和 CO2 浓度，并且有很好密封性（图 2）。 总氮差异法是计算一个系统试验前后总氮的差 异来定量该系统在一定时间内生物固定的氮量。该
542 土壤学报 57卷 图2田间原位气密植物生长控制系统 Fig. 2 In-situ field air-proof plant growth system 方法原理简单,只要测出试验期间输入、输出该系来计算生物固定的氮量。该方法一般不考虑其他输 统的各氮分量,多出的部分就是生物固氮的氮量。人和其他输出。该方法需要参照植物与固氮植物有 可实施起来非常困难。输入有土壤氮、干湿沉降、相似的根系分布、生长特性、吸氮能力和吸氮喜好。 通过灌溉水输入量、通过地下水输入量;输出有氨而且由于该方法需要有不固氮的参照系,在不能找 挥发、硝化-反硝化、径流、淋溶、土壤氮和植物带到不固氮参照系时无法使用。 走的氮。要准确测出这些输入、输出氮分量非常困 乙炔还原法是通过测定乙炔还原酶活性的变化 难。短时间内利用该法定量生物固氮量几乎不能实来表征稻田生物固氮能力的变化,主要用于生物固氮 现。如果通过长时间试验,忽视干湿沉降,通过灌的定性和半定量研究。固氮酶能将N还原成NH3 溉水输入量、地下水输入量、氨挥发、硝化-反硝化、也能将乙炔还原成乙烯。该方法一般是将样品采回来 径流和淋溶的氮,可以粗略地估算出生物固定的氮。放在实验室条件下,往样品中注λ乙炔,混匀。通过 1N同位素自然丰度法:土壤氮素自然转化过程测定两个时间点培养瓶中乙烯浓度的变化来计算乙 中N优先离开土壤系统而使得N在土壤中富集,炔还原量。然后通过乙炔还原量与固氮量的理论转化 造成土壤中的1N丰度高于生物利用大气氮固定氮系数来换算成生物固氮量。乙炔还原量与固氮量间的 的丰度10。也就是土壤中的N丰度与生物固定氮理论转换系数为3:1,即3mol乙炔还原量=1mol 的N丰度不一样。这个方法比较适用于没有人为固氮量。但固氮菌中的固氮酶在还原乙炔过程中受环 扰动的自然生态系统中,如不施肥草地和林地。如境条件影响,有很大的不确定性。Sp和Odul2 果自然生态土壤系统中的1N丰度高于大气,那么发现在砖红壤(1 atosols止上只有0.56,而Rce和Paul3 就可以用来定量研究生物固氮。但在农田生态系统发现在滞水条件下达15。 Nohrstedt发现水分含量 中,由于大量施用与大气1N丰度相似的氮肥,而对转化系数影响巨大:当土壤水分饱和时达157,而 使得农田土壤N与大气1N丰度相似,使得该方当土壤水分低于饱和水分的75%时只有26。 Hardy 法难以用于农田生态系统。 等给出了43作为平均转化系数。目前用乙炔还原 1N同位素稀释法:1N稳定性同位素稀释法是法研究生物固氮量时通常采用3作为转化系数。相对 研究共生固氮主要方法。该方法利用1N同位素标于1N2气体标记法,乙炔还原法简单、便宜和灵敏 记肥料对一个固氮植物和非固氮植物(参照植物)虽然乙炔还原量和固氮量间的转化系数存在不确定 进行标记,通过测定植物、土壤1N丰度和含量,性,但仍是研究生物固氮的常用方法 http://pedologica.issas.ac.cn
542 土 壤 学 报 57 卷 http://pedologica.issas.ac.cn 图 2 田间原位气密植物生长控制系统 Fig. 2 In-situ field air-proof plant growth system 方法原理简单，只要测出试验期间输入、输出该系 统的各氮分量，多出的部分就是生物固氮的氮量。 可实施起来非常困难。输入有土壤氮、干湿沉降、 通过灌溉水输入量、通过地下水输入量；输出有氨 挥发、硝化-反硝化、径流、淋溶、土壤氮和植物带 走的氮。要准确测出这些输入、输出氮分量非常困 难。短时间内利用该法定量生物固氮量几乎不能实 现。如果通过长时间试验，忽视干湿沉降，通过灌 溉水输入量、地下水输入量、氨挥发、硝化-反硝化、 径流和淋溶的氮，可以粗略地估算出生物固定的氮。 15N 同位素自然丰度法：土壤氮素自然转化过程 中 14N 优先离开土壤系统而使得 15N 在土壤中富集， 造成土壤中的 15N 丰度高于生物利用大气氮固定氮 的丰度[10]。也就是土壤中的 15N 丰度与生物固定氮 的 15N 丰度不一样。这个方法比较适用于没有人为 扰动的自然生态系统中，如不施肥草地和林地。如 果自然生态土壤系统中的 15N 丰度高于大气，那么 就可以用来定量研究生物固氮。但在农田生态系统 中，由于大量施用与大气 15N 丰度相似的氮肥，而 使得农田土壤 15N 与大气 15N 丰度相似，使得该方 法难以用于农田生态系统。 15N 同位素稀释法：15N 稳定性同位素稀释法是 研究共生固氮主要方法。该方法利用 15N 同位素标 记肥料对一个固氮植物和非固氮植物（参照植物） 进行标记，通过测定植物、土壤 15N 丰度和含量， 来计算生物固定的氮量。该方法一般不考虑其他输 入和其他输出。该方法需要参照植物与固氮植物有 相似的根系分布、生长特性、吸氮能力和吸氮喜好。 而且由于该方法需要有不固氮的参照系，在不能找 到不固氮参照系时无法使用。 乙炔还原法是通过测定乙炔还原酶活性的变化 来表征稻田生物固氮能力的变化，主要用于生物固氮 的定性和半定量研究。固氮酶能将 N2 还原成 NH3， 也能将乙炔还原成乙烯。该方法一般是将样品采回来 放在实验室条件下，往样品中注入乙炔，混匀。通过 测定两个时间点培养瓶中乙烯浓度的变化来计算乙 炔还原量。然后通过乙炔还原量与固氮量的理论转化 系数来换算成生物固氮量。乙炔还原量与固氮量间的 理论转换系数为 3︰1，即 3 mol 乙炔还原量=1 mol 固氮量。但固氮菌中的固氮酶在还原乙炔过程中受环 境条件影响，有很大的不确定性[11]。Spiff 和 Odu[12] 发现在砖红壤（latosols）上只有0.56，而Rice和Paul[13] 发现在滞水条件下达 15。Nohrstedt[14]发现水分含量 对转化系数影响巨大：当土壤水分饱和时达 15.7，而 当土壤水分低于饱和水分的 75%时只有 2.6。Hardy 等[15]给出了 4.3 作为平均转化系数。目前用乙炔还原 法研究生物固氮量时通常采用 3 作为转化系数。相对 于 15N2 气体标记法，乙炔还原法简单、便宜和灵敏。 虽然乙炔还原量和固氮量间的转化系数存在不确定 性，但仍是研究生物固氮的常用方法
3期 谢祖彬等:稻田生物固氮研究进展及方向 543 3稻田生物固氮量影响因素 蒙古、河北、辽宁、山东、陕西、宁夏、广东、 新疆、福建、贵州、四川和黑龙江等13个省市自治 研究表明稻田的淹水环境为光合固氮菌和异养区6个旱地土壤和3个稻田土壤样品中的固氮微生 固氮菌的生物固氮提供了合适的pH和氧化还原状物资源,得到非共生固氮微生物资源181份,其 况等条件。土壤水分状况、水稻品种、施肥和碳有36%属于类芽孢杆菌属,29%属于芽孢杆菌属 源均影响稻田的生物固氮161。土壤有机质高的土11%属于节杆菌属。 Islam Rashedul等2采用无氮培 壤有利于稻田固氮菌生长,有机物的施用促进土壤养分离技术对韩国7种不同施肥管理措施下的稻田 物固氮61。稻草秋季还田的土壤乙炔还原酶活固氮微生物进行了分离,分离到165份细菌,其中 性仅为春季还田的30%;光照条件下纤维素还田土32份具有固氮基因,分别为布克氏菌、鞘氨醇单胞 壤的固氮效率是黑暗条件下的3倍。大量NH抑菌、甲基杆菌、假单胞菌、新鞘氨醇杆菌、杆菌 制固氮酶( nitrogenase)活性,而少量施氮对固氮 类芽孢杆菌、肠杆菌、克雷白氏杆菌、分枝杆菌、 酶活性没有影响920; Charyulu等1报道少量氮肥玫瑰单胞菌、环丝菌、寡养单胞菌、叶杆菌、格里 促进土壤固氮,而大量施用抑制固氮;而且与施肥蒙菌。 da Costa等在巴西3种不同施肥管理土壤上 方式和氮肥种类有关P。wang等2研究了东北黑分离到190份疑似固氮微生物,除了 Islam Rsshedul 土、江苏下位砂姜土、江西红壤和四川紫色士发育等在韩国土壤中发现的布克氏菌、鞘氨醇单胞菌 水稻土的土壤属性与生物固氮量的关系。他们利用假单胞菌、杆菌、类芽孢杆菌、肠杆菌、克雷白氏 Spearman相关技术分析表明生物固氮量与土壤pH, 杆菌、寡养单胞菌等固氮菌外,还有噬氢菌、固氮 交换性Na、Mg,总Ca、总Mg成正相关,与交换 根瘤菌、苍白杄菌、产碱杆菌、根瘤菌、不动杆菌 性A1、活性和无定形A氧化物成负相关。他们进葡萄球菌、泛菌、埃希氏菌、柠檬酸细菌、无色杆 步分析表明土壤pH又与交换性Na、Mg,总Ca 菌、土壤杆菌7。 总Mg成显著正相关,与交换性A、活性和无定 跃固氮微生物指的是发挥固氮作用的固氮微 形A氧化物成显著负相关。但生物固氮量与固氮菌生物。稻田中均有固氮微生物,但稻田中的固氮做 数量(nj/H基因拷贝数)没有关系。进一步在固氮 生物种类和固氮能力各不相同,它们受水稻土类型 菌OTU水平(操作分类单元水平)分析表明生物固性质和管理措施影响。目前有一些关于稻田固氮微 氮量与念珠藻量成显著正相关。他们用随机森林模生物数量和种类的报道,但很少有关于活跃固氮微 生物研究的报道。这与研究活跃固氮微生物难度较 型中的均方差增加百分法评估了土壤各属性对生物 固氮影响的相对重要性,结果表明A氧化物最重 大有关,虽然稳定性同位素核酸探针( DNA Or RNA 要,其他依次为活性Fe、活性A1、总Mg、交换性 stable isotope probing)技术为研究活跃固氮微生物 提供了途径。由于DNA或RNA中C的含量是N的 Mg、CN、有效Cu、土壤有机质、黏粒含量和阳离 两倍多,1C-SP技术从2000年建立28以来已取得 子交换量。 一些进展293,但1N-DNA(RNA)-SP技术进展 缓慢。Ma等用99atom%1N2研究了Mo施用对 4稻田固氮微生物及活跃固氮微生物 稻田土壤活跃固氮微生物的影响,发现非异形蓝细 菌(non- heterocystous cyanobateria)细鞘丝藻属 我国从20世纪70年代末开始从水稻根系分离( leptolyngbya)和微鞘藻属( Microcoleus)是主要 固氮微生物。丘元盛等时分离到2种固氮菌为粪产的活跃固氮微生物。 Buckley等国用98aom%N 碱菌和阴沟肠杆菌。谭志远等从广东和海南普通室内培养土壤的方法研究长期休闲土壤的固氮微生 野生稻中分离到37株内生固氮菌,采用固氮酶m物,但遗憾的是结果中没有提供证据证明1N-DNA 基因PCR扩增测序检测技术,鉴定可能属于克雷伯在密度梯度离心的那一层,也没有提供DNAN丰 氏菌属、泛菌属、克雷伯氏肺炎杆菌、阿氏肠杆菌、度来证明哪些微生物确实发生了固氮作用。大量发 阴沟肠杆菌、丙二酸柠檬酸杆菌、成团泛菌。孙建表的CDNA(RNA)-SIP文章也没有提供DNA 光等采用16SDNA序列分析技术,分析了北京、(RNA)1C丰度292。原因是用稳定性同位素比值 http://pedologica.issas.ac.cn
3 期 谢祖彬等：稻田生物固氮研究进展及方向 543 http://pedologica.issas.ac.cn 3 稻田生物固氮量影响因素 研究表明稻田的淹水环境为光合固氮菌和异养 固氮菌的生物固氮提供了合适的 pH 和氧化还原状 况等条件[8]。土壤水分状况、水稻品种、施肥和碳 源均影响稻田的生物固氮[8,16-18]。土壤有机质高的土 壤有利于稻田固氮菌生长，有机物的施用促进土壤 生物固氮[16-18]。稻草秋季还田的土壤乙炔还原酶活 性仅为春季还田的 30%；光照条件下纤维素还田土 壤的固氮效率是黑暗条件下的 3 倍[8]。大量 + NH4 抑 制固氮酶（nitrogenase）活性，而少量施氮对固氮 酶活性没有影响[19-20]；Charyulu 等[18]报道少量氮肥 促进土壤固氮，而大量施用抑制固氮；而且与施肥 方式和氮肥种类有关[21]。Wang 等[22]研究了东北黑 土、江苏下位砂姜土、江西红壤和四川紫色土发育 水稻土的土壤属性与生物固氮量的关系。他们利用 Spearman 相关技术分析表明生物固氮量与土壤 pH， 交换性 Na、Mg，总 Ca、总 Mg 成正相关，与交换 性 Al3+、活性和无定形 Al 氧化物成负相关。他们进 一步分析表明土壤 pH 又与交换性 Na、Mg，总 Ca、 总 Mg 成显著正相关，与交换性 Al3+、活性和无定 形 Al 氧化物成显著负相关。但生物固氮量与固氮菌 数量（nifH 基因拷贝数）没有关系。进一步在固氮 菌 OTU 水平（操作分类单元水平）分析表明生物固 氮量与念珠藻量成显著正相关。他们用随机森林模 型中的均方差增加百分法评估了土壤各属性对生物 固氮影响的相对重要性，结果表明 Al 氧化物最重 要，其他依次为活性 Fe、活性 Al、总 Mg、交换性 Mg、C/N、有效 Cu、土壤有机质、黏粒含量和阳离 子交换量。 4 稻田固氮微生物及活跃固氮微生物 我国从 20 世纪 70 年代末开始从水稻根系分离 固氮微生物。丘元盛等[23]分离到 2 种固氮菌为粪产 碱菌和阴沟肠杆菌。谭志远等[24]从广东和海南普通 野生稻中分离到 37 株内生固氮菌，采用固氮酶 nifH 基因 PCR 扩增测序检测技术，鉴定可能属于克雷伯 氏菌属、泛菌属、克雷伯氏肺炎杆菌、阿氏肠杆菌、 阴沟肠杆菌、丙二酸柠檬酸杆菌、成团泛菌。孙建 光等[25]采用 16S rDNA 序列分析技术，分析了北京、 内蒙古、河北、辽宁、山东、陕西、宁夏、广东、 新疆、福建、贵州、四川和黑龙江等 13 个省市自治 区 67 个旱地土壤和 3 个稻田土壤样品中的固氮微生 物资源，得到非共生固氮微生物资源 181 份，其中 有 36%属于类芽孢杆菌属，29%属于芽孢杆菌属， 11%属于节杆菌属。Islam Rashedul 等[26]采用无氮培 养分离技术对韩国 7 种不同施肥管理措施下的稻田 固氮微生物进行了分离，分离到 165 份细菌，其中 32 份具有固氮基因，分别为布克氏菌、鞘氨醇单胞 菌、甲基杆菌、假单胞菌、新鞘氨醇杆菌、杆菌、 类芽孢杆菌、肠杆菌、克雷白氏杆菌、分枝杆菌、 玫瑰单胞菌、环丝菌、寡养单胞菌、叶杆菌、格里 蒙菌。da Costa 等在巴西 3 种不同施肥管理土壤上 分离到 190 份疑似固氮微生物，除了 Islam Rsshedul 等[26]在韩国土壤中发现的布克氏菌、鞘氨醇单胞菌、 假单胞菌、杆菌、类芽孢杆菌、肠杆菌、克雷白氏 杆菌、寡养单胞菌等固氮菌外，还有噬氢菌、固氮 根瘤菌、苍白杆菌、产碱杆菌、根瘤菌、不动杆菌、 葡萄球菌、泛菌、埃希氏菌、柠檬酸细菌、无色杆 菌、土壤杆菌[27]。 活跃固氮微生物指的是发挥固氮作用的固氮微 生物。稻田中均有固氮微生物，但稻田中的固氮微 生物种类和固氮能力各不相同，它们受水稻土类型、 性质和管理措施影响。目前有一些关于稻田固氮微 生物数量和种类的报道，但很少有关于活跃固氮微 生物研究的报道。这与研究活跃固氮微生物难度较 大有关，虽然稳定性同位素核酸探针（DNA or RNA stable isotope probing）技术为研究活跃固氮微生物 提供了途径。由于 DNA 或 RNA 中 C 的含量是 N 的 两倍多，13C-SIP 技术从 2000 年建立[28]以来已取得 一些进展[29-32]，但 15N-DNA（RNA）-SIP 技术进展 缓慢。Ma 等[33]用 99 atom% 15N2 研究了 Mo 施用对 稻田土壤活跃固氮微生物的影响，发现非异形蓝细 菌（non-heterocystous cyanobateria）细鞘丝藻属 （leptolyngbya）和微鞘藻属（Microcoleus）是主要 的活跃固氮微生物。Buckley 等[34]用 99.8 atom% 15N2 室内培养土壤的方法研究长期休闲土壤的固氮微生 物，但遗憾的是结果中没有提供证据证明 15N-DNA 在密度梯度离心的那一层，也没有提供 DNA15N 丰 度来证明哪些微生物确实发生了固氮作用。大量发 表的 13C-DNA（RNA）-SIP 文章也没有提供 DNA （RNA）13C 丰度[29-32]。原因是用稳定性同位素比值
544 土壤学报 57卷 质谱仪和液相色谱-质谱联用仪测定1C丰度需要因数据库中的基因数据来源于纯菌的分离和全基因 0.8~1.0g的核酸,而一般土壤提取的DNA(RNA)测序。因此在测序大量采用的时候,纯菌的分离 只有10~200ng,无法满足测定需要。而DNA培养和全基因测序需要进一步加强。 (RNA冲N较C要少,这就需要更多的DNA(RNA (2)关于稻田生物固氮量和固氮微生物,目前只 纳米二次离子质谱( Nanoscale secondary ion mass对少数几种水稻土开展了研究。我国稻田类型众多, spectrometry- NanosIms)实现了成像与单细胞稳定成土母质和环境条件各异,需要进一步加强研究。 性同位素测定的有机结合38 Woebken等围9用 (3)研究发现秸秆还田、接种固氮微生物菌剂 NanosIms技术和N2标记技术,测定了N2标记和在低有效钼土壤上施钼可以大幅度提高稻田生物 和非标记单细胞蓝细菌体内N丰度,证明了美国固氮量,但均还处在研究初期阶段,还需要继续研 Monterey海湾 Elkhorn Slough河口微生物簇群中的究,尤其要加强田间实际应用效果研究。 蓝细菌具有固氮能力。这些工作说明 NanoSIMs技 (4)稻田固氮微生物不仅具有固氮功能,为植 术可以满足DNA密度梯度离心后各层中极微量物提供氮素,还能分泌激素等促生物质促进植物生 DNAN的测定,但能在多大程度上解决稻田活跃长,但目前高效固氮微生物菌剂的开发力度不大, 固氮微生物问题还缺乏研究。 需要加强,同时需要加强固氮微生物与植物的互作 研究。 5稻田生物固氮调控 (5)固氮微生物存在氮抑制,即在有氮条件下, 固氮微生物不固氮或减少固氮。如何通过基因工程 增加稻田生物固氮量可以减少化学氮肥使的办法解除氮抑制是需要加强研究的课题。 用、减少环境污染、降低能源消耗和提高农民收参考文献( References) 人,是长期想实现而又没有取得大的进展。有研 究表明施用有机物能促进稻田生物固氮68。Ma[1]LisK, Wang CT. Analysis on change of production and 等13发现在低有效钼土壤上(下位砂姜土)施用 factors promoting yield increase of corn in China ] Journal of Maize Sciences,2008(4):32-36.[李少昆 钼酸钠(1kghm2)74天能使稻田生物固氮量由 王崇桃.我国玉米产量变化及增产因素分析[玉米科 223kghm2提高至531kghm2。Ma等的研究还 学,2008(4):32-36. 表明种植杂交水稻较常规粳稻能提高生物固氮。[2]YuGP. ZhuH y. Studies on production situation and andreozzi等接种 Herbaspirillum huttiense rCA24 development countermeasures of rice in China P ]. Modern Agricultural Science and Technology, 20096): 123-127 Enterobacter asburiae RCA23 Fl Staphylococcus sp 131.[虞国平,朱鸿英.我国水稻生产现状及发展对策研 377发现 Herbaspirillum huttiense RCA24的表现最 究[现代农业科技,2009(6):123-127,131 好,能提高生物固氮、增加叶绿素含量、提高氮含[3] Galloway JN. Dentener F, Capone D G.eta. Nitrogen 量和水稻幼苗干重。但稻田生物固氮的研究还很不 cycles: Past, present, and future []. Biogeochemistry 够,非常缺乏大田应用研究。 2004,70(2):153-226. 4] Natuhara Y. Ecosystem services substitutes of natural wetlands in 6稻田生物固氮未来研究方向 Engineering, 2013, 56: 97-106 [ 5] Fowler D, Coyle M, Skiba U, et al. The global nitrogen 稻田生物固氮的现象早被发现,但由于研究的 Ity-first century P] Transactions of the Royal Society B, 2013. 368(1621) 难度非常大,进展一直不大。为实现粮食产量和生 20130164 态协调发展,有必要加大稻田生物固氮研究 [6] Cleveland CC. Townsend A R Schimel DS, et al.Global (1)DNA基因测序是日前研究稻田固氮微生物 patterns of terrestrial biological nitrogen( N2 )fixation in 的常用方法,可以提供较多的信息,但DNA测序基 natural ecosystems []. Global Biogeochemical Cycles 999,13(2):623-645 因序列在与现有微生物数据库比对时,往往出现很 [ 7] Herridge D F. Peoples M B. Boddey R M,et al.Global 多无法匹配的情况。主要原因是目前固氮微生物基 inputs of biological nitrogen fixation in agricultural 因数据库中固氮微生物种类较少。而固氮微生物基 systems U]. Plant and Soil. 2008. 311: 1-18 http://pedologica.issas.ac.cn
544 土 壤 学 报 57 卷 http://pedologica.issas.ac.cn 质谱仪和液相色谱-质谱联用仪测定 13C 丰度需要 0.8～1.0 µg 的核酸，而一般土壤提取的 DNA（RNA） 只有 10～200 ng，无法满足测定需要[35-36]。而 DNA （RNA）中 N较 C要少，这就需要更多的 DNA（RNA）。 纳米二次离子质谱（Nanoscale secondary ion mass spectrometry-NanoSIMS）实现了成像与单细胞稳定 性同位素测定的有机结合[37-38]。Woebken 等[39]用 NanoSIMS 技术和 15N2 标记技术，测定了 15N2 标记 和非标记单细胞蓝细菌体内 15N 丰度，证明了美国 Monterey 海湾 Elkhorn Slough 河口微生物簇群中的 蓝细菌具有固氮能力。这些工作说明 NanoSIMS 技 术可以满足 DNA 密度梯度离心后各层中极微量 DNA 15N 的测定，但能在多大程度上解决稻田活跃 固氮微生物问题还缺乏研究。 5 稻田生物固氮调控 增加稻田生物固氮量可以减少化学氮肥使 用、减少环境污染、降低能源消耗和提高农民收 入，是长期想实现而又没有取得大的进展。有研 究表明施用有机物能促进稻田生物固氮[16-18]。Ma 等[33]发现在低有效钼土壤上（下位砂姜土）施用 钼酸钠（1 kg hm–2）74 天能使稻田生物固氮量由 22.3 kg hm–2 提高至 53.1 kg hm–2。Ma 等[40]的研究还 表明种植杂交水稻较常规粳稻能提高生物固氮。 Andreozzi 等[41]接种 Herbaspirillum huttiense RCA24， Enterobacter asburiae RCA23 和 Staphylococcus sp. 377 发现 Herbaspirillum huttiense RCA24 的表现最 好，能提高生物固氮、增加叶绿素含量、提高氮含 量和水稻幼苗干重。但稻田生物固氮的研究还很不 够，非常缺乏大田应用研究。 6 稻田生物固氮未来研究方向 稻田生物固氮的现象早被发现，但由于研究的 难度非常大，进展一直不大。为实现粮食产量和生 态协调发展，有必要加大稻田生物固氮研究。 （1）DNA 基因测序是目前研究稻田固氮微生物 的常用方法，可以提供较多的信息，但 DNA 测序基 因序列在与现有微生物数据库比对时，往往出现很 多无法匹配的情况。主要原因是目前固氮微生物基 因数据库中固氮微生物种类较少。而固氮微生物基 因数据库中的基因数据来源于纯菌的分离和全基因 测序。因此在测序大量采用的时候，纯菌的分离、 培养和全基因测序需要进一步加强。 （2）关于稻田生物固氮量和固氮微生物，目前只 对少数几种水稻土开展了研究。我国稻田类型众多， 成土母质和环境条件各异，需要进一步加强研究。 （3）研究发现秸秆还田、接种固氮微生物菌剂 和在低有效钼土壤上施钼可以大幅度提高稻田生物 固氮量，但均还处在研究初期阶段，还需要继续研 究，尤其要加强田间实际应用效果研究。 （4）稻田固氮微生物不仅具有固氮功能，为植 物提供氮素，还能分泌激素等促生物质促进植物生 长，但目前高效固氮微生物菌剂的开发力度不大， 需要加强，同时需要加强固氮微生物与植物的互作 研究。 （5）固氮微生物存在氮抑制，即在有氮条件下， 固氮微生物不固氮或减少固氮。如何通过基因工程 的办法解除氮抑制是需要加强研究的课题。 参考文献（References） ［ 1 ］ Li S K，Wang C T. Analysis on change of production and factors promoting yield increase of corn in China [J]. Journal of Maize Sciences，2008（4）：32—36. [李少昆， 王崇桃. 我国玉米产量变化及增产因素分析[J]. 玉米科 学，2008（4）：32—36.] ［ 2 ］ Yu G P，Zhu H Y. Studies on production situation and development countermeasures of rice in China [J]. Modern Agricultural Science and Technology，2009（6）：123—127， 131. [虞国平，朱鸿英. 我国水稻生产现状及发展对策研 究[J]. 现代农业科技，2009（6）：123—127，131.] ［ 3 ］ Galloway J N，Dentener F，Capone D G，et al. Nitrogen cycles：Past，present，and future [J]. Biogeochemistry， 2004，70（2）：153—226. ［ 4 ］ Natuhara Y. Ecosystem services by paddy fields as substitutes of natural wetlands in Japan [J]. Ecological Engineering，2013，56：97—106. ［ 5 ］ Fowler D，Coyle M，Skiba U，et al. The global nitrogen cycle in the twenty-first century [J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B，2013，368（1621）： 20130164. ［ 6 ］ Cleveland C C，Townsend A R，Schimel D S，et al. Global patterns of terrestrial biological nitrogen（N2）fixation in natural ecosystems [J]. Global Biogeochemical Cycles， 1999，13（2）：623—645. ［ 7 ］ Herridge D F，Peoples M B，Boddey R M，et al. Global inputs of biological nitrogen fixation in agricultural systems [J]. Plant and Soil，2008，311：1—18