环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology, March2011,33(1):99-106 ISSN16749858 doi:10.3969/isn.1674-0858.201.01.019 DNA条形码的应用进展及讨论 武宇鹏·23,丁亮2,李捷3,武春生2,范仁俊,朱朝东 (1.山西大学黄土高原研究所,太原030006:2.中国科学院动物研究所动物进化与系统学院重点实验室,北京100101; 3.山西省植保植检总站,太原0300014.山西省农业科学院植物保护研究所,太原030031) 摘要:DNA条形码( dNA Barcoding)是近几年来国际生物学研究的热点之一。但是在国内,相关概念还存在不 同程度的模糊,不利于研究工作的进一步开展。本文在对DNA条形码与DNA分类( DNA Taxonomy)两个不同 概念进行辨析的基础上,回顾与总结了DNA条形码的产生背景与应用进展,并对DNA条形码目前所面临的基 因交流、取样、计算方法等问题进行了总结和分析,最后对DNA条形码研究前景进行了展望 关键词:DNA条形码;DNA分类 中图分类号:Q969 文献标识码:A 文章编号:1674-0858(2011)01-0099-08 DNA barcoding: current progresses and discussions WU Yu-Peng,, DING Liang, LI Jie, WU Chun-Sheng, FAN Ren-Jun, ZHU Chao-Dong Institute of Loess Plateau, Shanxi University, Taiyuan 030001, China; 2. Key Laboratory of Zoological Systematics and Evolution, Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101,China 3. Shanxi Plant Protection and Plant Quarantine Station, Taiyuan 030001, China; 4. Institute of Plant Protection, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China) Abstract: DNA Barcoding has been among hot topics in biology in recent years. However, there has been some ambiguity on some relevant concepts, which is not helpful for further studies. In this review we tried to compare DNA Barcoding and DNA Taxonomy, summarizing methodologies on gene flow, sam- pling and calculation methods during the procedure. Finally, we looked into the future of DNA Barcod Key words: DNA Barcodir DNA Taxonomy 由于经典分类学方法具有局限性,很难同时、有 1DNA条形码产生的背景 效地对某一个地区、某一个项目或某一次大型考 察所得到的全部生物样本进行鉴定与记录。以现 分类学是生物学的基础,是人类认识自然的在人类社会生产力发展的需求来看,亟需一种更 第一步。自林奈创立双名法近250年来,已经有加具有效率的生物物种鉴定体系,更好地为生产 170多万个物种被命名。目前全球生物估计的物种生活服务;况且现有物种正以每年1~2万种的速 数量至少有1亿种( Erwin,1982;May,1990;度在灭绝,也亟需一种更加具有效率的生物物种 Stock,1993)。如此巨大的数量,单靠专业的经典鉴定与记录体系,为人类进一步深入全面地认识 分类学家,几乎是不可能完成的任务。以平均 自然界和评估自身存在留备更加系统的物种本底 个经典分类学家一生鉴定1000个物种的标准来计资料。 算,需要1万多个经典分类学家同时参与完成。 近20年来,快速发展的分子生物学技术为众 基金项目:农业部公益性行业(农业)科研专项(20803006);国家自然科学基金项目(30870268,J0930004) 作者简介:武宇鹏,男,1978年生,博士研究生 向为生态学,E-il: wuyupeng007@163. *通讯作者 Authors for correspondence,E-nail: zhuche@ 10z ac 收稿日期 Received:201046-0:接受日期 Accepted:20104943 C1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.ne
环 境 昆 虫 学 报 Journal of Environmental Entomology，March 2011，33 ( 1) : 99 － 106 ISSN 1674-0858 doi: 10. 3969 /j. issn. 1674 － 0858. 2011. 01. 019 DNA 条形码的应用进展及讨论 武宇鹏1，2，3 ，丁 亮2 ，李 捷4，5 ，武春生2 ，范仁俊4 ，朱朝东2* ( 1. 山西大学黄土高原研究所，太原 030006; 2. 中国科学院动物研究所动物进化与系统学院重点实验室，北京 100101; 3. 山西省植保植检总站，太原 030001; 4. 山西省农业科学院植物保护研究所，太原 030031) 摘要: DNA 条形码 ( DNA Barcoding) 是近几年来国际生物学研究的热点之一。但是在国内，相关概念还存在不 同程度的模糊，不利于研究工作的进一步开展。本文在对 DNA 条形码与 DNA 分类 ( DNA Taxonomy) 两个不同 概念进行辨析的基础上，回顾与总结了 DNA 条形码的产生背景与应用进展，并对 DNA 条形码目前所面临的基 因交流、取样、计算方法等问题进行了总结和分析，最后对 DNA 条形码研究前景进行了展望。 关键词: DNA 条形码; DNA 分类 中图分类号: Q969 文献标识码: A 文章编号: 1674 － 0858 ( 2011) 01 － 0099 － 08 DNA barcoding: current progresses and discussions WU Yu-Peng 1，2，3 ，DING Liang 2 ，LI Jie 4 ，WU Chun-Sheng 2* ，FAN Ren-Jun4 ，ZHU Chao-Dong 2* ( 1. Institute of Loess Plateau，Shanxi University，Taiyuan 030001，China; 2. Key Laboratory of Zoological Systematics and Evolution，Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China; 3. Shanxi Plant Protection and Plant Quarantine Station，Taiyuan 030001，China; 4. Institute of Plant Protection，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China) Abstract: DNA Barcoding has been among hot topics in biology in recent years. However，there has been some ambiguity on some relevant concepts，which is not helpful for further studies. In this review， we tried to compare DNA Barcoding and DNA Taxonomy，summarizing methodologies on gene flow，sampling and calculation methods during the procedure. Finally，we looked into the future of DNA Barcoding. Key words: DNA Barcoding; DNA Taxonomy 基金项目: 农业部公益性行业 ( 农业) 科研专项 ( 200803006) ; 国家自然科学基金项目 ( 30870268，J0930004) 作者简介: 武宇鹏，男，1978 年生，博士研究生，研究方向为生态学，E-mail: wuyupeng007@ 163. com * 通讯作者 Authors for correspondence，E-mail: zhucd@ ioz. ac. cn 收稿日期 Received: 2010-06-20 ; 接受日期 Accepted: 2010-09-13 1 DNA 条形码产生的背景 分类学是生物学的基础，是人类认识自然的 第一步。自林奈创立双名法近 250 年来，已经有 170 多万个物种被命名。目前全球生物估计的物种 数量 至 少 有 1 亿 种 ( Erwin，1982; May，1990; Stock，1993) 。如此巨大的数量，单靠专业的经典 分类学家，几乎是不可能完成的任务。以平均一 个经典分类学家一生鉴定 1000 个物种的标准来计 算，需要 1 万多个经典分类学家同时参与完成。 由于经典分类学方法具有局限性，很难同时、有 效地对某一个地区、某一个项目或某一次大型考 察所得到的全部生物样本进行鉴定与记录。以现 在人类社会生产力发展的需求来看，亟需一种更 加具有效率的生物物种鉴定体系，更好地为生产 生活服务; 况且现有物种正以每年 1 ～ 2 万种的速 度在灭绝，也亟需一种更加具有效率的生物物种 鉴定与记录体系，为人类进一步深入全面地认识 自然界和评估自身存在留备更加系统的物种本底 资料。 近 20 年来，快速发展的分子生物学技术为众
环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology 33卷 多传统学科提供了新的发展机遇,分类学亦不例BirdsbarcodingInitiative(w.barcodingbirds..com) 外。利用DNA进行物种鉴定已经成功应用到了多全球鱼类计划: Fish Barcode of life Initiative 个生物类群中( Hebert et al.,2004a; Ward et al.,(ww. fishbol, org)、鳞翅目昆虫计划: All Leps 2005; Barber et al.,2006; Chantangsi et al.,2007; Barcode of Life(ww. lepbarcoding,. org)、极地生物计 Smithetal.,2008)。国际互联网DNA数据平台的划:Polarbarcodeoflife(ww.polarbarcoding.com) 构建,使得大量物种基因信息第一时间公示,例等DNA条形码项目正在实施中(关申民等 如美国国家生物技术信息中心NCBI( National2008)。2007年5月,加拿大圭尔夫大学正式筹建 Center of Biotechology Information)的 Genbank数据生命条形码数据库系统( Barcode of Life Data Sys- 车中生物基因数据爆炸式增加。但在分类学中,tems,BOLD)。该数据库不仅包括序列信息,也包 尚缺乏一个专门将DNA序列与分类学相结合的括完整的物种描述、地理分布信息、标本图片等。 有关DNA条形码的学术论文也逐年增加。截 在此趋势之下, Tautz等(2002)首先提出至目前,在 Sciencedirect(htp:/ww. sclence DNA分类的概念(DNATaxonomy),以DNA序列re.com)中输入“dnAbarcode”检索可得到 为基础建立物种识别体系,利用DNA序列的差异155篇文献。DNA条形码研究已成为不可逆转的 进行种级阶元的分类,并与林奈命名系统一一对趋势 应。利用此体系可以鉴定物种,也可以解决一些 形态学上的难题,发掘隐存种。Tau等(2003)2DNA条形码的研究进展 指出,虽然DNA测序技术是昂贵的,但培养一个 分类学专家所花成本更大,而且需要长时间的投 DNA条形码自提出以来,已在多个类群的研 入,DNA分类是未来分类学发展的必然趋势。 究中得到了应用。包括真菌( Seifert et al. 随后, Herbert等(2003a)提出DNA条形码2007),植物( Kress et al.,2007),纤毛虫 概念( DNA Barcoding)。针对形态学分类固有的缺 Chantangsi et al!.,2007),珊瑚( Barber et al. 陷,如表型可塑性和遗传可变性,无法鉴定隐存20060,腹足类( Remigio and hebert,2003),蜘蛛 分类单元和不同发育阶段的物种等, Herbert倡导 Greenstone et al.,2005),甲壳动物( Costa et 利用线粒体COⅠ基因(线粒体细胞色素氧化酶亚a.,2007),昆虫( Hebert et a.,2004a; Hajib- 基I基因)作为通用序列,建立全球性的物种鉴别 abaei et al.,2006b; Burns et al.,2008; Kumar et 系统。与其它基因片段相比,COⅠ基因有许多优al.,2007; Smith et al.,2008),鱼类( Ward et 点,相对保守又有足够的变异,并且序列长度适al.,2005),两栖类( Vences et a.,2005),鸟类 中( Hebert et a.,2003b)。DNA条形码系统的建 Hebert et a.,2004b)及灵长类( Lorenz et al 筑流程为预先收录已知种名物种的COI基因建立2005)等。国内也有学者开展了一些研究,如高 个庞大的条形码数据库,将未知种名物种的玉石等(2007)、屠云洁等(2009)分别对6个地 COⅠ基因输入数据库进行检索,根据序列相似度方和3个地方鸡的线粒体COⅠ基因多样性进行了 来快速鉴定物种,解决实际问题并不断丰富数据研究,结果表明COⅠ基因对鸡品种的鉴定结果与 库。这个过程类似于超市利用给商品添加条形码,形态鉴定基本相符。冯毅等(2009)利用DNA条 分类管理成千上万种不同的商品,故称之为DNA形码信息研制DNA芯片,成功鉴定了3种西花蓟 条形码。 马。彭居俐等(2009)的研究表明以COI基因作 2003年,全球多位生物学专家在美国冷泉港为鲐属鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有一定的 召开了两次会议,深入讨论了DNA条形码的科学可行性。王中铎等(2009)探讨了COⅠ条码序列 性和社会功能,提出了国际DNA条形码计划 在硬骨鱼类辅助物种鉴别的适用性。 BOL( International Barcode of Life)。2004年,生 传统形态学分类对于一些类群的鉴定非常耗 命条形码联盟”(CBOL, the Consortium for the bar-时,缺乏可用的鉴定性状( Huang et al.,2007 code of life)成立,至今已经有来自50个国家的 Evans et al..,2007)。相比之下,DNA条形码提供 170多个组织成为其会员(htp:∥h 了一个快速、简便的鉴定系统( Herbert et al. ngsi.edu)。目前,针对全球鸟类的计划: 2003a)。在一些生物多样性调查研究中,DNA条 C1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology 33 卷 多传统学科提供了新的发展机遇，分类学亦不例 外。利用 DNA 进行物种鉴定已经成功应用到了多 个生物类群中 ( Hebert et al. ，2004a; Ward et al. ， 2005; Barber et al. ，2006; Chantangsi et al. ，2007; Smith et al. ，2008) 。国际互联网 DNA 数据平台的 构建，使得大量物种基因信息第一时间公示，例 如美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心 NCBI ( National Center of Biotechology Information) 的 GenBank 数据 库中生物基因数据爆炸式增加。但在分类学中， 尚缺乏一个专门将 DNA 序列与分类学相结合的 标准。 在此趋势之下，Tautz 等 ( 2002 ) 首先提出 DNA 分类的概念 ( DNA Taxonomy) ，以 DNA 序列 为基础建立物种识别体系，利用 DNA 序列的差异 进行种级阶元的分类，并与林奈命名系统一一对 应。利用此体系可以鉴定物种，也可以解决一些 形态学上的难题，发掘隐存种。Tautz 等 ( 2003) 指出，虽然 DNA 测序技术是昂贵的，但培养一个 分类学专家所花成本更大，而且需要长时间的投 入，DNA 分类是未来分类学发展的必然趋势。 随后，Herbert 等 ( 2003a) 提出 DNA 条形码 概念 ( DNA Barcoding) 。针对形态学分类固有的缺 陷，如表型可塑性和遗传可变性，无法鉴定隐存 分类单元和不同发育阶段的物种等，Herbert 倡导 利用线粒体 COⅠ基因 ( 线粒体细胞色素氧化酶亚 基 I 基因) 作为通用序列，建立全球性的物种鉴别 系统。与其它基因片段相比，COⅠ基因有许多优 点，相对保守又有足够的变异，并且序列长度适 中 ( Hebert et al. ，2003b) 。DNA 条形码系统的建 筑流程为预先收录已知种名物种的 COⅠ基因建立 一个庞大的条形码数据库，将未知种名物种的 COⅠ基因输入数据库进行检索，根据序列相似度 来快速鉴定物种，解决实际问题并不断丰富数据 库。这个过程类似于超市利用给商品添加条形码， 分类管理成千上万种不同的商品，故称之为 DNA 条形码。 2003 年，全球多位生物学专家在美国冷泉港 召开了两次会议，深入讨论了 DNA 条形码的科学 性和社会功能，提出了国际 DNA 条形码计划——— iBOL ( International Barcode of Life) 。2004 年，“生 命条形码联盟”( CBOL，the Consortium for the Barcode of Life) 成立，至今已经有来自 50 个国家的 170 多 个 组 织 成 为 其 会 员 ( http: ∥ barcoding. si. edu /) 。目前，针对全球鸟类的计划: All Birds Barcoding Initialtive ( www. barcodingbirds. com) 、 全 球 鱼 类 计 划: Fish Barcode of Life Initiative ( www. fishbol. org) 、鳞 翅 目 昆 虫 计 划: All Leps Barcode of Life ( www. lepbarcoding. org) 、极地生物计 划: Polar Barcode of Life ( www. polarbarcoding. com) 等 DNA 条 形 码 项 目 正 在 实 施 中 ( 关 申 民 等， 2008) 。2007 年 5 月，加拿大圭尔夫大学正式筹建 生命条形码数据库系统 ( Barcode of Life Data Systems，BOLD) 。该数据库不仅包括序列信息，也包 括完整的物种描述、地理分布信息、标本图片等。 有关 DNA 条形码的学术论文也逐年增加。截 至目前，在 Sciencedirect ( http: / /www. science-direct. com) 中 输 入 “DNA barcode” 检 索 可 得 到 1155 篇文献。DNA 条形码研究已成为不可逆转的 趋势。 2 DNA 条形码的研究进展 DNA 条形码自提出以来，已在多个类群的研 究中 得 到 了 应 用。 包 括 真 菌 ( Seifert et al. ， 2007) ， 植 物 ( Kress et al. ， 2007 ) ， 纤 毛 虫 ( Chantangsi et al. ，2007 ) ，珊瑚 ( Barber et al. ， 2006) ，腹足类 ( Remigio and Hebert，2003) ，蜘蛛 ( Greenstone et al. ，2005 ) ，甲 壳 动 物 ( Costa et al. ，2007 ) ，昆虫 ( Hebert et al. ，2004a; Hajibabaei et al. ，2006b; Burns et al. ，2008; Kumar et al. ，2007; Smith et al. ，2008 ) ，鱼类 ( Ward et al. ，2005) ，两栖类 ( Vences et al. ，2005) ，鸟类 ( Hebert et al. ，2004b) 及灵长类 ( Lorenz et al. ， 2005) 等。国内也有学者开展了一些研究，如高 玉石等 ( 2007) 、屠云洁等 ( 2009) 分别对 6 个地 方和 3 个地方鸡的线粒体 COⅠ基因多样性进行了 研究，结果表明 COⅠ基因对鸡品种的鉴定结果与 形态鉴定基本相符。冯毅等 ( 2009) 利用 DNA 条 形码信息研制 DNA 芯片，成功鉴定了 3 种西花蓟 马。彭居俐等 ( 2009) 的研究表明以 COⅠ基因作 为鲌属鱼类 DNA 条形码进行物种鉴定具有一定的 可行性。王中铎等 ( 2009) 探讨了 COⅠ条码序列 在硬骨鱼类辅助物种鉴别的适用性。 传统形态学分类对于一些类群的鉴定非常耗 时，缺乏可用的鉴定性状 ( Huang et al. ，2007; Evans et al. ，2007) 。相比之下，DNA 条形码提供 了一个快速、简便的鉴定系统 ( Herbert et al. ， 2003a) 。在一些生物多样性调查研究中，DNA 条 100
武宇鹏:DNA条形码的应用进展及讨论 l01 形码鉴定物种的准确率达到了97%( Janzen et al,之,DNA分类和DNA条形码研究仍然在飞速向前 2005)或97.9%( Hajibabaei et al.,2006b)。在推进。 鳞翅目等类群中,通过DNA条形码发现了大量隐 存种或新种( Herbert et a.,204a; Monaghan et3与DNA条形码有关的讨论 al.,2005): paglia等(2008)通过DNA条形码 在天蛾科 Sphingidae)中发现的隐存种与形态学鉴3.1DNA条形码与DNA分类的关系 定结果相一致; Silva- Brandao等(2009)认为鳞 DNA条形码与DNA分类几乎同时提出,彼此 翅目中出现如此多隐存种,跟动物相互之间通过虽然相互联系,但又有所不同( Vogler et a 模仿或拟态而造成的物种形成或分化有关,借助2006: Hajibabaei et a.,2007; DeSalle,2005 DNA条形码是很好的研究途径; Janzen等(2009) Desalle et al.,2007) 通过DNA条形码研究哥斯达黎加瓜纳卡斯特省 目的不同:DNA条形码基于DNA序列之间的 (ACG)的昆虫标本,发现该地区鳞翅目19个科相似度进行物种鉴定,注重实效,而不是构建生 中,有17个科的种类有所增加。 命树( the tree of life)或进行系统发育研究 另外,DNA条形码能够从不同发育时期的动( Hajibabaei et al.,2007)。DNA条形码只作为物种 植物标本或分散的组织中鉴别出物种,例如对幼鉴定的工具,并不单独作为物种分类的平台。相 鱼的鉴定( Pegg et al.,2006); Domingo- Roura等比之下,DNA分类则是要建立一个单独依靠DNA (2006)通过对一种名贵的修面刷所用材料进行序列的分类系统( Blaxter et al.,2005:; Cognate et DNA条形码分析,获知该产品是由欧亚獾 Meles al.,2006; Vogler et a.,2007)。虽然DNA分类结 meles的毛所制成; Teletchea等(2008)将DNA条果也需要与林奈命名系统相对应,但根据 Tautz 形码用在对超市食品的检验上。DNA条形码也可(2003)的构想,DNA分类不依赖形态特征,能有 用在对包含多种生物组合的环境样本如动物的粪效排除人为因素,基于DNA序列的分类更为客观, 便、水、土壤等的鉴定中,例如根据粪便中提取更接近物种的自然属性。DNA分类在为物种鉴定 的线粒体DNA多态性,可以将在同一区域活动的提供平台的同时,还需要进一步探讨物种的系统 阿穆尔豹 Panthera pardus orientalis和西伯利亚虎发育、高阶元分类地位等深层次的内容。 Panthera tigris altaica区分开来( Sugimoto et a 所用基因不完全相同:DNA条形码在提出之 初,就强调用统一的基因序列进行鉴定,虽然研 但有不少学者反对仅仅依靠DNA序列进行物究者倡导在解决一些特殊类群,或处理一些特殊 种分类( Will and Rubinoff,2004; Moritz and cice-情况如假基因、基因交流等时,需要再加一条候 ro,2004; Will et al.,2005)。他们提出抛弃传统补基因( alternate loci/ candidate loci)( Hajibabaei 分类方法,会造成分类学的倒退,分类学有可能cta.,2007)。但目前动物类群中使用较多的仍是 又回归到依据单一性状进行分类的类型学( tyrol-COI基因。甚至在一些特殊领域(如法医)中, gy)时代;他们认为仅用DNA序列作为分类依据,标本的DNA已经降解,无法提取完整长度的COI 会丧失很多有用信息,特别是颠覆了传统意义上基因,提取的COI基因短到200bp~500bp也可 的物种认知,使人们对物种的理解变成了抽象的以准确鉴定物种( Haj babaei et al.,2006b)。植物 代码。也有学者提出应该取消DNA分类的概念,的线粒体基因进化速率较慢,COⅠ基因无法有效 认为DNA分类只是部分科学家的一厢情愿,并没区分物种,经过近几年的反复研究讨论,倾向于 有多少实际意义( Kohler et al.,2007)。还有学者在叶绿体基因组中选取不同片段进行组合( Chase 结合生态学、形态学、行为学等多种性状,进行etal.,2005; Kress et al.,2005)。 物种的鉴定、发现与高级阶元的分类,即综合分 但在DNA分类中,对于长度仅为658bp的 类(I egrate y)( Will et al.,2005)。实COI基因来讲,所包含的信息量并不足以很好的 际上,无论是DNA分类还是DNA条形码,无论在解决物种的系统发育等问题。特别是针对一些特 理论上或实际应用中都不可能完全取代传统分类,殊类群,仅仅凭借COⅠ基因不具有强大的说服 但却可以从各种不同的角度和领域填补传统分类力。所以,要进行更深层次的分类工作,一般仍 的不足或解决一些传统分类无法入手的难题。总需要再加至少一条其它区域的DNA序列(如核基 C1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
1 期 武宇鹏: DNA 条形码的应用进展及讨论 形码鉴定物种的准确率达到了 97% ( Janzen et al， 2005) 或 97. 9% ( Hajibabaei et al. ，2006b) 。在 鳞翅目等类群中，通过 DNA 条形码发现了大量隐 存种或新种 ( Herbert et al. ，2004a; Monaghan et al. ，2005) : Vaglia 等 ( 2008) 通过 DNA 条形码 在天蛾科 Sphingidae) 中发现的隐存种与形态学鉴 定结果相一致; Silva － Branda珓o 等 ( 2009) 认为鳞 翅目中出现如此多隐存种，跟动物相互之间通过 模仿或拟态而造成的物种形成或分化有关，借助 DNA 条形码是很好的研究途径; Janzen 等 ( 2009) 通过 DNA 条形码研究哥斯达黎加瓜纳卡斯特省 ( ACG) 的昆虫标本，发现该地区鳞翅目 19 个科 中，有 17 个科的种类有所增加。 另外，DNA 条形码能够从不同发育时期的动 植物标本或分散的组织中鉴别出物种，例如对幼 鱼的鉴定 ( Pegg et al. ，2006) ; Domingo － Roura 等 ( 2006) 通过对一种名贵的修面刷所用材料进行 DNA 条形码分析，获知该产品是由欧亚獾 Meles meles 的毛所制成; Teletchea 等 ( 2008) 将 DNA 条 形码用在对超市食品的检验上。DNA 条形码也可 用在对包含多种生物组合的环境样本如动物的粪 便、水、土壤等的鉴定中，例如根据粪便中提取 的线粒体 DNA 多态性，可以将在同一区域活动的 阿穆尔豹 Panthera pardus orientalis 和西伯利亚虎 Panthera tigris altaica 区分开来 ( Sugimoto et al. ， 2006) 。 但有不少学者反对仅仅依靠 DNA 序列进行物 种分类 ( Will and Rubinoff，2004; Moritz and Cicero，2004; Will et al. ，2005) 。他们提出抛弃传统 分类方法，会造成分类学的倒退，分类学有可能 又回归到依据单一性状进行分类的类型学 ( typology) 时代; 他们认为仅用 DNA 序列作为分类依据， 会丧失很多有用信息，特别是颠覆了传统意义上 的物种认知，使人们对物种的理解变成了抽象的 代码。也有学者提出应该取消 DNA 分类的概念， 认为 DNA 分类只是部分科学家的一厢情愿，并没 有多少实际意义 ( Khler et al. ，2007) 。还有学者 结合生态学、形态学、行为学等多种性状，进行 物种的鉴定、发现与高级阶元的分类，即综合分 类 ( Integrated taxonomy) ( Will et al. ，2005) 。实 际上，无论是 DNA 分类还是 DNA 条形码，无论在 理论上或实际应用中都不可能完全取代传统分类， 但却可以从各种不同的角度和领域填补传统分类 的不足或解决一些传统分类无法入手的难题。总 之，DNA 分类和 DNA 条形码研究仍然在飞速向前 推进。 3 与 DNA 条形码有关的讨论 3. 1 DNA 条形码与 DNA 分类的关系 DNA 条形码与 DNA 分类几乎同时提出，彼此 虽然 相 互 联 系，但 又 有 所 不 同 ( Vogler et al. ， 2006; Hajibabaei et al. ， 2007; DeSalle， 2005; DeSalle et al. ，2007) 。 目的不同: DNA 条形码基于 DNA 序列之间的 相似度进行物种鉴定，注重实效，而不是构建生 命树 ( the Tree of Life ) 或 进 行 系 统 发 育 研 究 ( Hajibabaei et al. ，2007) 。DNA 条形码只作为物种 鉴定的工具，并不单独作为物种分类的平台。相 比之下，DNA 分类则是要建立一个单独依靠 DNA 序列的分类系统 ( Blaxter et al. ，2005; Cognato et al. ，2006; Vogler et al. ，2007) 。虽然 DNA 分类结 果也需要与林奈命名系统相对应，但根据 Tautz ( 2003) 的构想，DNA 分类不依赖形态特征，能有 效排除人为因素，基于 DNA 序列的分类更为客观， 更接近物种的自然属性。DNA 分类在为物种鉴定 提供平台的同时，还需要进一步探讨物种的系统 发育、高阶元分类地位等深层次的内容。 所用基因不完全相同: DNA 条形码在提出之 初，就强调用统一的基因序列进行鉴定，虽然研 究者倡导在解决一些特殊类群，或处理一些特殊 情况如假基因、基因交流等时，需要再加一条候 补基因 ( alternate loci /candidate loci) ( Hajibabaei et al. ，2007) 。但目前动物类群中使用较多的仍是 COⅠ基因。甚至在一些特殊领域 ( 如法医) 中， 标本的 DNA 已经降解，无法提取完整长度的 COⅠ 基因，提取的 COⅠ基因短到 200 bp ～ 500 bp 也可 以准确鉴定物种 ( Hajibabaei et al. ，2006b) 。植物 的线粒体基因进化速率较慢，COⅠ基因无法有效 区分物种，经过近几年的反复研究讨论，倾向于 在叶绿体基因组中选取不同片段进行组合 ( Chase et al. ，2005; Kress et al. ，2005) 。 但在 DNA 分类中，对于长度仅为 658 bp 的 COⅠ基因来讲，所包含的信息量并不足以很好的 解决物种的系统发育等问题。特别是针对一些特 殊类群，仅仅凭借 COⅠ基因不具有强大的说服 力。所以，要进行更深层次的分类工作，一般仍 需要再加至少一条其它区域的 DNA 序列 ( 如核基 101
环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology 33卷 因等),甚至还需要附加其它的性状(生态学、行基础,很难成为适用于所有动物类群的标准值 为学等)来进行辅助研究( Hajibabaei et al.,( Meyer and Paulay,2005; Hickerson et al.,2006 Wiemer and Fiedler et al., 2007: Townzen et al 分析方法不完全相同:虽然DNA条形码主要2008)。也有学者指出,物种的形成是一个动态 用系统发育分析常用的树来做分析,但仅仅是为的、连续的过程,单用种内种间差异来进行物种 了验证物种的单源性和聚类关系,通常要求所用定义不能准确将其表达( Rubinoff et al!,2006)。 分析方法简洁、快速,所以这些树并不能看做系虽然传统概念上,生殖隔离的不同物种在DNA序 统发育树。而DNA分类为了解决系统发育与高级列的差异比同一物种之间可能要大,但DNA序列 阶元分类关系等问题,针对DNA序列的特点 的差异标准难以确定,是否针对各类群制定不一 能要用到多种软件、多种算法构建系统发育树,样的标准,仍需要进一步研究(Ⅴ ogler et al 运算耗时较长 2006)。 从某种程度上来讲,DNA条形码与DNA分类 物种定义是一个复杂的问题,虽然仅凭DNA 虽然目的不同,但也可相辅相成,DNA条形码计条形码并不足以解决,但DNA条形码提出的种内 划可以为DNA分类提供大量可用数据,完全可以种间差异阈值,及存在的种间基因流等现象可以 作为DNA分类系统的实践部分( practical compo-为进一步修订物种定义提供参考。 nent)( Hajibabaei et al., 2007) 3.3DNA条形码面临的问题 3.2物种概念的定义 3.3.1进化速率 近年来,有关物种概念的定义一直在争论之 COI基因在不同生物中的进化速率并不一致 中。十九世纪之前,分类学家主要根据生物表型( Erpenbeck et al.,2006),如果进化太慢,则难以 特征上的差异来识别和区分物种。随着现代综合鉴别物种。有研究表明,珊瑚虫线粒体DNA种间 进化论和群体遗传学的建立,Mayr(1963)提出差异很小,难以区分物种( Shearer et al.,202)。 了“生物学物种概念”( the biological species con-在高等植物中,COI基因并不适合物种鉴定 cept/BSC),认为对于有性生殖生物而言,物种是( Kress et al.,2005; Chase et al.,2005; Pennisi,, 个具有共同基因库、与其它类群之间存在生殖2007)。在这种情况下,需要增加其它候补基因。 隔离的类群。 CBOL植物工作组( CBOL Plant Working Group)提 但物种形成是一个渐进的过程,何时确定为出在植物DNA条形码中利用两种基因rcL和 新物种形成,有时在分类实践中难以操作。单从maK的组合来进行鉴定。而动物中,各个类群并 进化历史的一个截面上讨论物种问题,有其局限不一致。对于候补基因的确定,目前并没有统 性( Hennig,1966)。有学者认为物种形成是对不3.3.2假基因现象 同自然环境或性选择的分化适应,生殖隔离是这 核内的线粒体基因拷贝(即假基因 NUMTS 种分化适应的副产物,而没有必要将整个基因组 Willams and Kowlton,200l; Silva- Brandao et al. 上完全的生殖隔离作为物种形成的绝对标准2009)很容易用保守的通用引物与同源的线粒体 (Wu,2001)。 基因同时扩增出来,由于假基因进化速率一般较 DNA条形码的硏究不可避免会触及到物种定小,所以会严重影响DNA条形码的准确性。虽然 义的问题。 Herbert(2004b)认为,种内种间的线假基因可以鉴定( Thalmann et al.,2004; Silva 粒体COⅠ基因差异存在一个阈值( barcoding gap/ Brandao et al.,2009),但仍然会有遗漏,且其存 threhold),低于此阈值就可认为是同一个种,例如在不能预知,给研究带来了较大困难。目前有效 鳞翅目大约在3%左右( Herbert et al.,2003a)。避免扩增出假基因的技术正在不断完善,期待将 不少研究支持这一假设(鸟类: Hebert et al.,来能够加以妥善解决 2004b;鱼类: Ward et al.,2005;鳞翅目: Hajib-3.3.3种间线粒体基因交流 abaei et al.,2006b)。但在实际研究中,许多类群 因为线粒体基因属于母系遗传,所以可能会 存在种内种间线粒体基因序列差异重叠的现象,出现一些导致错误鉴定的现象。比如:种间杂交 而且各类群、谱系之间的阈值也不相同。有学者和内共生体感染,杀雄微生物和细胞质不亲和共 认为种内种间差异更多的是经验法则,缺乏理论生菌(如:沃尔巴克 wolbachia)所导致的在线粒 C1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology 33 卷 因等) ，甚至还需要附加其它的性状 ( 生态学、行 为学 等) 来 进 行 辅 助 研 究 ( Hajibabaei et al. ， 2007) 。 分析方法不完全相同: 虽然 DNA 条形码主要 用系统发育分析常用的树来做分析，但仅仅是为 了验证物种的单源性和聚类关系，通常要求所用 分析方法简洁、快速，所以这些树并不能看做系 统发育树。而 DNA 分类为了解决系统发育与高级 阶元分类关系等问题，针对 DNA 序列的特点，可 能要用到多种软件、多种算法构建系统发育树， 运算耗时较长。 从某种程度上来讲，DNA 条形码与 DNA 分类 虽然目的不同，但也可相辅相成，DNA 条形码计 划可以为 DNA 分类提供大量可用数据，完全可以 作为 DNA 分类系统的实践部分 ( practical component) ( Hajibabaei et al. ，2007) 。 3. 2 物种概念的定义 近年来，有关物种概念的定义一直在争论之 中。十九世纪之前，分类学家主要根据生物表型 特征上的差异来识别和区分物种。随着现代综合 进化论和群体遗传学的建立，Mayr ( 1963) 提出 了 “生物学物种概念” ( the biological species concept /BSC) ，认为对于有性生殖生物而言，物种是 一个具有共同基因库、与其它类群之间存在生殖 隔离的类群。 但物种形成是一个渐进的过程，何时确定为 新物种形成，有时在分类实践中难以操作。单从 进化历史的一个截面上讨论物种问题，有其局限 性 ( Hennig，1966) 。有学者认为物种形成是对不 同自然环境或性选择的分化适应，生殖隔离是这 种分化适应的副产物，而没有必要将整个基因组 上完 全 的 生 殖 隔 离 作 为 物 种 形 成 的 绝 对 标 准 ( Wu，2001) 。 DNA 条形码的研究不可避免会触及到物种定 义的问题。Herbert ( 2004b) 认为，种内种间的线 粒体 COⅠ基因差异存在一个阈值 ( baocoding gap / threhold) ，低于此阈值就可认为是同一个种，例如 鳞翅目大约在 3% 左右 ( Herbert et al. ，2003a) 。 不少研 究 支 持 这 一 假 设 ( 鸟 类: Hebert et al. ， 2004b; 鱼类: Ward et al. ，2005; 鳞翅目: Hajibabaei et al. ，2006b) 。但在实际研究中，许多类群 存在种内种间线粒体基因序列差异重叠的现象， 而且各类群、谱系之间的阈值也不相同。有学者 认为种内种间差异更多的是经验法则，缺乏理论 基础，很难成为适用于所有动物类群的标准值 ( Meyer and Paulay，2005; Hickerson et al. ，2006; Wiemer and Fiedler et al. ，2007; Townzen et al. ， 2008) 。也有学者指出，物种的形成是一个动态 的、连续的过程，单用种内种间差异来进行物种 定义不能准确将其表达 ( Rubinoff et al. ，2006) 。 虽然传统概念上，生殖隔离的不同物种在 DNA 序 列的差异比同一物种之间可能要大，但 DNA 序列 的差异标准难以确定，是否针对各类群制定不一 样的 标 准，仍 需 要 进 一 步 研 究 ( Vogler et al. ， 2006) 。 物种定义是一个复杂的问题，虽然仅凭 DNA 条形码并不足以解决，但 DNA 条形码提出的种内 种间差异阈值，及存在的种间基因流等现象可以 为进一步修订物种定义提供参考。 3. 3 DNA 条形码面临的问题 3. 3. 1 进化速率 COⅠ基因在不同生物中的进化速率并不一致 ( Erpenbeck et al. ，2006) ，如果进化太慢，则难以 鉴别物种。有研究表明，珊瑚虫线粒体 DNA 种间 差异很小，难以区分物种 ( Shearer et al. ，2002) 。 在高等 植 物 中，CO Ⅰ 基 因 并 不 适 合 物 种 鉴 定 ( Kress et al. ，2005; Chase et al. ，2005; Pennisi， 2007) 。在这种情况下，需要增加其它候补基因。 CBOL 植物工作组 ( CBOL Plant Working Group) 提 出在植物 DNA 条形码中利用两种基因 rbcL 和 matK 的组合来进行鉴定。而动物中，各个类群并 不一致。对于候补基因的确定，目前并没有统一。 3. 3. 2 假基因现象 核内的线粒体基因拷贝 ( 即假基因 NUMTs， Willams and Kowlton，2001; Silva － Branda珓o et al. ， 2009) 很容易用保守的通用引物与同源的线粒体 基因同时扩增出来，由于假基因进化速率一般较 小，所以会严重影响 DNA 条形码的准确性。虽然 假基因可以鉴定 ( Thalmann et al. ，2004; Silva － Branda珓o et al. ，2009) ，但仍然会有遗漏，且其存 在不能预知，给研究带来了较大困难。目前有效 避免扩增出假基因的技术正在不断完善，期待将 来能够加以妥善解决。 3. 3. 3 种间线粒体基因交流 因为线粒体基因属于母系遗传，所以可能会 出现一些导致错误鉴定的现象。比如: 种间杂交 和内共生体感染，杀雄微生物和细胞质不亲和共 生菌 ( 如: 沃尔巴克 wolbachia) 所导致的在线粒 102
武宇鹏:DNA条形码的应用进展及讨论 103 体基因上发生的间接选择( Funk et al.,2000计算模型( barcoding.si.edu/)。也有少数研究采 Whitworth et al.,2007)。沃尔巴克是细胞内寄生、用多元尺度分析( Multidimensional scalin, Herbert 系遗传的α-变形菌。约有17%~76%的节肢etal.,2003a)、似然法( Likelihood, Matz and 动物被沃尔巴克感染,包括昆虫及蛛螨类。已有 Neilsen,2005)或贝叶斯( Nielsen and Matz 研究发现,沃尔巴克等内共生菌的存在,会造成2006)等方法。 寄主 mtDNA多态性降低或提高,从而影响基于 常用的系统发育分析方法有NJ( Neighbor- mt DNA的DNA条形码及系统发育研究。也有学者 Joining)、 UPGMA( Unweighted pair group method 正在积极进行沃尔巴克共生菌的研究,期待能有 with arithmetic mean)、ML( Maximum likelihood 效避免其对DNA条形码研究的影响 MP( Maximum parsimony)、贝叶斯、 austerlitz等。 另外,Funk和 Omland(2003)在对2319个第二次迅OL会议(台北,2007年9月)对几种系 动物种类的研究中发现有23%的动物种类线粒体统发育分析方法进行了比较,认为ML法比基于遗 DNA呈多系( polyphyly)或并系( paraphyly),另传距离的系统发育分析方法更准确,但ML法运算 外还有发生在一个谱系中的网状进化等现象时间较长。此外,所有方法的精确性受取样范围 ( Huler et a.,2007; Silva- Brandao et al.,2009),和分类单元内变异程度所影响。 Lahaye等(2008) 如果仅用线粒体DNA条形码来鉴定物种,可能会经过研究认为,MP法和 UPGMA法得到的物种正 出现很多错误( Mever and Paulay,2005; Meier et确识别率最高,并在最新的论文中只用这两种方 法。但目前DNA条形码研究使用较多的仍然是基 3.3.4取样的问题 于遗传距离的系统发育分析方法,如NJ法。在对 些浸泡标本给取样带来了困难。例如浸泡大规模数据组进行分析时,N法速度较快,在物 在福尔马林等溶液中的标本,无法提取DNA种序列同源性较高的情况下,N法的准确性是值 ( Frezal et al.,2008)。还有一些个体很小的标本,得信任的。 如果用作DNA提取,将会完全破坏标本,或模式 些研究者认为基于遗传距离的计算方法有 标本不复存在。对于后者,有研究设计出超声波缺陷,如种内种间差异经常发生重叠的问题,而 降解法,从体长在毫米数量级的蚋科昆虫标本中这些缺陷可用基于多种性状的分析方法( character 成功地提取DNA( Mann et a.,2009)。但该方法 based approach)( De salle et al.,2005)或纯粹 仍然存在缺陷,由于PCR阻碍物的存在、DNA释基于分类算法的统计方法CAOS( characteristic at 放量不充足以及提取到的DNA片段被过度缩短等 tribute organization system)( Sarkar et al.,2002) 原因,并不是所有标本都可按照这种方法提取加以解决。但这些方法目前仅在蜻蜓目( Rach et DNA和进行随后的DNA序列分析。 al.,208)、石鳖( Kelly et al.,2007)等类群中 也有研究者提出,因为取样的范围过小和不应用。其它计算方法还有最大似然法、 BLAST等 均匀,才会出现种内种间有差异阈值的现象存在但均未广泛应用。 ( Meyer and Paulay,2005),如果增加地理种和近 缘种的干扰,DNA条形码鉴定的准确率就会下降。4DNA条形码计划在我国的进展 所以取样时,尽可能包括同一种群的不同地理亚 种,使DNA条形码数据库的覆盖面尽可能扩大 由CBOL主办的国际条形码会议已经举办了 才能达到准确鉴定物种的目的。而且,目前对于届,我国均有代表与会。2008年4月,中国科学 DNA样品的收集和保存还没有一个统一的标准,院代表团与BOL签订了合作谅解备忘录,使我国 保护这些具有潜在价值的DNA样品是一个亟待解成为迅BOL四个中心节点之一,与加拿大、美国和 决的问题。 欧盟具有同等地位。随后又成立了迅BOL中国委员 3.3.5分析方法 会,该委员会设立了南方和北方两个分中心,该 DNA条形码一般采用K-2-P( Kimura-2 委员会的主要宗旨在于加强我国与iBOL的合作 parameter)模型计算种内种间距离。K2P是遗传同时搭建中国DNA条形码数据库体系与协同工作 距离值很小时的最佳模型( Hebert et al.,2003a),平台并召开iOL中国委员会会议,争取经费,合 是生物条形码联盟(CBOL)推荐使用的遗传距离理配置人力资源,推动学科发展 C1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
1 期 武宇鹏: DNA 条形码的应用进展及讨论 体基因上发生的间接选择 ( Funk et al. ，2000; Whitworth et al. ，2007) 。沃尔巴克是细胞内寄生、 母系遗传的 α － 变形菌。约有 17% ～ 76% 的节肢 动物被沃尔巴克感染，包括昆虫及蛛螨类。已有 研究发现，沃尔巴克等内共生菌的存在，会造成 寄主 mtDNA 多态性降低或提高，从而影响基于 mtDNA的 DNA 条形码及系统发育研究。也有学者 正在积极进行沃尔巴克共生菌的研究，期待能有 效避免其对 DNA 条形码研究的影响。 另外，Funk 和 Omland ( 2003) 在对 2319 个 动物种类的研究中发现有 23% 的动物种类线粒体 DNA 呈多系 ( polyphyly) 或并系 ( paraphyly) ，另 外还 有 发 生 在 一 个 谱 系 中 的 网 状 进 化 等 现 象 ( Hulcr et al. ，2007; Silva － Branda珓o et al. ，2009) ， 如果仅用线粒体 DNA 条形码来鉴定物种，可能会 出现很多错误 ( Meyer and Paulay，2005; Meier et al. ，2006) 。 3. 3. 4 取样的问题 一些浸泡标本给取样带来了困难。例如浸泡 在福 尔 马 林 等 溶 液 中 的 标 本，无 法 提 取 DNA ( Frézal et al. ，2008) 。还有一些个体很小的标本， 如果用作 DNA 提取，将会完全破坏标本，或模式 标本不复存在。对于后者，有研究设计出超声波 降解法，从体长在毫米数量级的蚋科昆虫标本中 成功地提取 DNA ( Mann et al. ，2009) 。但该方法 仍然存在缺陷，由于 PCR 阻碍物的存在、DNA 释 放量不充足以及提取到的 DNA 片段被过度缩短等 原因，并不是所有标本都可按照这种方法提取 DNA 和进行随后的 DNA 序列分析。 也有研究者提出，因为取样的范围过小和不 均匀，才会出现种内种间有差异阈值的现象存在 ( Meyer and Paulay，2005) ，如果增加地理种和近 缘种的干扰，DNA 条形码鉴定的准确率就会下降。 所以取样时，尽可能包括同一种群的不同地理亚 种，使 DNA 条形码数据库的覆盖面尽可能扩大， 才能达到准确鉴定物种的目的。而且，目前对于 DNA 样品的收集和保存还没有一个统一的标准， 保护这些具有潜在价值的 DNA 样品是一个亟待解 决的问题。 3. 3. 5 分析方法 DNA 条形码一般采用 K － 2 － P ( Kimura － 2 － parameter) 模型计算种内种间距离。K2P 是遗传 距离值很小时的最佳模型 ( Hebert et al. ，2003a) ， 是生物条形码联盟 ( CBOL) 推荐使用的遗传距离 计算模型 ( barcoding. si. edu /) 。也有少数研究采 用多元尺度分析 ( Multidimensional scaling，Herbert et al. ，2003a ) 、似 然 法 ( Likelihood，Matz and Neilsen，2005 ) 或 贝 叶 斯 ( Nielsen and Matz， 2006) 等方法。 常用的系统发育分析方法有 NJ ( Neighbor － Joining) 、UPGMA ( Unweighted pair group method with arithmetic mean) 、ML ( Maximum Likelihood) 、 MP ( Maximum Parsimony) 、贝叶斯、Austerlitz 等。 第二次 iBOL 会议 ( 台北，2007 年 9 月) 对几种系 统发育分析方法进行了比较，认为 ML 法比基于遗 传距离的系统发育分析方法更准确，但 ML 法运算 时间较长。此外，所有方法的精确性受取样范围 和分类单元内变异程度所影响。Lahaye 等 ( 2008) 经过研究认为，MP 法和 UPGMA 法得到的物种正 确识别率最高，并在最新的论文中只用这两种方 法。但目前 DNA 条形码研究使用较多的仍然是基 于遗传距离的系统发育分析方法，如 NJ 法。在对 大规模数据组进行分析时，NJ 法速度较快，在物 种序列同源性较高的情况下，NJ 法的准确性是值 得信任的。 一些研究者认为基于遗传距离的计算方法有 缺陷，如种内种间差异经常发生重叠的问题，而 这些缺陷可用基于多种性状的分析方法 ( character － based approach) ( DeSalle et al. ，2005) 或纯粹 基于分类算法的统计方法 CAOS ( characteristic attribute organization system) ( Sarkar et al. ，2002) 加以解决。但这些方法目前仅在蜻蜓目 ( Rach et al. ，2008) 、石鳖 ( Kelly et al. ，2007) 等类群中 应用。其它计算方法还有最大似然法、BLAST 等， 但均未广泛应用。 4 DNA 条形码计划在我国的进展 由 CBOL 主办的国际条形码会议已经举办了三 届，我国均有代表与会。2008 年 4 月，中国科学 院代表团与 iBOL 签订了合作谅解备忘录，使我国 成为 iBOL 四个中心节点之一，与加拿大、美国和 欧盟具有同等地位。随后又成立了 iBOL 中国委员 会，该委员会设立了南方和北方两个分中心，该 委员会的主要宗旨在于加强我国与 iBOL 的合作， 同时搭建中国 DNA 条形码数据库体系与协同工作 平台并召开 iBOL 中国委员会会议，争取经费，合 理配置人力资源，推动学科发展。 103