实验七果汁粉中维生素C的测定（直接碘量法）1实验目的（1）掌握直接碘量法测定维生素C的原理和方法。(2）理解直接碘量法和2，6-二氯酚靛酚法测定维生素C的优缺点。(3）进一步掌握碘和Na2S2O3标准溶液的配置和标定。2实验原理维生素C分子中的稀二醇基具有还原性，能被I2定量氧化成二酮基，故可用I2标准溶液直接滴定，用淀粉溶液作指示剂，若溶液突变成蓝色，则滴定终点到达，反应式为：OFOHHCH +1,CH+2HIOOHOHHOHHOHH由于维生素的还原性很强，在空气中极易被氧化，尤其在碱性介质中更甚，测定时加入HAc使溶液呈弱酸性，以减少维生素C的副反应。I2溶液的浓度由已知浓度的Na2S2O3标准溶液标定，以淀粉为指示剂，发生如下反应：2S2032-+12=S402-+2I根据以上反应，可计算出药片中维生素C的质量分数c(12)V(I2)M((CgHg06)w(Cg,Hg06)% = 9m(C.H.0)式中：c(12)一碘溶液的浓度，V(I2)一滴定时所用I2溶液的体积，LM(C6H8O6)一维生素C的摩尔质量，176.12g-mol-m(C6H8O6)一称取的维生素C的质量，g3实验仪器和试剂（1）实验仪器滴定管、容量瓶、烧杯(2）实验试剂0.05molL-I2溶液的配制：在托盘天平上称取6.5gI2和10g碘化钾，放入24
24 实验七 果汁粉中维生素 C 的测定 （直接碘量法） 1 实验目的 (1) 掌握直接碘量法测定维生素 C 的原理和方法。 (2) 理解直接碘量法和 2，6-二氯酚靛酚法测定维生素 C 的优缺点。 (3) 进一步掌握碘和 Na2S2O3 标准溶液的配置和标定。 2 实验原理 维生素 C 分子中的稀二醇基具有还原性，能被 I2 定量氧化成二酮基，故可 用 I2 标准溶液直接滴定，用淀粉溶液作指示剂，若溶液突变成蓝色，则滴定终点 到达，反应式为： 由于维生素的还原性很强，在空气中极易被氧化，尤其在碱性介质中更甚， 测定时加入 HAc 使溶液呈弱酸性，以减少维生素 C 的副反应。 I2 溶液的浓度由已知浓度的 Na2S2O3 标准溶液标定，以淀粉为指示剂，发生 如下反应： 2S2O3 2-＋I2 ＝S4O6 2-＋2I- 根据以上反应，可计算出药片中维生素 C 的质量分数 𝑤(C6H8O6 )% = 𝑐(I2)𝑉(I2)𝑀((C6H8O6 )) 𝑚(C6H8O6 ) 式中：c(I2)—碘溶液的浓度， V(I2)—滴定时所用 I2 溶液的体积，L M(C6H8O6)—维生素 C 的摩尔质量，176.12 gmol-1 m(C6H8O6)—称取的维生素 C 的质量，g 3 实验仪器和试剂 (1) 实验仪器 滴定管、容量瓶、烧杯 (2) 实验试剂 0.05 molL -1 I2 溶液的配制：在托盘天平上称取 6.5 g I2 和 10 g 碘化钾，放入
小烧杯中，加少许蒸馏水，用玻璃棒搅拌至I2全部溶解后，转移至500mL带玻璃塞的棕色细口瓶中，稀释至500mL，摇匀，贮于阴暗处备用。0.1mol-L-1Na2S2O3溶液的配制：在托盘天平上称取13gNa2S2O3·5H2O，溶于500mL新煮沸冷却的蒸馏水中，加0.1gNa2CO3，保存于棕色试剂瓶中，放置一周后进行标定。4实验步骤（1）KBrO3基准物质标定Na2S2O3标准溶液准确称取基准物质KBrO30.6~0.8g于小烧杯中，加水溶解，定量转移至250mL容量瓶中，加水稀释至刻度，充分摇匀。用移液管吸取25.00mLKBrO3标准溶液于250mL锥形瓶中，加入20mL10%KI溶液及5mL3mol-L-H2SO4溶液，混匀，在暗处放置5min。然后加水稀释至100~150mL，立即用待标定的Na2S20溶液滴定至浅黄色，加入3mL淀粉溶液，继续小心滴定至溶液由蓝色变为无色即为终点。平行测定三次，计算Na2S2O3标准溶液的浓度和相对平均偏差。(2）I2标准溶液的标定用移液管吸取25.00mL待标定的12溶液，于250mL锥形瓶中，加50mL水，用Na2S2O3标准溶液滴定至浅黄色时，加入淀粉指示剂2~3mL，继续用Na2S2O3溶液滴定至蓝色消失，即为终点。平行测定三次，计算I2标准溶液的浓度和相对平均偏差。(3）维生素C含量的测定用移液管准确量取25ml水溶c100于250ml容量瓶内，用去离子水稀释至刻度，摇匀。吸取上述溶液5mL于锥形瓶中，加入煮沸并冷却的蒸馏水10mL和10mL2mol-L-HAc溶液，加入淀粉指示剂2~3mL，立即用I2标准溶液滴定至出现蓝色，30s不褪色即为终点。平行测定3次，计算维生素C的含量。5思考题(1）测定维生素C的含量时，溶液中为什么要加入稀HAc？（2）溶解维生素C样品为什么用新煮沸并冷却的蒸馏水？25
25 小烧杯中，加少许蒸馏水，用玻璃棒搅拌至 I2 全部溶解后，转移至 500 mL 带玻 璃塞的棕色细口瓶中，稀释至 500 mL，摇匀，贮于阴暗处备用。 0.1 molL -1 Na2S2O3 溶液的配制：在托盘天平上称取 13 g Na2S2O35H2O，溶 于 500 mL 新煮沸冷却的蒸馏水中，加 0.1 g Na2CO3，保存于棕色试剂瓶中，放 置一周后进行标定。 4 实验步骤 (1) KBrO3 基准物质标定 Na2S2O3 标准溶液 准确称取基准物质 KBrO3 0.6~0.8 g 于小烧杯中，加水溶解，定量转移至 250 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，充分摇匀。用移液管吸取 25.00 mL KBrO3 标准 溶液于 250 mL 锥形瓶中，加入 20 mL10% KI 溶液及 5 mL 3 molL -1 H2SO4 溶液， 混匀，在暗处放置 5 min。然后加水稀释至 100~150 mL，立即用待标定的 Na2S2O3 溶液滴定至浅黄色，加入 3 mL 淀粉溶液，继续小心滴定至溶液由蓝色变为无色 即为终点。平行测定三次，计算 Na2S2O3 标准溶液的浓度和相对平均偏差。 (2) I2 标准溶液的标定 用移液管吸取 25.00 mL 待标定的 I2 溶液，于 250 mL 锥形瓶中，加 50 mL 水，用 Na2S2O3 标准溶液滴定至浅黄色时，加入淀粉指示剂 2~3 mL，继续用 Na2S2O3 溶液滴定至蓝色消失，即为终点。平行测定三次，计算 I2 标准溶液的浓 度和相对平均偏差。 (3) 维生素 C 含量的测定 用移液管准确量取 25 ml 水溶 c100 于 250 ml 容量瓶内，用去离子水稀释至刻 度，摇匀。吸取上述溶液 5 mL 于锥形瓶中，加入煮沸并冷却的蒸馏水 10 mL 和 10 mL 2 molL -1 HAc 溶液，加入淀粉指示剂 2~3 mL，立即用 I2 标准溶液滴定至 出现蓝色，30 s 不褪色即为终点。平行测定 3 次，计算维生素 C 的含量。 5 思考题 (1) 测定维生素 C 的含量时，溶液中为什么要加入稀 HAc？ (2) 溶解维生素 C 样品为什么用新煮沸并冷却的蒸馏水？
实验八蛋白质含量的测定（双缩脲法）1实验目的（1）学习分光光度法测定的原理和方法。（2）学习蛋白质含量测定的原理和方法。（3）掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。2实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两分子尿素经180℃左右加热脱氨缩合得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与Cu2+形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或通过过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都能够发生双缩脲反应。NH2NH2NH2O0NH20~00NH2135~190CCu2tNHHNNHOHO-CNH2A0-00-Cu2+NtNHNH2HNNH尿素紫红色络合物双缩脲紫色络合物在540nm处有吸收峰，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。因此，将待测样在碱性溶液中与双缩脲试剂反应，所得吸光值在标准曲线上查出所对应的值，得到样品蛋白质的含量。3实验仪器与试剂（1）实验仪器试管及试管架、移液管、分光光度计(2）实验试剂卵清蛋白液：取鸡蛋一个，去蛋白后，用0.9%NaCl溶解并定容至250mL。测定时再稀释十倍。标准蛋白质溶液：准确称取标准蛋白质（常用牛血清白蛋白），用水配制成10g/L的溶液，称取牛血清白蛋白250mg置于25ml容量瓶中，用0.9%NaCl溶解后稀释至刻度，（可用1mg牛血清白蛋白/ml的A280为0.66来校正）。双缩脲试剂：称取1.5g硫酸铜(CuSO4.5H2O)和6g酒石酸钾（NaKC4H4O4H2O）依次溶解于500ml水中，在搅拌下加入300ml10%氢氧化26
26 实验八蛋白质含量的测定 （双缩脲法） 1 实验目的 (1) 学习分光光度法测定的原理和方法。 (2) 学习蛋白质含量测定的原理和方法。 (3) 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。 2 实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两分子尿素经 180℃左右加热脱氨缩合得到 的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 Cu2+形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡 具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或通过过一个中间碳原子相连的肽键， 这类化合物都能够发生双缩脲反应。 紫色络合物在 540 nm 处有吸收峰，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而 与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。因此，将待测样在碱性溶液中与双缩脲试剂 反应，所得吸光值在标准曲线上查出所对应的值，得到样品蛋白质的含量。 3 实验仪器与试剂 (1) 实验仪器 试管及试管架、移液管、分光光度计 (2) 实验试剂 卵清蛋白液：取鸡蛋一个，去蛋白后，用 0.9%NaCl 溶解并定容至 250 mL。 测定时再稀释十倍。 标准蛋白质溶液：准确称取标准蛋白质（常用牛血清白蛋白），用水配制成 10 g/L 的溶液，称取牛血清白蛋白 250 mg 置于 25 ml 容量瓶中，用 0.9％NaCl 溶 解后稀释至刻度，（可用 1 mg 牛血清白蛋白/ml 的 A280 为 0.66 来校正）。 双 缩 脲 试 剂 ： 称 取 1.5 g 硫酸铜 (CuSO4·5H2O) 和 6 g 酒石酸钾 （NaKC4H4O6·4H2O）依次溶解于 500 ml 水中，在搅拌下加入 300 ml 10%氢氧化
钠溶液，用水稀释到1L。通常可加入1g碘化钾以防止铜原子自动还原形成氧化亚铜沉淀。所用的蒸馏水应煮沸以逐出所溶解的二氧化碳，待冷却后配制。配好的双缩脲试剂应储存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存，若瓶中有黑色沉淀出现则需要重配。4实验步骤（1）制标准曲线取试管6支，编号1~6，按表8-1顺序加入各试剂，于540nm处测定A值。234567试管号1800.20.40.60.81.00010g/L标准蛋白（ml）0000001.01.0未知样品（ml）01.00.80.60.40.2 00蒸馏水（ml）4.04.04.04.0双缩脲试剂（ml）4.04.04.04.0A540以溶液中蛋白质浓度为横坐标，A540为纵坐标作标准曲线。用该方法制得的标准曲线的线性及重复性较好，一般每配一次溶液作一次标准曲线即可。(2）样品测定取两支试管，编号7、8，按上表顺序加入各试剂，与540nm处测定A值。未知浓度的样品同上法测A540，然后从标准曲线上查得其所对应的蛋白质浓度，注意样品浓度若超过10g·L-，则应作适当稀释。若样品中脂类等含量过高，则在30min后会有雾状沉淀产生，故须注意控制在30min内比色完毕。27
27 钠溶液，用水稀释到 1 L。通常可加入 1 g 碘化钾以防止铜原子自动还原形成氧 化亚铜沉淀。所用的蒸馏水应煮沸以逐出所溶解的二氧化碳，待冷却后配制。配 好的双缩脲试剂应储存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保 存，若瓶中有黑色沉淀出现则需要重配。 4 实验步骤 (1) 制标准曲线 取试管 6 支，编号 1~6，按表 8-1 顺序加入各试剂，于 540 nm 处测定 A 值。 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 10 g/L 标准蛋白（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 未知样品（ml） 0 0 0 0 0 0 1.0 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 A540 以溶液中蛋白质浓度为横坐标，A540 为纵坐标作标准曲线。用该方法制得的 标准曲线的线性及重复性较好，一般每配一次溶液作一次标准曲线即可。 (2) 样品测定 取两支试管，编号 7、8，按上表顺序加入各试剂，与 540 nm 处测定 A 值。 未知浓度的样品同上法测 A540，然后从标准曲线上查得其所对应的蛋白质浓度， 注意样品浓度若超过 10 gL -1，则应作适当稀释。若样品中脂类等含量过高，则 在 30 min 后会有雾状沉淀产生，故须注意控制在 30 min 内比色完毕
实验九蛋白质含量测定（凯氏定氮法）1实验目的（1）学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。（2）掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。2实验原理蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford)。其中，凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用，生成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来计算含氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。NH3+H3BO3=NH4++H2BO3H++H2BO3'=-H3BO33实验仪器和试剂(1）实验试剂容量瓶、烧杯、玻璃棒、凯氏定氮仪(2）实验试剂0.1000mol/LHCl标准溶液的配制和标定：量取9mL浓HCl（浓度36%~38%），用蒸馏水稀释并定容至1000mL容量瓶，摇匀。浓度近似0.1mol-L-l。用基准物质硼砂（Na2B4O7-10H2O）标定HCI浓度：准确称取0.4~0.5g硼砂于250mL锥形瓶内，加入30ml蒸馏水，加热溶解，冷却后加入1~2滴甲基红指示剂，用0.1mol-L-HCI溶液滴定至溶液又黄色变为橙色，即为终点。根据硼砂的量准确计算HCI标准溶液的浓度。28
28 实验九 蛋白质含量测定 （凯氏定氮法） 1 实验目的 (1) 学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 (2) 掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含 量计算等。 2 实验原理 蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前 常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法 (Bradford)。其中，凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定 试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方 法。 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定 4 个过程。其原理 是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产 生氨，氨又与硫酸作用，生成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后， 再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来计算含氮量，然后乘以蛋白质换算系 数，即得蛋白质含量。 NH3+H3BO3=NH4 + +H2BO3 - H ++H2BO3 -=H3BO3 3 实验仪器和试剂 (1) 实验试剂 容量瓶、烧杯、玻璃棒、凯氏定氮仪 (2) 实验试剂 0.1000 mol/L HCl 标准溶液的配制和标定： 量取 9 mL 浓 HCl（浓度 36%~38%），用蒸馏水稀释并定容至 1000 mL 容量 瓶，摇匀。浓度近似 0.1 molL -1。 用基准物质硼砂（Na2B4O7·10H2O）标定 HCl 浓度：准确称取 0.4~0.5 g 硼砂 于 250 mL 锥形瓶内，加入 30 ml 蒸馏水，加热溶解，冷却后加入 1~2 滴甲基红 指示剂，用 0.1 molL -1 HCl 溶液滴定至溶液又黄色变为橙色，即为终点。根据硼 砂的量准确计算 HCl 标准溶液的浓度