2.限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著区别在子()A A前者是物理图谱后者是连锁图B.前者是连锁图后者是物理图谱 C前者是遗传图谱后者是物理图谱D,前者是物理图谱后者是遗传图谱 3.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于()C只能作用于双链DNA A.既可以作用于双链DNA,又可以作用于单链DNAB.只能作用于单链DNA C.只能作用于双链DNAD.只能作用于RNA 4.己知某一内切酶在一个环状DNA上有4个切点，当用此酶切割该环状DNA,可以得到 ()个片段B4 A3B.4C.5D.6 5.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶星星活性的主要原因 之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在()以下A5% A.5%B.10%C.20%D.30% 6。在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制哪一项最好()D酶量 A反应体积B.酶反应温度C.反应时间D.酶量 7.下列试剂中，哪一种可以整合Ca2+离子()D EGTA A.EDTA B.柠檬酸钠C.SDSD.EGTA 8.DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能() C南失活 A蛋白质（如BSA)同DNA结合B有外切核酸酶污染C酶失活D.酶切条件不适合 9.nick与g即的区别在于()A前者是断开了一个磷酸二酯健，后者是指DNA的单链中有较小的 缺失 A前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指DNA的单链中有较小的缺失 B.前者是是指DNA的单链中有较小的缺失，后者是指断开了一个磷酸二酯键 C.二者无本质区别 D.二者无本质区别 10.可以在切口部位起作用的酶是()BS1核酸酶 ABAL31核酸酶B.S1核酸酶C.核糖核酸酶AD.入外切核酸酶 1L.Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了()活性A5-3外切 A.5-3外切酶B.5-3合成酶C.转移酶D.3-5外切酶
2. 限制性图谱与限制性片段长度多态性（RFLP）图谱的最显著区别在于（） A A.前者是物理图谱后者是连锁图 B.前者是连锁图后者是物理图谱 C.前者是遗传图谱后者是物理图谱 D.前者是物理图谱后者是遗传图谱 3. 迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（）C 只能作用于双链 DNA A. 既可以作用于双链 DNA ，又可以作用于单链 DNA B.只能作用于单链 DNA C.只能作用于双链 DNA D.只能作用于 RNA 4. 已知某一内切酶在一个环状 DNA 上有 4 个切点，当用此酶切割该环状 DNA ，可以得到 （）个片段 B 4 A.3 B. 4 C. 5 D.6 5. 甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶星星活性的主要原因 之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（）以下 A 5% A.5% B.10% C.20% D.30% 6. 在下列进行 DNA 部分酶切的条件中，控制哪一项最好（）D 酶量 A.反应体积 B.酶反应温度 C.反应时间 D.酶量 7. 下列试剂中，哪一种可以螯合 Ca2＋ 离子（） D EGTA A.EDTA B.柠檬酸钠 C.SDS D.EGTA 8. DNA 被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能（） C 酶失活 A.蛋白质（如 BSA）同 DNA 结合 B.有外切核酸酶污染 C.酶失活 D.酶切条件不适合 9. nick 与 gap 的区别在于（）A 前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指 DNA 的单链中有较小的 缺失 A.前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指 DNA 的单链中有较小的缺失 B.前者是是指 DNA 的单链中有较小的缺失，后者是指断开了一个磷酸二酯键 C.二者无本质区别 D.二者无本质区别 10. 可以在切口部位起作用的酶是（） B S1 核酸酶 A.BAL31 核酸酶 B.S1 核酸酶 C.核糖核酸酶 A D.λ 外切核酸酶 11. Klenow 酶与 DNA 聚合酶相比，前者丧失了（）活性 A 5'-3' 外切酶 A. 5'-3' 外切酶 B.5'-3' 合成酶 C.转移酶 D.3'-5' 外切酶
12.限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。命名时()A A屈名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） B种名第一字母，属名头两个字母，茵株号，然后再加上序号（罗马字） C属名第一字母，亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） D.种名第一字母，亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字 13.以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的()A识别相同序列的限制南称同裂需 A识别相同序列的限制酶称同裂酶B.可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶 C同裂酶的切割位点一定相同D.同裂酶的切制位点不相同 14.下列DNA聚合酶中，哪一种酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链切口，即切口酶 ()A Dnase I A.Dnase I B.Klenow DNA聚合酶C,T4噬菌体DNA聚合酶D.T7噬茵体DNA聚合酵 15.BAP与CIAP的区别在于()B CIAP68℃时失活，而BAP68C稳定 A.BAP68C时失活，而CIAP68℃稳定B.CIAP68C时失活，而BAP68C稳定 C.二者均耐酚抽D.二者均不耐酚抽 16.下列哪一种酶作用时需要引物()B反转录酶 A.末端转移酶B.反转录酶C.DNA连接酶D.限制酶 17.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有()不恰当D A由作用于同一DNA序列的两种酶构成B这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用 对DNA进行修饰C.不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统D这一系统的核酸酶都是 Ⅱ类限制性内切核酸酶 18.限制性内切核酸酶可以特异性地识别()C双链DA的特定碱基序列 A.特定的三联密码B.双链DNA的特定碱基对C双链DNA的特定碱基序列D.单 链DNA的特定碱基序列 19.在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用()BT7DNA聚合酶 AT4DNA聚合酶B.T7DNA聚合酶C.Klenow DNA聚合酶D.大肠杆菌DNA聚合酶 四、简答题 L,简述限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)的概念及其生物学功能？ 定义：指识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切馥。生物学功能：保扩 宿主不受外米DNA分子的感染，可降解外来的DNA分子，从而阻止其复制和整合到细胞中. 2.PCR引物设计引入酶切位点时，为什么需在醇切位点后加上一些碱基？
12. 限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。命名时（）A A.属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） B.种名第一字母，属名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） C.属名第一字母，亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） D.种名第一字母，亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字） 13. 以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（） A 识别相同序列的限制酶称同裂酶 A.识别相同序列的限制酶称同裂酶 B.可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶 C.同裂酶的切割位点一定相同 D.同裂酶的切割位点不相同 14. 下列 DNA 聚合酶中，哪一种酶只切割双链 DNA 中的一条链，产生单链切口，即切口酶 （）A DnaseⅠ A.DnaseⅠ B.Klenow DNA 聚合酶 C.T4 噬菌体 DNA 聚合酶 D.T7 噬菌体 DNA 聚合酶 15. BAP 与 CIAP 的区别在于（） B CIAP 68℃ 时失活，而 BAP 68℃ 稳定 A. BAP 68℃ 时失活，而 CIAP 68℃ 稳定 B.CIAP 68℃ 时失活，而 BAP 68℃ 稳定 C.二者均耐酚抽 D.二者均不耐酚抽 16. 下列哪一种酶作用时需要引物（） B 反转录酶 A.末端转移酶 B.反转录酶 C.DNA 连接酶 D.限制酶 17. 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下述描述中只有（）不恰当 D A.由作用于同一 DNA 序列的两种酶构成 B.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用 对 DNA 进行修饰 C.不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 D.这一系统的核酸酶都是 Ⅱ类限制性内切核酸酶 18. 限制性内切核酸酶可以特异性地识别（）C 双链 DNA的特定碱基序列 A.特定的三联密码 B.双链 DNA 的特定碱基对 C.双链 DNA 的特定碱基序列 D.单 链 DNA 的特定碱基序列 19. 在长模板链的指导下引物延伸合成长的 DNA 互补链时应选用（）B T7 DNA聚合酶 A.T4 DNA 聚合酶 B.T7 DNA 聚合酶 C.Klenow DNA 聚合酶 D.大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ 四、简答题 1. 简述限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的概念及其生物学功能？ 定义：指识别 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶。生物学功能：保护 宿主不受外来 DNA分子的感染，可降解外来的 DNA 分子，从而阻止其复制和整合到细胞中。 2. PCR 引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？
限制酶切制D八A时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量 的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切制活性。因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另如3一4个碱 基。 3.试回答影响限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)切割效率的因素？ 外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性：内因：位点偏爱性：甲基化：底物的 构象。 4.在酶切缓冲液中，一般需加入BSA,请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？ 作用是提供一定的蛋白质浓度，起保护限制性内切酶的作用，限制性内切酶在稀释液中会迅速变性，BSA是 一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。 5.何谓Star activity?简述Star activity的影响因素及克服方法 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。引起星星活 性的的因素：①高甘油浓度(>5%)：②南过量(>100Um1):®低离子强度(<25mM):④高pH(>8.0 ⑤有机溶剂如PMSD(二甲基亚砜)、入乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(),二甲基甲酰鞍 (dimethylformamide)和sulphalane等：⑥用其它二价阳高子Mn2+、C2+、Co2+或Zn2+代替Mg2+, 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，免过量切，减少甘油浓度：②保证反应体系中无有机溶剂或 乙醇：③提高离子强度到100~150mM(在不抑制酶活性的前提下)：④降低反应pH至7.0：⑤使用Mg2+作 为二价阳离子。 6.某DNA序列中存在Dpl酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用 该酶进行酶切时，发现切制不动，试分析可能原因？ 生物体内的DNA序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化 的限制酶Dpl来切制非甲基化的序列时，就会出现不能切制的情况 7.天然的质粒载体(plasmid vectors)通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段， 引入多克隆位点等。试问在此过程中如何增减酶切位点？ 在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。①将产生的了突出端补平后，再连接以产生新的酶切 位点：②同尾末端的连接，不同的同尾酶切制D小A产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同 时原来的酶切位点却消失：③平末端的连接 8.双脱氧终止法测定DNA序列的片段一般不能太长，如何运用本章所学知识测定较长片 段的DNA序列？ ①将所需要测序的DNA片断采用2种不同的限制性内切酶切制，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接 到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的DNA序列：②用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与 找体连接后，测序，拼接，即可得到全长DN八片断。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行部分 酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的南切片断能覆盖所需测序的DNA片断 9.大肠杆菌DNA聚合酶I,具有3-5外切活性和5-3的聚合酶活性以及5父3的外切活
限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量 的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加 3～4 个碱 基。 3. 试回答影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素？ 外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的 构象。 4. 在酶切缓冲液中，一般需加入 BSA，请问加入 BSA 的作用是什么？并简述其原理？ 作用是提供一定的蛋白质浓度，起保护限制性内切酶的作用。限制性内切酶在稀释液中会迅速变性，BSA 是 一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。 5. 何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？ 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。引起星星活 性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/ml）；③低离子强度（<25mM）；④高 pH (>8.0)； ⑤有机溶剂如 PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺 （dimethylformamide）和 sulphalane 等；⑥用其它二价阳离子 Mn2+、Cu2+、Co2+ 或 Zn2+ 代替 Mg2+ 。 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或 乙醇；③提高离子强度到 100～150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应 pH 至 7.0 ；⑤使用 Mg2+ 作 为二价阳离子。 6. 某 DNA 序列中存在 DpnI 酶切位点，以此 DNA 为模板，在体外合成 DNA 序列，当用 该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？ 生物体内的 DNA 序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化 的限制酶 DpnI 来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割的情况。 7. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段， 引入多克隆位点等。试问在此过程中如何增减酶切位点？ 在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。①将产生的 5' 突出端补平后，再连接以产生新的酶切 位点；②同尾末端的连接，不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同 时原来的酶切位点却消失；③平末端的连接 8. 双脱氧终止法测定 DNA 序列的片段一般不能太长，如何运用本章所学知识测定较长片 段的 DNA 序列？ ①将所需要测序的 DNA 片断采用 2 种不同的限制性内切酶切割，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接 到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的 DNA 序列；②用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与 载体连接后，测序，拼接，即可得到全长 DNA 片断。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行部分 酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的酶切片断能覆盖所需测序的 DNA 片断。 9. 大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ，具有 3'-5’外切活性和 5'-3' 的聚合酶活性以及 5'-3' 的外切活
性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途？ ①利用Ecoli DNA聚合酶的.3外切核酸酶活性，可用切口平移法标记DNA,所有DNA聚合酶中只有 此酶有此反应：②用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性：③对3突出端的DNA作末端标 记（交换或置换反应）. 10.用T4 phage DNA polymerase可进行末端标记，试简述其原理？ T4 phage DNA聚合酶具有3-了外切活性和5-3的聚合酶活性，3-的外切活性可以被5-3的聚合活性 所封闭，首先在反应体系中加入一种NTP,产生3凹端，然后加入经过标记的dNTP,利 用T4 phage DNA聚合酶的聚合活性补平3y凹端，即可得到标记了术端的DNA片断。 1L.BAP和CIAP有何作用？为何一般采用CIAP而不采用BAP? 作用：催化除去DNA或RNA了磷酸。BAP抗性强，抗高温和去污剂。CIAP可用蛋白酶K消化灭活，或 在5 nM EDTA下，65℃处理或75℃处理I0分钟，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的DNA,从而去 除CIAP的活性.相比之下，CIAP比BAP更易去除，因此，一般采用CIAP 12依于DNA的RNA聚合酶句括S6做菌体RNA聚合酶和T4或T门噬菌体RNA聚合 酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？ ①将T7RNA聚合酶基因置于E.colilacUV巧启动子之下，插入到入噬菌体中，感染E.coli,建立稳定的溶 菌，Ecoli BL21(DE3)菌株即为将1aUV5启动子和T7聚合酶基因置于1噬菌体DE3区，该入.噬菌 体DNA整合于染色体的BL21处。若将T噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中。 在PTG诱导下，可启动外颜基因的表达：②先导入带T7噬荫体启动子控制的目的基因的质粒，再用入噬 南体（带T7RNA聚合酶基因）感染E.coli,激活目的基因的表达。 13.简述T4多核苷酸激酶的活性和用途？ T4多核苷酸盖酶的活性催化ATP的Y一磷酸基转移到DNA或RNA的S末端。可表现为两种反应，正反应 指ATP的Y一酸基被转移到去磷酸化的DNA了端，用于对缺乏5”一磷酸的DNA进行磷酸化。在交换反 应中，过量的AP可使该激酶将碳酸化的5瑞磷酸转移给ADP,然后DNA从【y一32P】AP中获得放射 性标记的？一磷酸而重新磷酸化，因此可用于DN的末端标记。用途：该酶主要用于对缺乏了一酶 的DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。通过交换反应，用于标记末端，以供Mxam 一Gct法测序、S】核酸酶分析以及其它须使用末端标记DNA的步骤. 14.限制性内切酶可划分为哪几个类型，各自有何特点？ 生要特性 1型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结物 异源三凝体 同源三取体 异源二聚体 铺助子 ATP Mg2 SAM ATP Ma2 SAM 识别序列 TGAN TGCT 隆转对称序列 GAGCO AACN.GTGO CAGCAG 切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游 随机性切割 特异性切期■ 24-26bp处
性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途? ①利用 E.coli DNA 聚合酶 的 5'-3' 外切核酸酶活性，可用切口平移法标记 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有 此酶有此反应；②用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性；③对 3' 突出端的 DNA 作末端标 记（交换或置换反应）。 10. 用 T4 phage DNA polymerase 可进行末端标记，试简述其原理？ T4 phage DNA 聚合酶具有 3'-5' 外切活性和 5'-3' 的聚合酶活性，3'-5' 的外切活性可以被 5'-3' 的聚合活性 所封闭，首先在反应体系中加入一种 dNTP ，产生 3' 凹 端 ， 然 后 加 入 经 过 标 记 的 dNTP ， 利 用 T4 phage DNA聚合酶的聚合活性补平 3' 凹端，即可得到标记了末端的 DNA 片断。 11. BAP 和 CIAP 有何作用？为何一般采用 CIAP 而不采用 BAP ？ 作用：催化除去 DNA 或 RNA 5' 磷酸。BAP 抗性强，抗高温和去污剂。 CIAP 可用蛋白酶 K 消化灭活，或 在 5mM EDTA 下，65℃ 处理或 75℃ 处理 10 分钟，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的 DNA ，从而去 除 CIAP 的活性。相比之下， CIAP 比 BAP 更易去除，因此，一般采用 CIAP 12. 依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶包括 SP6 噬菌体 RNA 聚合酶和 T4 或 T7 噬菌体 RNA 聚合 酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？ ①将 T7 RNA 聚合酶基因置于 E.coli lacUV5 启动子之下，插入到 λ 噬菌体中，感染 E.coli ，建立稳定的溶 源菌。 E.coli BL21（DE3）菌株即为将 lacUV5 启动子和 T7 聚合酶基因置于 λ 噬菌体 DE3 区，该 λ 噬菌 体 DNA 整合于染色体的 BL21 处。若将 T7 噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中， 在 IPTG 诱导下，可启动外源基因的表达；②先导入带 T7 噬菌体启动子控制的目的基因的质粒，再用 λ 噬 菌体（带 T7 RNA 聚合酶基因）感染 E.coli ，激活目的基因的表达。 13. 简述 T4 多核苷酸激酶的活性和用途？ T4 多核苷酸激酶的活性催化 ATP 的 γ－磷酸基转移到 DNA 或 RNA 的 5' 末端。可表现为两种反应，正反应 指ATP 的 γ－磷酸基被转移到去磷酸化的 DNA 5' 端，用于对缺乏 5'－磷酸的 DNA 进行磷酸化。在交换反 应中，过量的 ATP 可使该激酶将磷酸化的 5' 端磷酸转移给 ADP ，然后 DNA 从【γ－32P】ATP 中获得放射 性标记的 γ－磷酸而重新磷酸化，因此可用于 DNA 的末端标记。用途：该酶主要用于对缺乏 5'－磷酸 的 DNA 或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。通过交换反应，用于标记 5' 末端，以供 Maxam －Gilbert 法测序、 S1 核酸酶分析以及其它须使用末端标记 DNA的步骤。 14. 限制性内切酶可划分为哪几个类型，各自有何特点？