海南大学 第2节RNA的分离 陈银华 海南大学农学院
海南大学 农学院 第2节 RNA的分离 陈银华
基因操作中，涉及到的RNA主要是mRNA >mRNA在细胞中含量最少。 如：一个动物细胞中总RNA为10-5ug,其中mRNA为1-5%。 >mRNA为单链，容易受到内源或外源核酸酶降解 >核酸酶分布广泛、具有很强的稳定性：抗酸抗碱 很广的pH,抗高温严寒0~65℃)，抗变性剂。 >因此，对RNA的操作比DNA的操作严格的多
基因操作中，涉及到的RNA主要是mRNA ➢mRNA在细胞中含量最少。 如：一个动物细胞中总RNA为10-5 ug，其中mRNA为1-5%。 ➢mRNA为单链，容易受到内源或外源核酸酶降解 ➢核酸酶分布广泛、具有很强的稳定性：抗酸抗碱 很广的pH，抗高温严寒(0~65℃)，抗变性剂。 ➢因此，对RNA的操作比DNA的操作严格的多
制备RNA的关键一控制潜在RNase的活性 1、RNase的特点 特异性的降解RNA的3‘端。 在生物体内、体外广泛存在 同时该酶具有抗酸抗碱，很广pH作用范围，抗 高温严寒(0~65℃均具活性)；抗变性剂等特 点，非常稳定
一、制备RNA的关键—控制潜在RNase的活性 1、RNase的特点 特异性的降解RNA的3‘端。 在生物体内、体外广泛存在 同时该酶具有抗酸抗碱，很广pH作用范围，抗 高温严寒（0~65℃均具活性）；抗变性剂等特 点，非常稳定
2、解决办法 >外源RNase 高温，焦磷酸二乙酯（DEPC)处理所有溶液 (Tris.HC除外)和器皿，操作者带手套。 >内源RNase 高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase:抑制剂， 蛋白酶K等
2、解决办法 ➢外源RNase 高温，焦磷酸二乙酯（DEPC）处理所有溶液 （Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套。 ➢内源RNase 高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂， 蛋白酶K等
溶液和用具的去RNA酶处理 耐热的玻璃制品：高温干热灭菌（150度4-6小时) 一次性塑料用品：0.1%DEPC水泡后灭菌 电泳器具：专用、使用前用3%H202浸泡 可能接触到RNA的溶液都需要用DEPC处理的水配制。 在RNA反应中还需要添加RNA酶抑制剂来防止降解
溶液和用具的去RNA酶处理 耐热的玻璃制品：高温干热灭菌（150度4-6小时） 一次性塑料用品：0.1% DEPC 水泡后灭菌 电泳器具：专用、使用前用3% H2O2浸泡 可能接触到RNA的溶液都需要用DEPC处理的水配制。 在RNA反应中还需要添加RNA酶抑制剂来防止降解