第六章大分子的分离和分析 第一节DNA的分离、检测和纯化☆ 第二节RNA的分离、检测和纯化 第三节分子杂交☆ 第四节RNA作图和端点分析 第五节重组DNA分子导入大肠杆菌
第六章 大分子的分离和分析 第一节 DNA的分离、检测和纯化 第二节 RNA的分离、检测和纯化 第三节 分子杂交 第四节 RNA作图和端点分析 第五节 重组DNA分子导入大肠杆菌
第一节DNA的分离、检测和纯化 E.coli质粒DNA的分离和纯化 (一) 质粒DNA的小量提取 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法 依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等 特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高，提 取的质粒DNA可用于酶切，连接与转化
一、E.coli质粒DNA的分离和纯化 （一）质粒DNA的小量提取 第一节 DNA的分离、检测和纯化 ✓ 碱变性法； ✓ 煮沸法； ✓ SDS法； ✓ 羟基磷灰石层析法 ✓ 依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等 特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提 取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化
第一碱变性法提取质粒的基本原理 在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体 DNA变性分开，而共价闭环质粒DNA仍缠绕在一起。 ■将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之 间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污 剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复为可溶状态， 通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋 白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化 质粒DNA
第一 碱变性法提取质粒的基本原理 ▪ 在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体 DNA变性分开，而共价闭环质粒DNA仍缠绕在一起。 ▪ 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之 间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污 剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复为可溶状态， 通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋 白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化 质粒DNA
步骤： 1、离心收集细菌培养物 细菌培养物的生长量：一般选择对数生长期的大肠杆菌细 胞提取质粒。 时间：过夜培养 对于RNA分子调控复制的质粒可采用此期加入氯霉素来提 高质粒的拷贝数
1、离心收集细菌培养物 细菌培养物的生长量：一般选择对数生长期的大肠杆菌细 胞提取质粒. 时间：过夜培养 对于RNA分子调控复制的质粒可采用此期加入氯霉素来提 高质粒的拷贝数. 步 骤:
步骤： 2、沉淀中加100μ用冰预冷的溶液，充分混合（需要剧 烈振荡)。室温下放置10min。 溶液工的作用使细菌培养物质充分悬浮。 组成： 50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCI (pH8.0) 10 mM EDTA ·可成批配制，在高压下蒸气灭菌15min,贮存于4C
2、沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，充分混合（需要剧 烈振荡）。室温下放置10 min。 溶液Ⅰ的作用使细菌培养物质充分悬浮。 组成： 50 mM 葡萄糖 25 mM Tris·HCl（pH8.0） 10 mM EDTA •可成批配制，在高压下蒸气灭菌15 min，贮存于４℃。 步 骤: