亲本，如生长速度快，营养要求低等。4)由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱 变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。 2、单细胞（或单孢子）悬液制备 一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。因为：1)分散状 态的细胞可均匀地接触诱变剂；2)可避免长出不纯的菌落。 若在处理前细胞进行前培养，则变异率可大大提高3、诱变剂及使用剂量的选择 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。 物理诱变剂：如紫外线、X-射线、g一射线、快中子、超声波等化学诱变剂：硫酸 二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)、亚硝酸(NA)、氨芥(NM)、羟胺、ICR类等 紫外线(Uw):最有效的波长是260m左右；作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体 以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡。快中子：中子不直接产生电离，但能使 收中子的物质的原子核射出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成 的 氨芥：氨芥为极易挥发的油状物，它的烟酸盐是白色粉末。 一船使用的是其烟酸盐 亚硝酸：常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。亚硝基胍(TG): 是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变。 剂量： 确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题对一般微生物而 言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而 会使诱变率下降。 处理方法： 单一诱变剂处理复合处理 1)两种或多种诱变剂先后使用 2)同一诱变剂重复处理 3)两种或多种诱变剂同时使用4、诱变处理后的后培养 表型迟延现象：生理性、分离性 初筛：要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要应着眼于尽量扩大挑 选范围。在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、 诱明圈、生长或抑菌的大小来进行初步测定。 复筛：在初筛缩小了的范围中选出产量最高的1-2个菌株，主要着眼于在接近生 产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。 复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进 行定量分析测试。 1)营养缺陷型菌株的筛选2)抗性突变株的筛选 3)温度敏感突变型筛选 TS突变株(temperature-sensitive mutant)在许可温度下能正常生长，其表型 和野生型没有区别：在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不同。 主要由必须基因的突变导致某些基因产物（某种酶）的结构发生改变而引起；
亲本，如生长速度快，营养要求低等。4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱 变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。 2、单细胞（或单孢子）悬液制备 一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。因为：1）分散状 态的细胞可均匀地接触诱变剂；2）可避免长出不纯的菌落。 若在处理前细胞进行前培养，则变异率可大大提高 3、诱变剂及使用剂量的选择 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。 物理诱变剂：如紫外线、X-射线、g-射线、快中子、超声波等 化学诱变剂：硫酸 二乙酯(DES)、亚硝基胍 (NTG)、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR 类等 紫外线(Uv)：最有效的波长是 260nm 左右；作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体 以改变 DNA 生物活性,造成菌体变异甚至死亡。快中子：中子不直接产生电离，但能使 吸收中子的物质的原子核射出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成 的。 氮芥：氮芥为极易挥发的油状物，它的烟酸盐是白色粉末，一般使用的是其烟酸盐。 亚硝酸：常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。亚硝基胍 (NTG)： 是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变。 剂量： 确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题对一般微生物而 言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而 会使诱变率下降。 处理方法： 单一诱变剂处理 复合处理 1）两种或多种诱变剂先后使用 2）同一诱变剂重复处理 3）两种或多种诱变剂同时使用 4、诱变处理后的后培养 表型迟延现象：生理性、分离性 初筛：要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要应着眼于尽量扩大挑 选范围。在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、 透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。 复筛：在初筛缩小了的范围中选出产量最高的 1-2 个菌株，主要着眼于在接近生 产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。 复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进 行定量分析测试。 1）营养缺陷型菌株的筛选 2）抗性突变株的筛选 3）温度敏感突变型筛选 TS 突变株 （temperature-sensitive mutant）在许可温度下能正常生长，其表型 和野生型没有区别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不同。 主要由必须基因的突变导致某些基因产物（某种酶）的结构发生改变而引起；
TS突变株在代谢过程中的各个环节，如核酸合成、蛋白质合成、细胞膜或细胞分 裂过程中，某种酶的合成或功能都由温度所控制； 根据菌落生长情况，可分两大类：①非必需基因突变形成的温度敏感突变株 在许可温度下的基本培养基上生长，非许可温度的基本培养基上不生长而在完全培养 基上生长。是一类突变引起失去单一酶但可以补偿功能的TS突变株。②必需基因突 变引起TS突变株 在许可温度的基本培养基上生长，而非许可温度的基本培养基和完全培养基上都不生 长；在许可与非许可温度下基本培养基和完全培养基上全部生长，则为野生型菌株。 4、抗反馈调节突变株的筛选 通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过抗结构类似物突变的方法筛选出来 的；结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成， 引起反馈调节作用：但不能代替末端产物参与生物合成。抗结物类似物突变株即使在 结构类似物存在下，仍可合成末端产物。 5、组成型突变株的筛选筛选原则： 设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成 型菌株生长优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变株。 例如，可在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组成型菌株处于选择优势 以阝-半乳糖苷酶为例：含有乳糖的培养基中加入抑制物邻硝基-阝-D-岩藻糖苷 阝-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能利用乳糖，故不能生长；而组成型 菌株能合成该酶，利用乳糖生长，使组成型菌株被富集。 通过显色反应可在平板上识别组成型菌株。 三、杂交育种 一)细菌杂交育种转导、转化、接合二)放线菌杂交育种放线菌和细菌一样属于原核 微生物，但却象霉菌那样以菌丝形态生长，且形成分生孢子，所以就本质来说，放线 菌的基因重组过程近似于细菌，但就育种方法来说，却有许多与霉菌相似的方面。1、 放线菌杂交原理放线菌杂交在原理上基本类似于大肠杆菌，通过供体向受体转移部分 染色体，经过遗传物质交换，最终达到基因重组。 部分放线菌在杂交过程中会形成异核体，但这种异核体与霉菌异核体不同，在复 制过程中染色体不发生交换；在基本培养基上表现为形成的菌落都是原养型，当它们 产生的分生孢子进一步培养时，形成的菌落却都属于两亲本类型。 另一部分放线菌杂交过程不形成异核体，真正类似于大肠杆菌杂交，两个不同基 因型的菌株通过接合，细胞间沟通，供体菌株的部分染色体转移到受体菌细胞中，染 色体发生交换，最后达到重组，获得各种重组体。在放线菌杂交重组过程中，异核体 的作用不大。只有经部分染色体转移途径形成的部分结合子，才是亲本间遗传信息传 递和基因重组的关键
TS 突变株在代谢过程中的各个环节，如核酸合成、蛋白质合成、细胞膜或细胞分 裂过程中，某种酶的合成或功能都由温度所控制； 根据菌落生长情况，可分两大类：① 非必需基因突变形成的温度敏感突变株 在许可温度下的基本培养基上生长，非许可温度的基本培养基上不生长而在完全培养 基上生长。是一类突变引起失去单一酶但可以补偿功能的 TS 突变株。② 必需基因突 变引起 TS 突变株 在许可温度的基本培养基上生长，而非许可温度的基本培养基和完全培养基上都不生 长；在许可与非许可温度下基本培养基和完全培养基上全部生长，则为野生型菌株。 4、抗反馈调节突变株的筛选 通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过抗结构类似物突变的方法筛选出来 的；结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成， 引起反馈调节作用；但不能代替末端产物参与生物合成。抗结构类似物突变株即使在 结构类似物存在下，仍可合成末端产物。 5、组成型突变株的筛选筛选原则： 设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成 型菌株生长优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变株。 例如，可在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组成型菌株处于选择优势 以 -半乳糖苷酶为例：含有乳糖的培养基中加入抑制物邻硝基--D-岩藻糖苷——→ -半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能利用乳糖，故不能生长；而组成型 菌株能合成该酶，利用乳糖生长，使组成型菌株被富集。 通过显色反应可在平板上识别组成型菌株。 三、杂交育种 一）细菌杂交育种转导、转化、接合 二）放线菌杂交育种放线菌和细菌一样属于原核 微生物，但却象霉菌那样以菌丝形态生长，且形成分生孢子，所以就本质来说，放线 菌的基因重组过程近似于细菌，但就育种方法来说，却有许多与霉菌相似的方面。1、 放线菌杂交原理放线菌杂交在原理上基本类似于大肠杆菌，通过供体向受体转移部分 染色体，经过遗传物质交换，最终达到基因重组。 部分放线菌在杂交过程中会形成异核体，但这种异核体与霉菌异核体不同，在复 制过程中染色体不发生交换；在基本培养基上表现为形成的菌落都是原养型，当它们 产生的分生孢子进一步培养时，形成的菌落却都属于两亲本类型。 另一部分放线菌杂交过程不形成异核体，真正类似于大肠杆菌杂交，两个不同基 因型的菌株通过接合，细胞间沟通，供体菌株的部分染色体转移到受体菌细胞中，染 色体发生交换，最后达到重组，获得各种重组体。在放线菌杂交重组过程中，异核体 的作用不大。只有经部分染色体转移途径形成的部分结合子，才是亲本间遗传信息传 递和基因重组的关键
放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。放线菌中也存在类似于大肠杆 菌F因子的质粒，如天蓝色链霉菌中的SCP1因子。当菌丝内存在SCP1因子时才能使 两亲本菌丝之间发生接合，把供体菌株的部分染色体转移到受体菌中。 2、放线菌杂交过程 1)接合 由两个基因型不同的直接亲本菌丝体混合培养，体细胞间接触和融合，使两个遗 传类型不一致的细胞核，在双方细胞增殖过程中部分染色体进行转移和遗传信息交换， 部分结合子是由一个供体细胞的部分染色体和一个受体细朐整镜染色体相结合， 同时存在于一个细胞中。也有时两个亲本细胞的染色体都是以部分染色体进行结合。 2)杂合系heteroc lone)和重组体杂合系 部分结合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进行一次交换 产生了杂合系；交换后的染色体不是封闭的环状结构而是呈线状，且在染色体末端具 有串联的重复体。这种重复结构，有的成为一个二体区，有的是两个二体区。在复制 过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，由于位置不同而成为杂合状态，产生 了各种不同基因型的重组杂合系。 杂合系是由基内菌丝长出的，形成的菌落很小，能在选择培养基和基本培养基生 长。由杂合系上产生的分生孢子绝大多数都是属于双亲本分离子，重组体的数量极少。 3)垂组休 杂合系或重组杂合系，在以后进一步繁殖过程中，杂合状态染色体的不同区段还 要进行几次交换。根据交换的位置不同，所携带的基因种类、数量也不一致，形成了 一系列基因型的环状染色体细胞，从产生的菌落中可检出不同类型重组分离子。杂合 系是形成重组体所必须的阶段。 3、放线菌杂交技术 1)混合培养法 2)玻璃纸法 三)酵母菌杂交育种四)霉菌杂交育种有性杂交（如根霉）准性杂交（如构巢曲霉 青霉等) 杂交方法：混合培养法、斜面衔接法、有限液体静止培养法、有限固体平板培养 四、原生质体融合育种 一)原生质体融合的概念 就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在 高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG)作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合 接着两亲本基因组有接触到交换，从而实现遗传重组。 二)原生质体融合育种的优点 1、大幅度提高亲本之间重组频率。原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交 换的主要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的诱导作用，重组频率显著
放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。放线菌中也存在类似于大肠杆 菌 F 因子的质粒，如天蓝色链霉菌中的 SCP1 因子。当菌丝内存在 SCP1 因子时才能使 两亲本菌丝之间发生接合，把供体菌株的部分染色体转移到受体菌中。 2、放线菌杂交过程 1）接合 由两个基因型不同的直接亲本菌丝体混合培养，体细胞间接触和融合，使两个遗 传类型不一致的细胞核，在双方细胞增殖过程中部分染色体进行转移和遗传信息交换。 部分结合子是由一个供体细胞的部分染色体和一个受体细胞整套染色体相结合， 同时存在于一个细胞中。也有时两个亲本细胞的染色体都是以部分染色体进行结合。 2) 杂合系(heteroclone)和重组体杂合系 部分结合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进行一次交换， 产生了杂合系；交换后的染色体不是封闭的环状结构而是呈线状，且在染色体末端具 有串联的重复体。这种重复结构，有的成为一个二体区，有的是两个二体区。在复制 过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，由于位置不同而成为杂合状态，产生 了各种不同基因型的重组杂合系。 杂合系是由基内菌丝长出的，形成的菌落很小，能在选择培养基和基本培养基生 长。由杂合系上产生的分生孢子绝大多数都是属于双亲本分离子，重组体的数量极少。 3) 重组体 杂合系或重组杂合系，在以后进一步繁殖过程中，杂合状态染色体的不同区段还 要进行几次交换。根据交换的位置不同，所携带的基因种类、数量也不一致，形成了 一系列基因型的环状染色体细胞，从产生的菌落中可检出不同类型重组分离子。杂合 系是形成重组体所必须的阶段。 3、放线菌杂交技术 1）混合培养法 2）玻璃纸法 三）酵母菌杂交育种四）霉菌杂交育种有性杂交 (如根霉)准性杂交 (如构巢曲霉、 青霉等) 杂交方法：混合培养法、斜面衔接法、有限液体静止培养法、有限固体平板培养 法 四、原生质体融合育种 一）原生质体融合的概念 就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在 高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合， 接着两亲本基因组有接触到交换，从而实现遗传重组。 二）原生质体融合育种的优点 1、大幅度提高亲本之间重组频率。原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交 换的主要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的诱导作用，重组频率显著
提高。2、扩大重组的亲本范围。如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达20%。去除了细 胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。 3、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集 中双亲优良性状机会更大。 4、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良形状通过原生质体融合 再组合到一个单株中。 三)一般步骤 直接亲本及其遗传标记选择 双亲本原生质体制备与再生 亲本原生质体诱导融合 融合重组体（融合子）分离 遗传特性分析与测定 (一)直接亲本及其遗传标记的选择 优良性状；所用的亲株均要有一定的遗传标记，以便于选择； 一般以营养缺陷型和抗药性等为标记 (二)原生质体的制备与再生 多用酶解法 细菌、放线菌 溶南醢 酵母菌 蜗牛酶 露菊 纤维素酶等 影响原生质体制备的因素：1、菌体的预处理 EDTA(乙二胺四乙酸)、甘氨酸、青 霜麦、D-环丝氨酸笔 2、菌体的培养时间 一般选择对数期后期的菌体进行酶处理 3、酶浓度 一般来说，酶浓度增加，原生质体的形成率增大；超过一定范围，则原生质体形成率 提高不明显；酶浓度过高，往往导致原生质体再生率降低 建议以使原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度作为最适酶浓度。 4、酶解温度 温度对酶解作用有双重影响； -般2040℃ 5、酶解时间6、渗透压稳定剂 (三)亲本原生质体融合（和再生）促融剂：常用聚乙二醇(polyethyleneglycol:PEG) 4000和6000；PEG可使原生质体的膜电位下降，然后原生质体通过Ca2+交换而促进 凝集；PEG渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质体膜表面的蛋白质和脂质的排列， 提高了脂质胶粒的流动性，从而促进了原生质体的相互融合。 电场诱导也可促进原生质体融合（四）融合子的检出 在选择培养基上检出；如利用营养缺陷型为遗传标记，可在基本培养基上筛选。 原生质体融合后会产生两种情况 一是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体； 二是暂时的融合，形成异核体
提高。2、扩大重组的亲本范围。如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达 20%。去除了细 胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。 3、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集 中双亲优良性状机会更大。 4、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良形状通过原生质体融合 再组合到一个单株中。 三）一般步骤 直接亲本及其遗传标记选择 双亲本原生质体制备与再生 亲本原生质体诱导融合 融合重组体（融合子）分离 遗传特性分析与测定 （一）直接亲本及其遗传标记的选择 优良性状；所用的亲株均要有一定的遗传标记，以便于选择； 一般以营养缺陷型和抗药性等为标记 （二）原生质体的制备与再生 多用酶解法 细菌、放线菌 溶菌酶 酵母菌 蜗牛酶 霉菌 纤维素酶等 影响原生质体制备的因素：1、菌体的预处理 EDTA（乙二胺四乙酸）、甘氨酸、青 霉素、D-环丝氨酸等 2、菌体的培养时间 一般选择对数期后期的菌体进行酶处理 3、酶浓度 一般来说，酶浓度增加，原生质体的形成率增大；超过一定范围，则原生质体形成率 提高不明显；酶浓度过高，往往导致原生质体再生率降低 建议以使原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度作为最适酶浓度。 4、酶解温度 温度对酶解作用有双重影响； 一般 20～40℃ 5、酶解时间 6、渗透压稳定剂 （三）亲本原生质体融合（和再生）促融剂：常用 聚乙二醇 (polyethyleneglycol; PEG) 4000 和 6000；PEG 可使原生质体的膜电位下降，然后原生质体通过 Ca2+交换而促进 凝集；PEG 渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质体膜表面的蛋白质和脂质的排列， 提高了脂质胶粒的流动性，从而促进了原生质体的相互融合。 电场诱导也可促进原生质体融合（四）融合子的检出 在选择培养基上检出；如利用营养缺陷型为遗传标记，可在基本培养基上筛选。 原生质体融合后会产生两种情况 一是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体； 二是暂时的融合，形成异核体
两者均可在选择培养基上生长， 一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类 型，有的甚至可以异核状态移接几代。因此要获得真正的融合子，必须在融合体再生 后，进行几次自然分离选择，才能确定 四)原生质体融合技术在微生物育种中的应用 已得到较好的应用，例如：生二素链霉菌 提高了螺旋審素产量；酿酒酵母（可 利用葡萄糖生产酒精，但不能利用淀粉和糊精)糖化酵母能利用淀粉和糊精，但产酒 精能力很差二者融合，获得了可利用淀粉和糊精生产酒精的融合子。 五)灭活原生质体融合技术灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以 及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂来处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失 去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。 灭活条件应适当温和一些，以保持细胞DNA的遗传功能和重组能力。 四、基因工程育种（此处略，详见第十一章）
两者均可在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类 型，有的甚至可以异核状态移接几代。因此要获得真正的融合子，必须在融合体再生 后，进行几次自然分离选择，才能确定。 四）原生质体融合技术在微生物育种中的应用 已得到较好的应用，例如：生二素链霉菌 提高了螺旋霉素产量；酿酒酵母（可 利用葡萄糖生产酒精，但不能利用淀粉和糊精）糖化酵母能利用淀粉和糊精，但产酒 精能力很差二者融合，获得了可利用淀粉和糊精生产酒精的融合子。 五）灭活原生质体融合技术灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以 及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂来处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失 去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。 灭活条件应适当温和一些，以保持细胞 DNA 的遗传功能和重组能力。 四、基因工程育种 （此处略，详见第十一章）