抗原与动物免疫 (3)免疫方法:体内免疫法和体外免疫法 °体内免疫法:适用于免疫原性强、抗原量较多时应用, 般用8~12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原(如细菌、细胞 抗原)的免疫原性强,可不加佐剂,直接注入腹腔10 个细胞进行初次免疫,间隔1~3周,再追加免疫1~2次, 可溶性抗原则按每只小鼠10~100μg抗原与福氏完全佐剂 等量混合后注入腹腔内,进行初次免疫,间隔24周, 再用不加佐剂的原抗原追加免疫1~2次。一般在采集脾 细胞前3日由静脉注射最后一次抗原,其目的是使对应 的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的刺激,使其迅 速地增殖分裂,因为细胞融合后增殖最好的细胞是迅速 分裂的细胞。有人认为在常规免疫的基础上用脾内免疫 法做追加免疫较佳
一、抗原与动物免疫 • （3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法 • 体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用， 一般用8~12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌、细胞 抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107 个细胞进行初次免疫，间隔1~3周，再追加免疫1~2次， 可溶性抗原则按每只小鼠10~100g抗原与福氏完全佐剂 等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2~4周， 再用不加佐剂的原抗原追加免疫1~2次。一般在采集脾 细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，其目的是使对应 的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅 速地增殖分裂，因为细胞融合后增殖最好的细胞是迅速 分裂的细胞。有人认为在常规免疫的基础上用脾内免疫 法做追加免疫较佳
抗原与动物免疫 (3)免疫方法:体内免疫法和体外免疫法 体外免疫法:用于不能采用体内免疫法的情况下 如制备人源性单克隆抗体,或者抗原的免疫原性 极弱且能引起免疫抑制时使用 体外免疫法所需要的抗原量少,一般只需几个μg, 免疫期短,仅4~5天,干扰因素少,已成功制备 出针对多种抗原的单克隆抗体,但融合后产生的 杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用4~8周 龄BALB/小鼠的脾脏制成单个细胞悬液,再加 入适当抗原使其浓度达0.5~5μg/ml,在5%CO 37℃下培养4~5天,再分离脾脏细胞,进行细胞 融
一、抗原与动物免疫 • （3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法 • 体外免疫法：用于不能采用体内免疫法的情况下， 如制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原性 极弱且能引起免疫抑制时使用。 • 体外免疫法所需要的抗原量少，一般只需几个g， 免疫期短，仅4~5天，干扰因素少，已成功制备 出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的 杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用4~8周 龄BALB/c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液，再加 入适当抗原使其浓度达0.5~5 g/ml，在5%CO2、 37℃下培养4~5天，再分离脾脏细胞，进行细胞 融合
细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 (1)细胞融合基本方法:取适量脾细胞(1×108)与 骨髓瘤细胞(2×107~3×107)进行混合,在聚乙二醇 (PEG)作用下诱导它们融合,时间控制在2mn以内 然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释 (2)用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件:融合率高 自身不分泌抗体,所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力 强且长期稳定等特点。书中表4-1列举了主要的骨髓瘤 细胞系,其中SP2/0、P3.653细胞本身不分泌抗体,细胞 融合后产生的杂交瘤细胞只分泌均一的、完全来自脾细 胞的抗体分子,它们是目前较为理想的可供融合的骨髓 瘤细胞。特别是SP2/0细胞系还具有容易培养、融合率 高等特点,被国内外多个实验室广泛采用
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 • （1）细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1×108）与 骨髓瘤细胞（2 ×107 ~3×107）进行混合，在聚乙二醇 （PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内， 然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。 • （2）用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件：融合率高， 自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力 强且长期稳定等特点。书中表4-1列举了主要的骨髓瘤 细胞系，其中SP2/0、P3.653细胞本身不分泌抗体，细胞 融合后产生的杂交瘤细胞只分泌均一的、完全来自脾细 胞的抗体分子，它们是目前较为理想的可供融合的骨髓 瘤细胞。特别是SP2/0细胞系还具有容易培养、融合率 高等特点，被国内外多个实验室广泛采用
细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 (3)诱导剂PEG的影响:PEG分子量以及浓度 越大,促融率越高。但其粘度和对细胞的毒性也 随之增大。目前常用的PEG的浓度为40%~50%, 相对分子质量以4000为佳。但相对分子量 400~6000,浓度在10%50%范围之间的PEG都能 使细胞融合。为了提高融合率,在PEG溶液中加 入二甲基亚砜DMSO),以提高细胞接触的紧 密性,增加融合率。但是,PEG和DMSO都对细 胞有毒性,必须严格限制它们和细胞的接触时间 可通过低速离心5min使细胞接触更为紧密,然后 用新配制的培养液来稀释药物并洗涤细胞
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 • （3）诱导剂PEG的影响：PEG分子量以及浓度 越大，促融率越高。但其粘度和对细胞的毒性也 随之增大。目前常用的PEG的浓度为40%~50%， 相对分子质量以4000为佳。但相对分子量 400~6000，浓度在10%~50%范围之间的PEG都能 使细胞融合。为了提高融合率，在PEG溶液中加 入二甲基亚砜(DMSO），以提高细胞接触的紧 密性，增加融合率。但是，PEG和DMSO都对细 胞有毒性，必须严格限制它们和细胞的接触时间， 可通过低速离心5min使细胞接触更为紧密，然后 用新配制的培养液来稀释药物并洗涤细胞
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 ·(4)培养基的正确选择:常用的选择培养基为 HAT培养基,它是次黄嘌呤(H)、氨基喋呤 (A)和胸腺嘧啶(T)配制的。其中氨基喋呤 (A)能阻断DNA合成的主要途径,瘤-瘤融合 细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融 合细胞和瘤细胞在这样的条件下,几天内亦迅 速死亡。由于SP2/0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤 (H)鸟嘌呤磷酸核糖转移酧( HGPRT)缺乏株, 脾细胞中却有这种酶,因此脾-瘤融合的杂交瘤 细胞可利用 HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸 腺嘧啶(T)合成DNA,使杂交瘤细胞得以生长
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 • （4）培养基的正确选择：常用的选择培养基为 HAT培养基，它是次黄嘌呤（H）、氨基喋呤 （A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤 （A）能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合 细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融 合细胞和瘤细胞在这样的条件下，几天内亦迅 速死亡。由于SP2/0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤 （H）鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT）缺乏株， 脾细胞中却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤 细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌呤（H）和胸 腺嘧啶（T）合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长