第十四章 固定化细胞发酵 Fermentation with immobilized cells 第一节 概述 一、定义 固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限 制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。 是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。 二、固定化细胞的优点 1，与游离细胞相比 与游离细胞发酵相比，固定化细胞发酵具有以下优点： （1）固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应 （2）可以获得更高的细胞浓度； （3）细胞可以重复使用； （4）在高稀释率时，不会产生洗脱现象； （5）单位容积的产率高； （6）提高遗传稳定性； （7）细胞不会受到剪切效应的影响。 （8）发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。 2，与固定化酶相比 与固定化酶相比，固定化细胞具有以下优点： （1）免去了破碎细胞提取酶的手续 （2）酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失少 （3）固定化细胞制备的成本比固定化酶低 （4）无需辅酶再生 三、固定化细胞的缺点 虽然固定化细胞具有上述许多优点，但也有不足之处，具体表现在： 1，仅能利用胞内酶； 2，细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用； 3，载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性；
第十四章 固定化细胞发酵 Fermentation with immobilized cells 第一节 概述 一、定义 固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限 制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。 是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。 二、固定化细胞的优点 1，与游离细胞相比 与游离细胞发酵相比，固定化细胞发酵具有以下优点： （1）固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应 （2）可以获得更高的细胞浓度； （3）细胞可以重复使用； （4）在高稀释率时，不会产生洗脱现象； （5）单位容积的产率高； （6）提高遗传稳定性； （7）细胞不会受到剪切效应的影响。 （8）发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。 2，与固定化酶相比 与固定化酶相比，固定化细胞具有以下优点： （1）免去了破碎细胞提取酶的手续 （2）酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失少 （3）固定化细胞制备的成本比固定化酶低 （4）无需辅酶再生 三、固定化细胞的缺点 虽然固定化细胞具有上述许多优点，但也有不足之处，具体表现在： 1，仅能利用胞内酶； 2，细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用； 3，载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性；
4，可能有副反应。 四、固定化细胞的分类 1，按固定的细胞类型不同分为三类： （1）微生物； （2）动物； （3）植物。 2，按细胞的生理状态不同分为两大类： （1）死细胞：包括完整细胞、细胞碎片、细胞器。适用于一种酶催化的反应。 （2）活细胞：包括增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞。适用于多酶反应，特别是 需要辅酶的反应。 第二节 细胞固定化的方法 细胞固定化方法有：Adsorption（吸附）；covalent bonding（共价结合）； Cross linking（交联）；Entrapment（包埋）、Encapsulation（微胶囊） 。下面对这几 种做具体介绍。 一、吸附法 1，原理 利用载体和细胞表面所带电荷的静电引力（van der Walls forces），使细胞吸附 于载体上。吸附法可分为物理吸附和离子吸附两种。该法操作简单，固定化过程对 细胞活性影响小。 2，载体的材料 采用吸附法固定细胞，所用的载体主要有：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、 多孔陶瓷、离子交换树脂和等。塑料 3，影响吸附固定化的因素 （1）Z-电位 （2）细胞的性质和细胞壁的组成 （3）载体的性质 （4）pH 二、共价结合法 利用细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）与活化的无
4，可能有副反应。 四、固定化细胞的分类 1，按固定的细胞类型不同分为三类： （1）微生物； （2）动物； （3）植物。 2，按细胞的生理状态不同分为两大类： （1）死细胞：包括完整细胞、细胞碎片、细胞器。适用于一种酶催化的反应。 （2）活细胞：包括增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞。适用于多酶反应，特别是 需要辅酶的反应。 第二节 细胞固定化的方法 细胞固定化方法有：Adsorption（吸附）；covalent bonding（共价结合）； Cross linking（交联）；Entrapment（包埋）、Encapsulation（微胶囊） 。下面对这几 种做具体介绍。 一、吸附法 1，原理 利用载体和细胞表面所带电荷的静电引力（van der Walls forces），使细胞吸附 于载体上。吸附法可分为物理吸附和离子吸附两种。该法操作简单，固定化过程对 细胞活性影响小。 2，载体的材料 采用吸附法固定细胞，所用的载体主要有：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、 多孔陶瓷、离子交换树脂和等。塑料 3，影响吸附固定化的因素 （1）Z-电位 （2）细胞的性质和细胞壁的组成 （3）载体的性质 （4）pH 二、共价结合法 利用细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）与活化的无
机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。用该法制备的固定化细胞一般为死细 胞。 三、交联法 利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、 咪唑基）反应，从而使细胞固定。常用的交联剂包括：戊二醛、甲苯二异氰酸酯、 双重氮联苯胺。 由于交联试剂的毒性，这一方法具有一定的局限性。 四、包埋法 包埋法是细胞固定化最常用的方法。包埋法可以分为： 1，微胶囊法：利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊； 2，凝胶包埋法：是在无菌条件下，将生物细胞和胶溶液混合在一起，然后再经 过相应的造粒处理，形成直径为 1-4mm 的胶粒。 常用的包埋剂为：聚丙烯酰胺、琼脂、海藻酸、卡拉胶、二醋酸纤维、三醋酸 纤维、明胶等。 五、固定化方法的比较 吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。 共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。 交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。 包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方 法只适用于小分子底物。 第三节固定化细胞的形状及性质 一、形状 固定化细胞由于其用途和制备方法不同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状 或不规则状等。但目前大多数制备成颗粒状珠体。 二、性质 1，最适 pH 细胞经固定化后，其最适 pH 因固定化方法不同而有一些调整。如，用聚丙烯 酰胺包埋的大肠杆菌中的天门冬氨酸酶和产氨短杆菌中的延胡索酸酶的最适 pH 向
机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。用该法制备的固定化细胞一般为死细 胞。 三、交联法 利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、 咪唑基）反应，从而使细胞固定。常用的交联剂包括：戊二醛、甲苯二异氰酸酯、 双重氮联苯胺。 由于交联试剂的毒性，这一方法具有一定的局限性。 四、包埋法 包埋法是细胞固定化最常用的方法。包埋法可以分为： 1，微胶囊法：利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊； 2，凝胶包埋法：是在无菌条件下，将生物细胞和胶溶液混合在一起，然后再经 过相应的造粒处理，形成直径为 1-4mm 的胶粒。 常用的包埋剂为：聚丙烯酰胺、琼脂、海藻酸、卡拉胶、二醋酸纤维、三醋酸 纤维、明胶等。 五、固定化方法的比较 吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。 共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。 交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。 包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方 法只适用于小分子底物。 第三节固定化细胞的形状及性质 一、形状 固定化细胞由于其用途和制备方法不同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状 或不规则状等。但目前大多数制备成颗粒状珠体。 二、性质 1，最适 pH 细胞经固定化后，其最适 pH 因固定化方法不同而有一些调整。如，用聚丙烯 酰胺包埋的大肠杆菌中的天门冬氨酸酶和产氨短杆菌中的延胡索酸酶的最适 pH 向
酸性范围偏移。但用同一方法包埋的大肠杆菌中的青霉素酰胺酶的最适 pH 则没有 变动。 2，温度 类似与 pH，细胞固定化方法不同，也有可能导致最适温度产生不同的变化。 3，稳定性 一般而言，细胞经固定化后，其稳定性会有所提高。 第四节 固定化细胞反应器 一、固定化细胞反应器的优点 A higher cell concentration in the immobilised bioreactor prevents the microbial population from completely washing out. 固定化细胞反应器具有以下优点： 1，在固定化细胞反应器中采用高稀释率有以下优点： 2，生产强度、转化率高； 3，与衡化器相比，固定化细胞反应器具有更好的稳定性； 4，节省投资和能耗。 二、固定化细胞反应器的类型
酸性范围偏移。但用同一方法包埋的大肠杆菌中的青霉素酰胺酶的最适 pH 则没有 变动。 2，温度 类似与 pH，细胞固定化方法不同，也有可能导致最适温度产生不同的变化。 3，稳定性 一般而言，细胞经固定化后，其稳定性会有所提高。 第四节 固定化细胞反应器 一、固定化细胞反应器的优点 A higher cell concentration in the immobilised bioreactor prevents the microbial population from completely washing out. 固定化细胞反应器具有以下优点： 1，在固定化细胞反应器中采用高稀释率有以下优点： 2，生产强度、转化率高； 3，与衡化器相比，固定化细胞反应器具有更好的稳定性； 4，节省投资和能耗。 二、固定化细胞反应器的类型
固定化细胞反应器包括以下几种类型：细胞再循环系统（Cell recycle systems ）、 固定床反应器（Fixed bed reactors ）、流化床反应器（Fluidized bed reactors ）、絮凝 细胞系统（Flocculated cell systems ）。 1、细胞再循环系统（Cell recycle systems ） In a fermenter with cell recycle the cells are separated from the effluent and then recycled back to the fermenter; thus minimising cell removal from the fermenter Cell recycle system Cell recycle is used in activated sludge systems. A portion of the cells are separated in a settling tank and returned to the activated sludge fermenter. Biomass recycling for product or biomass production is more difficult due to the need for maintaining sterility during cell separation. Centrifugation which is a faster process than settling would be used to separate the cells. Biomass recycle systems can be easily modelled. 2、固定床反应器（Fixed bed reactors ） In fixed bed fermenters, the cells are immobilized by absorption on or entrapment in solid, non-moving solid surfaces. In one type of fixed bed fermenter, the cells are immobilized on the surfaces of immobile solid particles such as plastic blocks, concrete blocks, wood shavings or fibrous material such as plastic or glass wool
固定化细胞反应器包括以下几种类型：细胞再循环系统（Cell recycle systems ）、 固定床反应器（Fixed bed reactors ）、流化床反应器（Fluidized bed reactors ）、絮凝 细胞系统（Flocculated cell systems ）。 1、细胞再循环系统（Cell recycle systems ） In a fermenter with cell recycle the cells are separated from the effluent and then recycled back to the fermenter; thus minimising cell removal from the fermenter Cell recycle system Cell recycle is used in activated sludge systems. A portion of the cells are separated in a settling tank and returned to the activated sludge fermenter. Biomass recycling for product or biomass production is more difficult due to the need for maintaining sterility during cell separation. Centrifugation which is a faster process than settling would be used to separate the cells. Biomass recycle systems can be easily modelled. 2、固定床反应器（Fixed bed reactors ） In fixed bed fermenters, the cells are immobilized by absorption on or entrapment in solid, non-moving solid surfaces. In one type of fixed bed fermenter, the cells are immobilized on the surfaces of immobile solid particles such as plastic blocks, concrete blocks, wood shavings or fibrous material such as plastic or glass wool