第4卷第5期 南方水产 Vol 4. No 5 2008年10月 South china fisheries science Oct,2008 恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究 黄鸿兵',吴光红,张静波2,陈颐 (1.江苏省淡水水产研究所,江苏南京210017;2.南京农业大学农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室 江苏南京210095;3.盐城市产品质量监督检验所,江苏盐城224005) 摘要:为探索养殖过程中恩诺沙星( Enofloxac in,NR)施用于中华绒螯蟹( Eriocheir siⅳnsis)中的药效情况 文章通过静置平衡透析法分析研究了恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆的蛋白结合率。试验测得的中华绒螯蟹血浆蛋 白浓度为63.95.29 mgmL,蛋白分子量主要集中在66.2~971MDa之间,恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋 白的结合率在47.39%~82.58%之间。分析结果认为,恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆50%以上的蛋白结合率,在 中华绒螯蟹养殖生产过程中需要慎重考虑恩诺沙星的有效药物浓度及其与其它药物的竞争作用,以能充分发挥 恩诺沙星的作用。 关键词:恩诺沙星;中华绒螯蟹;血浆;蛋白结合率 中图分类号:S948 文献标识码:A 文章编号:1673-227(2008)05-0023-05 Study on bindig ca pac ity of Enrofloxacin( ENR)with blood phsma prote in of Chiese m itten-handed crab, Eriocheir sinensis HUANG Hongbing, wU Guanghong, ZHANG J ingt Reseach Institu te of iangs and Anin al Products Processing and Quality Control M inistry of A griculture Nanjing Agricultural Uniersity Nanjing 210095, China, 3. Yancheng Institute of Supervision Testing on Product Quality, Yancheng 224005, China) Abstract: The bind ing capacity of the drug enofbxac in with the p lama potein of Chinese m itten-handed crab, Eriocheir sinensis dur ing feeding was investigated. The method of fixed equilibrium dialysis test was app lied b the study on the bind ing of enoflxac in with the crab blod plasma potein. Concentraton of the p lasma poteins in Chinese m itten -handed crab was 63. 95 +0. 29 mgmL".Mo- lecular weight of these p oteins were mainly beween 66 2-97. 1 kDa. Protein binding level of enofloxac in and crab p lama proteins was 47. 39%-82 58%, show ing thatmore than 50% of the drug could be bound to the prteins. Thus, it could be concluded that en- oflxacin can bind with p lasma poteins tightly. So, in case of using enofbxac n abne or with other med icine, its effective concentra- tion and competiton beteen drugs shoul be considered in Chinese m itten-handed crab culture. Key words: Enrofbxac in, Chinese m itten-handed crab, Erioche ir sinensis, plasma, protein bind ng 大多数药物在体内的药理作用是药物与特异受浆蛋白结合,按其与血浆蛋白结合与否分为结合型 体作用的结果。药物吸收入血后会不同程度地与血和游离型。这是一个迅速、可逆的过程,很快达到 收稿日期:200842-22;修回日期:200807-29 资助项目:江苏省省级海洋渔业开发项目(2007);江苏省水产三项工程项目(P20051) 作者简介:黄鸿兵(1979-),男,研究实习员,从事水产品加工与质量安全研究, Email nan jingrice@ a yahoo.cm. 通讯作者:吴光红, Email wuguang@ inline.cm 201994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.aLlrightsreservedhttp://www.cnki.net
第 4卷第 5期 2 0 0 8年 1 0月 南 方 水 产 South China Fisheries Science Vol14, No15 Oct1, 2008 收稿日期 : 2008202222; 修回日期 : 2008207229 资助项目 : 江苏省省级海洋渔业开发项目 (2007) ; 江苏省水产三项工程项目 ( PJ2005251) 作者简介 : 黄鸿兵 (1979 - ) , 男 , 研究实习员 , 从事水产品加工与质量安全研究 , E2mail: nanjingrice@yahoo1com1cn 通讯作者 : 吴光红 , E2mail: wuguangh@ jlonline1com 恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究 黄鸿兵 1 , 吴光红 1 , 张静波 2 , 陈 颐 3 (11江苏省淡水水产研究所 , 江苏 南京 210017; 21南京农业大学农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室 , 江苏 南京 210095; 31盐城市产品质量监督检验所 , 江苏 盐城 224005) 摘要 : 为探索养殖过程中恩诺沙星 ( Enrofloxacin, ENR) 施用于中华绒螯蟹 ( Eriocheir sinensis) 中的药效情况 , 文章通过静置平衡透析法分析研究了恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆的蛋白结合率。试验测得的中华绒螯蟹血浆蛋 白浓度为 63195 ±0129 mg·mL - 1 , 蛋白分子量主要集中在 6612～9711 kDa之间 , 恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋 白的结合率在 47139% ～82158%之间。分析结果认为 , 恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆 50%以上的蛋白结合率 , 在 中华绒螯蟹养殖生产过程中需要慎重考虑恩诺沙星的有效药物浓度及其与其它药物的竞争作用 , 以能充分发挥 恩诺沙星的作用。 关键词 : 恩诺沙星 ; 中华绒螯蟹 ; 血浆 ; 蛋白结合率 中图分类号 : S948 文献标识码 : A 文章编号 : 1673 - 2227 - (2008) 05 - 0023 - 05 Study on binding capac ity of Enrofloxac in ( ENR) with blood plasma prote in of Chinese m itten2handed crab, Eriocheir sinensis HUANG Hongbing 1 , WU Guanghong 1 , ZHANG Jingbo 2 , CHEN Yi 3 (11 Freshwater Fisheries Research Institute of J iangsu Province, N anjing 210017, China; 21 Key Lab1 of Agriculture and Anim al Products Processing and Quality Control, M inistry of Agriculture, N anjing Agricultural University, N anjing 210095, China; 31 Yancheng Institute of Supervision & Testing on Product Quality, Yancheng 224005, China) Abstract: The binding capacity of the drug enrofloxacin with the p lasma p rotein of Chinese m itten2handed crab, Eriocheir sinensis dur2 ing feeding was investigated1 The method of fixed equilibrium dialysis test was app lied to the study on the binding of enrofloxacin with the crab blood p lasma p rotein1 Concentration of the p lasma p roteins in Chinese mitten2handed crab was 63195 ±0129 mg·mL - 1 1 Mo2 lecular weight of these p roteins were mainly between 6612～9711 kDa1 Protein binding level of enrofloxacin and crab p lasma p roteins was 47139% ～82158% , showing thatmore than 50% of the drug could be bound to the p roteins1 Thus, it could be concluded that en2 rofloxacin can bind with p lasma p roteins tightly1 So, in case of using enrofloxacin alone orwith othermedicine, its effective concentra2 tion and competition between drugs should be considered in Chinese mitten2handed crab culture1 Key words: Enrofloxacin; Chinese mitten2handed crab; Eriocheir sinensis; p lasma; p rotein binding 大多数药物在体内的药理作用是药物与特异受 体作用的结果。药物吸收入血后会不同程度地与血 浆蛋白结合 , 按其与血浆蛋白结合与否分为结合型 和游离型。这是一个迅速、可逆的过程 , 很快达到
南方水产 第4卷 动态平衡,游离药物+血浆蛋白=药物血浆蛋1.2样品制备 白结合物。因而,药物与血浆蛋白的结合率是影响 恩诺沙星溶液配制。恩诺沙星用 Tris-HO暖缓冲 药效的重要因素之一12 液(0.05mol,pH7.4,内含0.15mol吼 喹诺酮类药物是一类广谱、高效、低毒的抗菌NaCD配制成500.0μgmnL的标准品储备液,使 药,具有良好的药物动力学特性。恩诺沙星对革兰用按需要浓度稀释。 氏阳性菌及阴性菌引起的细菌感染均有较强的抑杀 中华绒螯蟹血浆制取。中华绒螯蟹从当地农贸 作用。主要用于预防和治疗由嗜水气单胞菌Ae市场购买,体重200g左右,健康无疾病,从河蟹 m onas hydrophila、温和气单胞菌A. sobria、鳗弧菌背部心区开一小孔,用注射器抽取血淋巴,每只蟹 brio anguillan、假单胞菌 Pseudon onas.等引0.5mL,混合后移入装有0.5 mL ACD抗凝剂的 起的中华绒螯蟹病害黑鳃病、烂肢病、蟹奴病、颤 eppendorf管中,离心后得河蟹血浆。 抖病等疾病。目前,国内外学者已大量开展了 AOD抗凝剂配方为柠檬酸三钠1.32g,柠檬 药物与血浆蛋白的结合分析,他们广泛分析了药物酸0.44g无水葡萄糖1.47g溶解70~80mL蒸 与血浆蛋白的结合率、结合常数,血浆蛋白与药物馏水中,再加入0.1~0.2g活性碳,静置10min 结合位点数,结合反应热力学函数及模型等 后过滤即得。 这些研究为新药开发和应用提供了有力的理论和技1.3恩诺沙星浓度测定 术保障。ZOTs等1详细研究了恩诺沙星(En 药物浓度测定。吸取0.5mL样品于10mL π toxic in,NR)、环丙沙星等18种喹诺酮类药物离心管中,加入5mL乙腈,旋涡混合2mn,5000 与牛血清蛋白、人血清蛋白、人血浆的蛋白结合rmin离心10min,将上清液转移至旋转蒸发瓶 率。学者们还对恩诺沙星、氧氟沙星、左氟中。往残渣中加入5m乙腈,重复上述操作。旋 沙星以、洛美沙星、普利沙星l、依诺沙转蒸发后,准确加入1mL流动相溶解残留物,过 星2等喹诺酮类药物与蛋白的相互作用进行了详0.22μm滤膜,待测 细的光谱分析研究。贾丽华等研究了恩诺沙星 色谱条件。色谱柱为 Zorbax sB-C18分析柱 与牛血清白蛋白的相互作用,得到两者的结合常数(250mm×4.6mmid.,5μm);流动相为0.05 为4.16×103Lmo',以其摩尔比1:1结合 mol吼‘磷酸溶液(以三乙胺调pH至2.4)亿腈 恩诺沙星与中华绒螯蟹( Chinese m itten-hand-=86114(VN);检测为荧光检测器;激发波长 ed crab, Eriocheir sinensis)血浆蛋白的相互作用及280m,发射波长455m;柱温40℃;进样量20 结合率研究还未见报道,此文则通过静置平衡透析μ;流速1 mL m in。 法研究了恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白的结合 标准曲线的绘制为准确配制5、1、0.5、0.1 率,旨在为恩诺沙星在中华绒螯蟹养殖生产过程中0.05和0.01μgmnL‘的IR标准品工作液。以标 提供用药指导 样浓度为横坐标,HPC测得相应的峰面积为纵坐 标,绘制标准曲线。 材料与方法 回收率、精密度和检测限的测定为分别向2.0 1.1实验试剂及设备 mL空白样本中加入浓度为0.2μ gmL ENR标准 恩诺沙星标准品(>99.7%,美国Sima公司液0.1、0.2、0.5mL,添加水平分别为10、20、 出品);甲醇(色谱纯,德国 Riedel haen公司出50μgmnL(n=6),旋涡混匀,放置15mn,然 品);乙腈、磷酸、三乙胺色谱纯,美国TH后再进行前处理及高效液相色谱分析,计算回收率 公司出品);流动相用水(18.2MQ)。 和精密度。根据国际纯粹与应用化学联合会(I 高速冷冻离心机美国贝克曼公司出品); Wa PAO)的定义,此法的检测限定义为产生相应于3 tr2695高效液相色谱仪(美国war公司出品);倍背景噪音的标准偏差分析信号的浓度值1l。 超纯水仪(美国 Millipore公司出品);透析袋(进口1.4蛋白结合率透析实验 分装,膜分子量13000a,直径21mm) 采用平衡透析法1。将药物加至 Tris-HCl缓 201994-2009ChinaAcademicJOurmaleLectroniePublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
24 南 方 水 产 第 4卷 动态平衡 [ 1 ] , 游离药物 +血浆蛋白 Ω药物 2血浆蛋 白结合物。因而 , 药物与血浆蛋白的结合率是影响 药效的重要因素之一 [ 2 ]。 喹诺酮类药物是一类广谱、高效、低毒的抗菌 药 , 具有良好的药物动力学特性。恩诺沙星对革兰 氏阳性菌及阴性菌引起的细菌感染均有较强的抑杀 作用。主要用于预防和治疗由嗜水气单胞菌 Aero2 m onas hydrophila、温和气单胞菌 A1sobria、鳗弧菌 V ibrio anguillarum、假单胞菌 Pseudom onas sp1等引 起的中华绒螯蟹病害黑鳃病、烂肢病、蟹奴病、颤 抖病等疾病 [ 3 ]。目前 , 国内外学者已大量开展了 药物与血浆蛋白的结合分析 , 他们广泛分析了药物 与血浆蛋白的结合率、结合常数 , 血浆蛋白与药物 结合位点数 , 结合反应热力学函数及模型等 [ 4 - 5 ]。 这些研究为新药开发和应用提供了有力的理论和技 术保障。ZLOTOS等 [ 6 ]详细研究了恩诺沙星 ( En2 rofloxacin, ENR)、环丙沙星等 18种喹诺酮类药物 与牛血清蛋白、人血清蛋白、人血浆的蛋白结合 率。学者们还对恩诺沙星 [ 7 ]、氧氟沙星 [ 8 ]、左氟 沙星 [ 9 ]、洛 美 沙 星 [ 10 ]、普 利 沙 星 [ 11 ]、依 诺 沙 星 [ 12 ]等喹诺酮类药物与蛋白的相互作用进行了详 细的光谱分析研究。贾丽华等 [ 13 ]研究了恩诺沙星 与牛血清白蛋白的相互作用 , 得到两者的结合常数 为 4116 ×10 5 L·mol - 1 , 以其摩尔比 1ζ 1结合。 恩诺沙星与中华绒螯蟹 (Chinese m itten2hand2 ed crab, Eriocheir sinensis) 血浆蛋白的相互作用及 结合率研究还未见报道 , 此文则通过静置平衡透析 法研究了恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白的结合 率 , 旨在为恩诺沙星在中华绒螯蟹养殖生产过程中 提供用药指导。 1 材料与方法 111 实验试剂及设备 恩诺沙星标准品 ( > 9917% , 美国 Sigma公司 出品 ) ; 甲醇 (色谱纯 , 德国 Riedel Haen公司出 品 ) ; 乙腈、磷酸、三乙胺 (色谱纯 , 美国 TED IA 公司出品 ) ; 流动相用水 (1812 MΩ)。 高速冷冻离心机 (美国贝克曼公司出品 ) ; Wa2 ters2695高效液相色谱仪 (美国 W ater公司出品 ) ; 超纯水仪 (美国 M illipole公司出品 ) ; 透析袋 (进口 分装 , 膜分子量 13 000 kDa, 直径 21 mm)。 112 样品制备 恩诺沙星溶液配制。恩诺沙星用 Tris2HCl缓冲 液 (0105 mol·L - 1 , pH 714, 内含 0115 mol·L - 1 NaCl) 配制成 50010μg·mL - 1的标准品储备液 , 使 用按需要浓度稀释。 中华绒螯蟹血浆制取。中华绒螯蟹从当地农贸 市场购买 , 体重 200 g左右 , 健康无疾病 , 从河蟹 背部心区开一小孔 , 用注射器抽取血淋巴 , 每只蟹 015 mL, 混合后移入装有 015 mL ACD 抗凝剂的 eppendorf管中 , 离心后得河蟹血浆。 ACD抗凝剂配方为柠檬酸三钠 1132 g, 柠檬 酸 0144 g, 无水葡萄糖 1147 g, 溶解 70～80 mL蒸 馏水中 , 再加入 011～012 g活性碳 , 静置 10 m in 后过滤即得。 113 恩诺沙星浓度测定 药物浓度测定 [ 14 ]。吸取 015 mL样品于 10 mL 离心管中 , 加入 5 mL乙腈 , 旋涡混合 2 m in, 5 000 r·m in - 1离心 10 m in, 将上清液转移至旋转蒸发瓶 中。往残渣中加入 5 mL乙腈 , 重复上述操作。旋 转蒸发后 , 准确加入 1 mL流动相溶解残留物 , 过 0122μm滤膜 , 待测。 色谱条件 [ 14 ]。色谱柱为 Zorbax SB2C18分析柱 (250 mm ×416 mm i1d1, 5μm ) ; 流动相为 0105 mo·l L - 1磷酸溶液 (以三乙胺调 pH至 214) /乙腈 = 86 /14 (V /V ) ; 检测为荧光检测器 ; 激发波长 280 nm, 发射波长 455 nm; 柱温 40℃; 进样量 20 μL; 流速 1 mL·m in - 1。 标准曲线的绘制为准确配制 5、1、015、011、 0105和 0101μg·mL - 1的 ENR标准品工作液。以标 样浓度为横坐标 , HPLC测得相应的峰面积为纵坐 标 , 绘制标准曲线。 回收率、精密度和检测限的测定为分别向 210 mL空白样本中加入浓度为 012μg·mL - 1 ENR标准 液 011、012、015 mL, 添加水平分别为 10、20、 50μg·mL - 1 ( n = 6) , 旋涡混匀 , 放置 15 m in, 然 后再进行前处理及高效液相色谱分析 , 计算回收率 和精密度。根据国际纯粹与应用化学联合会 ( IU2 PAC) 的定义 , 此法的检测限定义为产生相应于 3 倍背景噪音的标准偏差分析信号的浓度值 [ 15 ]。 114 蛋白结合率透析实验 采用平衡透析法 [ 16 ]。将药物加至 Tris2HCl缓
第5期 黄鸿兵等:恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究 冲液(0.05mol,pH7.4,内含0.15mol(RS为3%)、82%(Rs为5%)。据定义得出 NaC)中,浓度分别为0.2,0.4,1.0,5.0ug·ENR的检测限低于1ng"g。方法的准确度和精密 mL‘。透析袋中装河蟹新鲜血浆2.0mL,袋口扎度均符合残留分析的要求 紧,保证不漏,放入30m广口玻瓶中,每瓶加2.2透析平衡时间确定 10mL不同浓度药物的缓冲液。透析于4℃冷令柜中 由图1可得,4℃条件下,静置透析到48h后 进行;空白处理为透析袋外是1.0μgmnL‘恩诺沙时,透析袋袋内浓度为透析袋外浓度的105.37% 星溶液,透析袋内是0.05mol吼 Tris-HC,0.1595.85%和101.48%,各时间测得的平衡率之间差 molL‘'NaCl缓冲液,分别于静置平衡透析48、异不显著(P>0.05),能较好体现透析袋内外的 72、96h时取透析袋内血浆样品0.5mL和透析袋浓度平衡。所以,蛋白结合率实验部分取样时间主 外缓冲溶液样品0.5mL,测定其中的药物浓度,要为48、72、96ho 确定是否达到平衡时间(平衡时间点以空白处理 组透析袋内外浓度相等确定)后,以前述血浆处 110 理方法测定药物浓度。根据以下公式计算血浆蛋白 结合率 血浆蛋白结合率=(血浆药物浓度-透析液药 物浓度)×00%血浆药物浓度 1.5中华绒螯蟹血淋巴电泳实验 取中华绒螯蟹血浆,制备成5、10、20倍的稀 0000000 释液。电泳方法参考汪家政和范明的方法,采 用Bi-Rad公司 Minip otean电泳仪;丙烯酰胺 在浓缩胶中的百分比4%,分离胶中的百分比 时间/h 12.5%;浓缩胶聚合时间0.5h,分离胶聚合时间 1h浓缩胶电泳电压120V,时间30min,分离胶 图1不同透析时间下恩诺沙星(1.0 u gmL) 电泳电压80V,时间3h15min,0.1%考马斯亮 的透析平衡程度 蓝R-250染色,染色时间15mn,脱色过夜,次日 Fig 1 Equilibrium rate of enrofbxac n pluton at 拍取照片 different d nalysis tme 1.6统计分析 此试验每个参数做3个重复(中华绒螯蟹血2.3恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究 浆混合后重复做3次),取其平均值,采用 Excel 表1显示恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合 200统计分析实验参数,并用SS8.2进行单因率分布在4739%-82.58%之间。透析时间48和 素方差分析( Onew ay anoVA) 72h时,结合率随着恩诺沙星浓度的增大有减小 的趋势,但在透析96h时,各浓度间差异不明显。 2结果与分析 恩诺沙星浓度0.2μgmnL,透析96h时,结合率 2.1恩诺沙星标准曲线、回收率、相对标准偏差 显著小于其它透析时间的结合率。其它浓度条件 以标准样品浓度为x,以HHC测得相应的峰下,结合率随透析时间不发生显著变化(P> 面积为Y,求出FR的回归方程是Y=124.254X+ 0.161,相关性系数是0.9999。结果表明,ENR 2.4中华绒螯蟹血浆蛋白组分的研究 在0.01~5ugmL范围内线性良好,可以满足定 通过测定中华绒螯蟹血浆在280m处的紫外 量分析的需要。 光密度可计算得,试验中中华绒螯蟹血浆蛋白浓度 添加ENR10、20和50wg8时,回收率为为63.95+0.29mgmL。从电泳图谱(图2)可 85%[相对标准偏差(RSD)为7%]、86% 知,中华绒螯蟹血浆蛋白的分子量主要集中在66.2 91994-2009ChinaAcademicJOurmalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
第 5期 黄鸿兵等 : 恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究 25 冲液 (0105 mol·L - 1 , pH 714, 内含 0115 mol·L - 1 NaCl) 中 , 浓度分别为 012, 014, 110, 510μg· mL - 1。透析袋中装河蟹新鲜血浆 210 mL, 袋口扎 紧 , 保证不漏 , 放入 30 mL 广口玻瓶中 , 每瓶加 10 mL不同浓度药物的缓冲液。透析于 4℃冷柜中 进行 ; 空白处理为透析袋外是 110μg·mL - 1恩诺沙 星溶液 , 透析袋内是 0105 mol·L - 1 Tris2HCl, 0115 mo·l L - 1 NaCl缓冲液 , 分别于静置平衡透析 48、 72、96 h时取透析袋内血浆样品 015 mL和透析袋 外缓冲溶液样品 015 mL, 测定其中的药物浓度 , 确定是否达到平衡时间 (平衡时间点以空白处理 组透析袋内外浓度相等确定 ) 后 , 以前述血浆处 理方法测定药物浓度。根据以下公式计算血浆蛋白 结合率。 血浆蛋白结合率 = (血浆药物浓度 - 透析液药 物浓度 ) ×100% /血浆药物浓度 115 中华绒螯蟹血淋巴电泳实验 取中华绒螯蟹血浆 , 制备成 5、10、20倍的稀 释液。电泳方法参考汪家政和范明 [ 17 ]的方法 , 采 用 Bio2Rad公司 M ini2p rotean Ⅱ电泳仪 ; 丙烯酰胺 在浓缩胶中的百分比 4% , 分离胶中的百分比 1215% ; 浓缩胶聚合时间 015 h, 分离胶聚合时间 1 h; 浓缩胶电泳电压 120 V, 时间 30 m in; 分离胶 电泳电压 80 V, 时间 3 h 15 m in; 011%考马斯亮 蓝 R2250染色 , 染色时间 15 m in; 脱色过夜 , 次日 拍取照片。 116 统计分析 此试验每个参数做 3个重复 (中华绒螯蟹血 浆混合后重复做 3次 ) , 取其平均值 , 采用 Excel 2003统计分析实验参数 , 并用 SAS 812进行单因 素方差分析 (One2W ay ANOVA)。 2 结果与分析 211 恩诺沙星标准曲线、回收率、相对标准偏差 以标准样品浓度为 X , 以 HPLC测得相应的峰 面积为 Y, 求出 ENR的回归方程是 Y = 1241254X + 01161, 相关性系数是 0199999。结果表明 , ENR 在 0101～5μg·mL - 1范围内线性良好 , 可以满足定 量分析的需要。 添加 ENR 10、20和 50μg·g - 1时 , 回收率为 85% [相 对 标 准 偏 差 ( RSD ) 为 7% ]、 86% (RSD为 3% )、82% (RSD 为 5% )。据定义得出 ENR的检测限低于 1 ng·g - 1。方法的准确度和精密 度均符合残留分析的要求。 212 透析平衡时间确定 由图 1可得 , 4℃条件下 , 静置透析到 48 h后 时 , 透析袋袋内浓度为透析袋外浓度的 105137%、 95185%和 101148% , 各时间测得的平衡率之间差 异不显著 ( P > 0105) , 能较好体现透析袋内外的 浓度平衡。所以 , 蛋白结合率实验部分取样时间主 要为 48、72、96 h。 图 1 不同透析时间下恩诺沙星 (110μg·mL - 1 ) 的透析平衡程度 Fig11 Equilibrium rate of enrofloxacin solution at different dialysis time 213 恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究 表 1显示恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合 率分布在 47139% ～82158%之间。透析时间 48和 72 h时 , 结合率随着恩诺沙星浓度的增大有减小 的趋势 , 但在透析 96 h时 , 各浓度间差异不明显。 恩诺沙星浓度 012μg·mL - 1 , 透析 96 h时 , 结合率 显著小于其它透析时间的结合率。其它浓度条件 下 , 结合率随透析时间不发生显著变化 ( P > 0105)。 214 中华绒螯蟹血浆蛋白组分的研究 通过测定中华绒螯蟹血浆在 280 nm处的紫外 光密度可计算得 , 试验中中华绒螯蟹血浆蛋白浓度 为 63195 ±0129 mg·mL - 1。从电泳图谱 (图 2) 可 知 , 中华绒螯蟹血浆蛋白的分子量主要集中在 6612
第4卷 表1恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白的结合率 Tab. I Biding of ENR with ph sma prote ii E sinensis 结合率/% 透析袋外药物初始浓度/ ugmL(=3) concentration of drug outside dialysis bag protein bind data 83.84 65.679 49.222 59.272 48.974 80.58 65.70 43.971 平均值准差82.58.7570.81±6.8259.68+5.8047.39±.96 57.524 55.981 透析时 72h 54.29 d nalysis 平均值拣准差 37±.09 69.82±2.38 55.14+5.01 72.41 67.11 57.579 62.22 61.41 63.939 49.021 平均值标准差 68.10+3.93 62.64士.64 注:表格中字母相同表示同一浓度,不同时间之间差异不显著,显著性水平P>0.05 Note: Same superscript letters mean no difierence in the same Dw, othenwise, significant difference, P>0.05. ~97.1ADa之间,在5倍稀释泳道中可以看到在 上述分子量范围以外的其它蛋白,从最小的10 kDa左右到最大100ADa左右不等。10和20倍稀 释液电泳后,泳道中仅能看到2条分子量66.2 97.1 kDa 971ADa之间的蛋白,其它蛋白则由于浓度过稀 66.2 kDa 二·:●● 而观察不到。 3讨论 43 kDa (1)血浆中与药物结合的主要是血清白蛋白 (分子量660001Da左右)3。中华绒螯蟹血浆 31 kDa 蛋白分子量主要在66.2~97.1Ma之间。试验中 采用的透析膜(截留分子量13MDa)能达到阻止 20.1kD 14.4k 蛋白进出,保证恩诺沙星(分子量359.4gmo) 和水在透析袋内外的自由迁移 图2中华绒螯蟹血浆蛋白电泳图谱 (2)平衡透析法是结合率分析的传统方法 标准蛋白;2.10倍稀释血浆;3.20倍稀释血浆;4~5.5倍稀释血浆 比较可靠和经济实用。 ZLO TOS等1研究发现药物 Fig 2 Electrophoretic figure of p lama protein in Esinensis 蛋白物质的量浓度比例0.01条件下,恩诺沙星与 I standard poteins 2. plasma X10); 3. plasma( X20); 4~5. plasma(×5) 人血清蛋白(HSA)结合率为(34.6±5.6)% 连续超滤法)和(40±2)%(不连续超滤法)。高。②药物浓度与蛋白浓度的比例。此试验所用的 KAARTNEN等研究发现恩诺沙星与奶山羊血浆药物蛋白物质的量比例约在0.002~0.05之间 蛋白的结合率为36%~45%(体外实验)。此试验符合实际生产中的用药情况,在该浓度下,血浆蛋 得到的结合率结果高于文献中蛋白结合率的主要原白质只有一个位点会与药物发生结合作用。试验中 因:①血清蛋白的活性。 OL SEN等研究发现血的结合率数据主要分布在4139%~70.81%,而 清蛋白结合稳定剂后与药物的蛋白结合率大幅提出现的82.58%和82.37%2个高数值,可能是因 201994-2009ChinaAcademicJournalElectronicpUblishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
26 南 方 水 产 第 4卷 表 1 恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白的结合率 Tab11 Bind ing of ENR with pla sma prote in in E1sinensis 结合率 /% p rotein bind data 透析袋外药物初始浓度 /μg·mL - 1 ( n = 3) concentration of drug outside dialysis bag 012 014 110 510 透析时间 dialysis time 48 h 83184 78155 651679 491222 83133 68117 591272 481974 80158 65170 541095 431971 平均值 ±标准差 82158 ±1175 a 70181 ±6182 59168 ±5180 47139 ±2196 72 h 82168 69126 571524 551981 84129 67176 521303 541295 80114 72143 591662 平均值 ±标准差 82137 ±2109 a 69182 ±2138 56150 ±3179 55114 ±5101 96 h 72141 67111 621742 571579 69167 59139 601765 521226 62122 61141 631939 491021 平均值 ±标准差 68110 ±3193 b 62164 ±1164 62148 ±1159 52194 ±2109 注 : 表格中字母相同表示同一浓度 , 不同时间之间差异不显著 , 显著性水平 P > 0105 Note: Same superscrip t letters mean no difference in the same row, otherwise, significant difference, P > 01051 ～9711 kDa之间 , 在 5倍稀释泳道中可以看到在 上述分子量范围以外的其它蛋白 , 从最小的 10 kDa左右到最大 100 kDa左右不等。10和 20倍稀 释液电泳后 , 泳道中仅能看到 2条分子量 6612～ 9711 kDa之间的蛋白 , 其它蛋白则由于浓度过稀 而观察不到。 3 讨论 (1) 血浆中与药物结合的主要是血清白蛋白 (分子量 66 000 kDa左右 ) [ 1, 18 ]。中华绒螯蟹血浆 蛋白分子量主要在 6612～9711 kDa之间。试验中 采用的透析膜 (截留分子量 13 kDa) 能达到阻止 蛋白进出 , 保证恩诺沙星 (分子量 35914 g·mol - 1 ) 和水在透析袋内外的自由迁移。 (2) 平衡透析法是结合率分析的传统方法 , 比较可靠和经济实用。ZLOTOS等 [ 6 ]研究发现药物 /蛋白物质的量浓度比例 0101条件下 , 恩诺沙星与 人血清蛋白 ( HSA ) 结合率为 ( 3416 ±516 ) % (连续超滤法 ) 和 ( 40 ±2) % (不连续超滤法 )。 KAARTINEN等 [ 19 ]研究发现恩诺沙星与奶山羊血浆 蛋白的结合率为 36% ～45% (体外实验 )。此试验 得到的结合率结果高于文献中蛋白结合率的主要原 因 : ①血清蛋白的活性。OLSEN等 [ 20 ]研究发现血 清蛋白结合稳定剂后与药物的蛋白结合率大幅提 图 2 中华绒螯蟹血浆蛋白电泳图谱 11标准蛋白; 2110倍稀释血浆; 3120倍稀释血浆; 4～515倍稀释血浆 Fig12 Electrophoretic figure of p lasma p rotein in E1sinensis 11standard p roteins; 21p lasma ( ×10) ; 31p lasma ( ×20) ; 4～51p lasma ( ×5) 1 高。②药物浓度与蛋白浓度的比例。此试验所用的 药物 /蛋白物质的量比例约在 01002～0105之间 , 符合实际生产中的用药情况 , 在该浓度下 , 血浆蛋 白质只有一个位点会与药物发生结合作用。试验中 的结合率数据主要分布在 47139% ～70181% , 而 出现的 82158%和 82137% 2个高数值 , 可能是因
第5期 黄鸿兵等:恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究 为药物数量偏少,蛋白充分结合的结果;随着取样5] TAN Jiannao, L U Jain,Hhi, et al hteracton ofwogoni 次数的增多,蛋白数量减少要多于药物数量,结合 with bovine serum album in [J]. Boorganic Med ic nal Chem, 率趋于稳定。③结合率测定方法上的差异。更快捷 2005,13(12):4124-412 的连续超滤法、表面响应传感器等方法与此试验所 6]五oTsG. OEHLMANN M,NrK且P, et al Detem naton of protein binding of gyrase inhibitors by means of continuous ultrafil- 得的结合率结果有一定的一致性,结果差异来自仪 UJ. J Pham B nmed AnaL, 1998, 18(4/5):847 器、透析膜对药物的吸附等多方面。 (3)已有一些恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的71 EIMASM, YAZAR E, IRAS B, et al Phamacok inetics and oral 药物动力学研究见于报道。此试验针对恩诺沙 faunated and defaunated angora 星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率开展的研究发现,(81赵长春,郑维发,王锦化,等国产氧氟沙星与人血清白蛋白 结合率主要在47.39%~82.58%之间,试验要高 的相互作用[J]中国药学杂志,2003,38(10):791-793 于恩诺沙星与其它畜禽类血浆蛋白的结合率20%[9]易帅,吴军,郭明,等氧氟沙星和左氟沙星与人牛血清白蛋 ~50%。恩诺沙星与犬血浆蛋白的结合率仅有 白的相互作用研究[J」浙江大学学报:理学版,2004,31 27%左右12。原因可能是:①中华绒螯蟹血浆中 (3):314-318 蛋白浓度较高,蛋白种类比较丰富,除血清蛋白 [10]何华,叶海英,戴丽,等.洛美沙星-1b~(3+)配合物与 外,还有其它可能与恩诺沙星结合的蛋白,这会增 BSA相互作用的荧光光谱研究[J]光谱学与光谱分析 2006,3(3):480-483 大恩诺沙星与血浆蛋白的结合率;②文献使用的是(1]陈昌云,李小华,许飞,等普利沙星与牛血清白蛋白相互 试剂级血清白蛋白,而血浆则是新鲜制取所得,两 作用的光谱学研究[J南京师大学报:自然科学版,2006 者活性上存在一定的差异120 29(1):62-65 药物与血浆蛋白结合率过高和过低都不利于药 12]刘永明,李桂芝,荧光猝灭法研究依诺沙星和蛋白质的相互 效的发挥2。药物可以通过与血浆蛋白结合而被 作用[J,应用化学,2004,21(6):621-624 13]贾丽华,曾晓丹,郭祥峰.恩诺沙星与牛血清白蛋白的相互 带到作用点,然后解离成游离态发挥药效。此试验 作用[J应用化学,2006,23(9):957-960 发现恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白有50%以上 [14]WU Guanghong, MENG Yong, ZHU Xiaohua, et al Phamacokr 的结合率。用药初始阶段,恩诺沙星会较多与血浆 netics and tissue distributon of enrofloxacin and its metabolite cp- 蛋白结合,因而实际游离态的药物浓度要低于用药 iDfboxac inin the chinese mitten-handed crab. eriocheir sinensis 浓度,药效会偏低;从另一个角度来看,游离态药 [J] Anal B chem,2006,358(1):25-30 物代谢以后,结合态恩诺沙星的释放又会使药物的 15]杜进祥.分析化学中的检出限、测定限与检测限[J]广西 师范大学学报:自然科学版,2003,21(6):349-350 药效时间延长。因此,在实际生产过程中,需要综 [16]万丽丽.野黄苓苷动物药代动力学研究[D]上海:上海医 合考虑药物的有效浓度、药效时间,必要情况下要 药工业研究院,2005 考虑与其它药物的搭配使用,达到有效治疗的目17]汪家政,范明、蛋白质技术手册Ml北京:科学技术出版 的 社,2000 [18]吴澄清.药物与血浆蛋白结合对体内过程的影响[J]中国 998,8(2):69-71. 参考文献 [19]KAARTNEN L, SOLONEN M, ALL IL, et al Phamacokinetics ]曾经泽.生物药物分析[M]北京:北京医科大学,中国协和 of en ofloxacin after single intravenous, intramuscular and subcuta- 医科大学联合出版社,1998 neous injections in lactating cows [J] J Vet Pham Therap 2]赵燕燕,杨更亮,李海鹰,等.高效前沿分析的发展及在药物 蛋白结合研究中的应用[J化学通报,2003,66(5):327 [20] OLSEN H, ANDERSON A, NORDBOA, et al Phamaceutical- grade album in mpaired drug-binding capacity in vitD [J] BMC 3]刘开永,汪开毓.恩诺沙星在水产中的应用与研究[J中国 Clin pham. 2004. 4:4 兽药杂志,2004,38(10):32-34 21]朱模忠.兽药手册[M]北京:化学工业出版社,2003 [4]ASHOKA S, SEETHARAMAPPA J, KANDAGAL PB, et al estigation of the interaction between traadone hydochloride and[2】汪庆海.药物与血浆蛋白结合对分布的影响[J]中国医院 药学杂志,1985,5(2):12-1 bovine senm album in [JI J Lum inescence, 2006, 121 (1) 201994-2009ChinaAcademicJourmalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
第 5期 黄鸿兵等 : 恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率的研究 27 为药物数量偏少 , 蛋白充分结合的结果 ; 随着取样 次数的增多 , 蛋白数量减少要多于药物数量 , 结合 率趋于稳定。③结合率测定方法上的差异。更快捷 的连续超滤法、表面响应传感器等方法与此试验所 得的结合率结果有一定的一致性 , 结果差异来自仪 器、透析膜对药物的吸附等多方面。 (3) 已有一些恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的 药物动力学研究见于报道 [ 14 ]。此试验针对恩诺沙 星与中华绒螯蟹血浆蛋白结合率开展的研究发现 , 结合率主要在 47139% ～82158%之间 , 试验要高 于恩诺沙星与其它畜禽类血浆蛋白的结合率 20% ～50%。恩诺沙星与犬血浆蛋白的结合率仅有 27%左右 [ 21 ]。原因可能是 : ①中华绒螯蟹血浆中 蛋白浓度较高 , 蛋白种类比较丰富 , 除血清蛋白 外 , 还有其它可能与恩诺沙星结合的蛋白 , 这会增 大恩诺沙星与血浆蛋白的结合率 ; ②文献使用的是 试剂级血清白蛋白 , 而血浆则是新鲜制取所得 , 两 者活性上存在一定的差异 [ 20 ]。 药物与血浆蛋白结合率过高和过低都不利于药 效的发挥 [ 22 ]。药物可以通过与血浆蛋白结合而被 带到作用点 , 然后解离成游离态发挥药效。此试验 发现恩诺沙星与中华绒螯蟹血浆蛋白有 50%以上 的结合率。用药初始阶段 , 恩诺沙星会较多与血浆 蛋白结合 , 因而实际游离态的药物浓度要低于用药 浓度 , 药效会偏低 ; 从另一个角度来看 , 游离态药 物代谢以后 , 结合态恩诺沙星的释放又会使药物的 药效时间延长。因此 , 在实际生产过程中 , 需要综 合考虑药物的有效浓度、药效时间 , 必要情况下要 考虑与其它药物的搭配使用 , 达到有效治疗的目 的。 参考文献 : [ 1 ] 曾经泽. 生物药物分析 [M ]. 北京 : 北京医科大学 , 中国协和 医科大学联合出版社 , 1998. [ 2 ] 赵燕燕 , 杨更亮 , 李海鹰 , 等. 高效前沿分析的发展及在药物 2蛋白结合研究中的应用 [J ]. 化学通报 , 2003, 66 ( 5) : 327 - 332. [ 3 ] 刘开永 , 汪开毓. 恩诺沙星在水产中的应用与研究 [J ]. 中国 兽药杂志 , 2004, 38 (10) : 32 - 34. [ 4 ] ASHOKA S, SEETHARAMAPPA J, KANDAGAL P B, et al. In2 vestigation of the interaction between trazodone hydrochloride and bovine serum albumin [ J ]. J Luminescence, 2006, 121 ( 1 ) : 179 - 186. [ 5 ] TIAN Jianniao, L IU Jiaqin, HU Zhide, et al. Interaction ofwogonin with bovine serum albumin [ J ]. Bioorganic Medicinal Chem, 2005, 13 (12) : 4 124 - 4 129. [ 6 ] ZLOTOS G, OEHLMANN M, N ICKEL P, et al. Determination of p rotein binding of gyrase inhibitors by means of continuous ultrafil2 tration [J ]. J Pharm Biomed Anal, 1998, 18 ( 4 /5 ) : 847 - 858. [ 7 ] ELMASM, YAZAR E, TRAS B, et al. Pharmacokinetics and oral bioavailability of enrofloxacin in faunated and defaunated angora goats [J ]. RevMed Vet, 2000, 151 (6) : 507 - 510. [ 8 ] 赵长春 , 郑维发 , 王锦化 , 等. 国产氧氟沙星与人血清白蛋白 的相互作用 [J ]. 中国药学杂志 , 2003, 38 (10) : 791 - 793. [ 9 ] 易帅 , 吴军 , 郭明 , 等. 氧氟沙星和左氟沙星与人牛血清白蛋 白的相互作用研究 [ J ]. 浙江大学学报 : 理学版 , 2004, 31 (3) : 314 - 318. [ 10 ] 何华 , 叶海英 , 戴丽 , 等. 洛美沙星 2Tb～ ( 3 + ) 配合物与 BSA相互作用的荧光光谱研究 [ J ]. 光谱学与光谱分析 , 2006, 3 (3) : 480 - 483. [ 11 ] 陈昌云 , 李小华 , 许飞 , 等. 普利沙星与牛血清白蛋白相互 作用的光谱学研究 [J ]. 南京师大学报 : 自然科学版 , 2006, 29 (1) : 62 - 65. [ 12 ] 刘永明 , 李桂芝. 荧光猝灭法研究依诺沙星和蛋白质的相互 作用 [J ]. 应用化学 , 2004, 21 (6) : 621 - 624. [ 13 ] 贾丽华 , 曾晓丹 , 郭祥峰. 恩诺沙星与牛血清白蛋白的相互 作用 [J ]. 应用化学 , 2006, 23 (9) : 957 - 960. [ 14 ] WU Guanghong, MENG Yong, ZHU Xiaohua, et al. Pharmacoki2 netics and tissue distribution of enrofloxacin and itsmetabolite cip2 rofloxacin in the Chinese mitten2handed crab, Eriocheir sinensis [J ]. Anal Biochem, 2006, 358 (1) : 25 - 30. [ 15 ] 杜进祥. 分析化学中的检出限、测定限与检测限 [ J ]. 广西 师范大学学报 : 自然科学版 , 2003, 21 (6) : 349 - 350. [ 16 ] 万丽丽. 野黄苓苷动物药代动力学研究 [D ]. 上海 : 上海医 药工业研究院 , 2005. [ 17 ] 汪家政 , 范明. 蛋白质技术手册 [M ]. 北京 : 科学技术出版 社 , 2000. [ 18 ] 吴澄清. 药物与血浆蛋白结合对体内过程的影响 [ J ]. 中国 医药学杂志 , 1998, 8 (2) : 69 - 71. [ 19 ] KAARTINEN L, SOLONEN M, ALL IL, et al. Pharmacokinetics of enrofloxacin after single intravenous, intramuscular and subcuta2 neous injections in lactating cows [ J ]. J Vet Pharm Therap, 1995, 18 (5) : 357 - 362. [ 20 ] OLSEN H, ANDERSON A, NORDBª A, et al. Pharmaceutical2 grade albumin impaired drug2binding capacity in vitro [ J ]. BMC Clin Pharm, 2004, 4: 4. [ 21 ] 朱模忠. 兽药手册 [M ]. 北京 : 化学工业出版社 , 2003. [ 22 ] 汪庆海. 药物与血浆蛋白结合对分布的影响 [J ]. 中国医院 药学杂志 , 1985, 5 (2) : 12 - 141