第3期 大连水产学院学报 Vol 21 No 年9月 JOURNAL OF DAL AN F IHER正SUNⅣERSY 甲p.2006 文章编号:1000-9957(2006)03-0231 黄芪对史氏鲟抗氧化能力及免疫力的影响 刘红柏2,卢彤岩2,张春燕3,孙大江2,白秀娟 (1东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030,2中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070 3黑龙江省中医医院,黑龙江哈尔滨150030) 摘要:采用灌服的方法研究了黄芪 1 stmga hus m en branaceus水煎剂对1龄史氏鲟 Acipenser schrencki部 分非特异性免疫指标和抗氧化能力的影响。试验分3组进行,每组放史氏鲟10尾,每日灌服1次黄 芪水煎剂,剂量均按每100g鱼体重灌服0.3mL药液,相当于黄芪(干物质)的用量为日投喂饲料 重量的0.5%(A组)、1.0%(B组)和2.0%(C组),对照组鱼灌服蒸馏水。结果显示:A组和B 组的史氏鲟被灌服黄芪水煎剂后,血浆及各组织中的溶菌酶含量呈升高的趋势,C组鱼的不同组织变 化不一,但均无统计学意义;史氏鲟血浆中的一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)无显著变化, 但B组和C组史氏鲟肝脏中的NO含量与对照组有显著差异(P<0.05),C组史氏鲟肝脏中的NOS 活性也与对照组有显著差异(P<0.05);对史氏鲟血浆及肝脏中超氧化物岐化酶(SD)的活性有 增强作用,尤其B组鱼的∞OD酶活性较对照组显著升高;黄芪能显著降低史氏鲟血浆中丙二醛 MDA)的含量,提高史氏鲟的抗氧化能力 关键词:黄芪;史氏鲟;免疫;抗氧化 中图分类号:S942.5 文献标识码:A 黄芪 A stragalus m an banaceus是最常用的补益中草药之一,含有黄芪皂甙、多糖、黄酮、氨基酸、 微量元素、胆碱及叶酸等多种化学成分,具有明显的免疫调节功能,能诱生干扰素,起到抗病毒的作 黄芪的资源丰富,价格合理,在水产上具有良好的应用前景。本试验中,作者采用对史氏鲟 Acipenser schrencki幼鱼灌服黄芪水煎剂的方法,首次研究了黄芪作为免疫添加剂对史氏鲟幼鱼抗氧化 能力和免疫力的影响,旨在为其在水产上的实际应用提供理论依据 1材料与方法 1.1材料 中药黄芪购自哈尔滨世一堂药店。一氧化氮(NO)试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒、 超氧化物歧化酶(∞D)测试盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、微球菌粉、溶菌酶标准品、蛋白标 准品(56g/)及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。 1.2方法 1.2.1药液的提取称取干燥的黄芪60g放入砂锅中,加水浸泡2h,第1次熬45mi,将药汁倒 出,再加水熬20min,过滤,将两次药汁合并浓缩成100mL,其中1mL药液相当于0.6g黄芪( 物质)的水煎剂,经高压灭菌后存放于冰箱(4℃)中备用。 22试验鱼的饲养及样品采集取健康、非免疫状态下的1龄史氏鲟,平均体重为0.10~0.15 kg,于室内水族箱(0.9m0.5m×0.45m)中养殖,每箱放10尾鱼,每日按鱼体重的1.8%投喂 饵料。各水族箱配有蓄水池、循环过滤泵及充气泵 试验设3个试验组及对照组,每组设两个平行。黄芪灌服剂量参照中草药作为免疫增强剂和饲料 2005-5-30 科技部“十五攻关计划”项目资助(2001BA505B506);黑龙江省自然科学基金资助项目(C0322) 刘红柏(1970-),女,博士,副研究员。E-mail:honebailiu@yahoocam.cn通讯作者:白秀娟,女,教授。E-mait bx630306@163 91994-2007ChinaAcademicJOurmalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:/www.enki.net
第 21卷第 3期 大 连 水 产 学 院 学 报 Vol. 21 No. 3 2 0 0 6 年 9 月 JOURNAL OF DAL IAN FISHER IES UN IVERSITY Sep . 2 0 0 6 文章编号 : 1000 - 9957 (2006) 03 - 0231 - 05 黄芪对史氏鲟抗氧化能力及免疫力的影响 刘 红 柏 1、2 , 卢 彤 岩 2 , 张 春 燕 3 , 孙 大 江 2 , 白 秀 娟 1 (1. 东北农业大学 ,黑龙江 哈尔滨 150030; 2. 中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所 ,黑龙江 哈尔滨 150070; 3. 黑龙江省中医医院 ,黑龙江 哈尔滨 150030) 摘要 : 采用灌服的方法研究了黄芪 Astragalus m em branaceus水煎剂对 1 +龄史氏鲟 Acipenser schrencki部 分非特异性免疫指标和抗氧化能力的影响。试验分 3组进行 , 每组放史氏鲟 10尾 , 每日灌服 1次黄 芪水煎剂 , 剂量均按每 100 g鱼体重灌服 013 mL药液 , 相当于黄芪 (干物质 ) 的用量为日投喂饲料 重量的 015% (A组 )、110% (B组 ) 和 210% (C组 ) , 对照组鱼灌服蒸馏水。结果显示 : A组和 B 组的史氏鲟被灌服黄芪水煎剂后 , 血浆及各组织中的溶菌酶含量呈升高的趋势 , C组鱼的不同组织变 化不一 , 但均无统计学意义 ; 史氏鲟血浆中的一氧化氮 (NO) 及一氧化氮合酶 (NOS) 无显著变化 , 但 B组和 C组史氏鲟肝脏中的 NO含量与对照组有显著差异 ( P < 0105) , C组史氏鲟肝脏中的 NOS 活性也与对照组有显著差异 ( P < 0105) ; 对史氏鲟血浆及肝脏中超氧化物岐化酶 ( SOD) 的活性有 增强作用 , 尤其 B 组鱼的 SOD 酶活性较对照组显著升高 ; 黄芪能显著降低史氏鲟血浆中丙二醛 (MDA) 的含量 , 提高史氏鲟的抗氧化能力。 关键词: 黄芪 ; 史氏鲟 ; 免疫 ; 抗氧化 中图分类号 : S94215 文献标识码: A 黄芪 Astragalus m em branaceus是最常用的补益中草药之一 , 含有黄芪皂甙、多糖、黄酮、氨基酸、 微量元素、胆碱及叶酸等多种化学成分 , 具有明显的免疫调节功能 , 能诱生干扰素 , 起到抗病毒的作 用 [ 1 - 3 ]。黄芪的资源丰富 , 价格合理 , 在水产上具有良好的应用前景。本试验中 , 作者采用对史氏鲟 Acipenser schrencki幼鱼灌服黄芪水煎剂的方法 , 首次研究了黄芪作为免疫添加剂对史氏鲟幼鱼抗氧化 能力和免疫力的影响 , 旨在为其在水产上的实际应用提供理论依据。 1 材料与方法 111 材料 中药黄芪购自哈尔滨世一堂药店。一氧化氮 (NO) 试剂盒、一氧化氮合酶 (NOS) 测定试剂盒、 超氧化物歧化酶 (SOD) 测试盒、丙二醛 (MDA ) 测定试剂盒、微球菌粉、溶菌酶标准品、蛋白标 准品 (56 g/L) 及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。 112 方法 11211 药液的提取 称取干燥的黄芪 60 g放入砂锅中 , 加水浸泡 2 h, 第 1次熬 45 m in, 将药汁倒 出 , 再加水熬 20 m in, 过滤 , 将两次药汁合并浓缩成 100 mL, 其中 1 mL药液相当于 016 g黄芪 (干 物质 ) 的水煎剂 , 经高压灭菌后存放于冰箱 (4℃) 中备用。 11212 试验鱼的饲养及样品采集 取健康、非免疫状态下的 1 +龄史氏鲟 , 平均体重为 0110～0115 kg, 于室内水族箱 (019 m ×015 m ×0145 m) 中养殖 , 每箱放 10尾鱼 , 每日按鱼体重的 118%投喂 饵料。各水族箱配有蓄水池、循环过滤泵及充气泵。 试验设 3个试验组及对照组 , 每组设两个平行。黄芪灌服剂量参照中草药作为免疫增强剂和饲料 收稿日期 : 2005205230 基金项目 : 科技部 “十五攻关计划 ”项目资助 (2001BA505B506) ; 黑龙江省自然科学基金资助项目 (C0322) 作者简介 : 刘红柏 (1970 - ) , 女 , 博士 , 副研究员。E - mail: hongbailiu@yahoo1com1cn 通讯作者 : 白秀娟 , 女 , 教授。E - mail: bxj630306@1631com
232 大连水产学院学报 第21卷 添加剂的用量",每日灌服1次。灌服前将黄芪水煎剂按不同浓度稀释,使每组试验鱼均按每100 g鱼体重灌服0.3mL药液,相当于黄芪(干物质)的用量分别为日投喂饲料重量的0.5%(A组)、 1.0%(B组)和2.0%(C组),对照组灌服灭菌蒸馏水。连续灌服两周后对全部试验鱼统一采样。 于试验鱼尾动静)脉处采集肝素抗凝血,4℃下以3500r/min离心20min,取血浆。解剖取鱼各组 织的样品,将血浆及组织样品立即置于70℃下保存 1.3各项指标的测定 1.3.Ⅰ样品的处理准确称取试验鱼组织样品与预冷的生理盐水,按ν冲=1稀释,匀浆机匀浆 分别按不同检测指标及试剂盒所要求的速度和时间离心,取上清液进行检测。血浆在37℃下水浴融 化后即可检测。每个检测指标的样本数n=15,溶菌酶检测的样本数n=20,均设平行样。 1.3.2NO及NOS的测定取肝脏上清液及血浆,操作按NO及NOS试剂盒说明书进行 组织中NOS活力单位定义每亳克组织蛋白每分钟生成1 moi No为一个酶活力单位 血浆中NOS活力单位定义每毫升血浆每分钟生成1 MoNO为一个酶活力单位 1.3.3SOD活性的测定参照其它动物测定SOD的取样量,设定N个样品取样值,从中选取几个样 本,按试剂盒说明书操作,测定其样品管及对照管的吸光值。按下式计算百分抑制率 百分抑制率=(对照管吸光度3测定管吸光度)照管吸光度 其计算结果在0.48~0.50之间的为最佳取样量。选择此最佳取样量,按试剂盒说明书对待测样本进 行SOD活性测定。 血浆中SOD活性定义每毫升反应液中,对SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD 活力单位(U)。 组织匀浆中SOD活力定义每毫克组织蛋白在1mL反应液中,对SOD抑制率达50%时所对应 的SOD量为一个SOD活力单位(U)。 1.3.4MDA含量的测定按MDA测定试剂盒中的操作方法对试验鱼血浆、肝组织中的MDA含量进 行测定。 1.3.5溶菌酶含量的测定取微球菌粉加入0.01mol的BS,研磨,制成5mg/mL的微球菌粉贮 备菌液,4℃下保存,一周内可用。测定时按中贮备菌液)冲(溶剂)=1:29的量稀释成应用菌 液。取溶菌酶标准品加蒸馏水配成2mg/mL的标准品贮备液(保存同贮备菌液),用时以蒸馏水稀释 50倍,即成40μg/mL的标准品应用液。 将试管放入冰水浴中,每管加入应用菌液2.0mL,然后在标准管中加入0.2mL的溶菌酶标准品 应用液,测定管中加入组织匀浆上清液陬取109%组织,于4℃下匀浆,以10000rmn离心20min) 混匀后,测定吸光度A。将比色后的溶液立即倒回到冰水浴的试管中,将试管取出,37℃下水浴30 min后,立即取试管放入冰水浴中,于530m处测定吸光度A1。然后将吸光度A换算成透光度T(r 1/104),根据下列公式计算出溶菌酶的含量 (样品7,3样品70) 样品中溶菌酶含量(gm或gB“标准品r,标准品)×标准管浓度烊样本稀释倍数 其中:T—水浴后吸光度A换算出的透光度;T—水浴前吸光度A换算出的透光度 1.3.6组织中蛋白质含量的测定采用考马斯亮兰蛋白测试盒测定肝组织提取液中的蛋白质含量 1.3.7数据处理对数据结果采用SPSS软件最小显著差数法①LS)进行处理 2结果 2.1黄芪水煎剂对史氏鲟血浆及肝脏中NO及NOS的影响 从表1可见,给史氏鲟灌服不同剂量的黄芪水煎剂后,其血浆中的NO及NOS虽然较对照组略有 上升,但差异不显著(P>0.05);B组及C组鱼肝脏中的NO与对照组相比差异显著(P<0.05) 而C组鱼肝脏中的NOS与对照组相比差异也显著(P<0.05) 91994-2007ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net
添加剂的用量 [ 4 - 6 ] , 每日灌服 1次。灌服前将黄芪水煎剂按不同浓度稀释 , 使每组试验鱼均按每 100 g鱼体重灌服 013 mL药液 , 相当于黄芪 (干物质 ) 的用量分别为日投喂饲料重量的 015% (A组 )、 110% (B组 ) 和 210% (C组 ) , 对照组灌服灭菌蒸馏水。连续灌服两周后对全部试验鱼统一采样。 于试验鱼尾动 (静 ) 脉处采集肝素抗凝血 , 4℃下以 3 500 r/m in离心 20 m in, 取血浆。解剖取鱼各组 织的样品 , 将血浆及组织样品立即置于 - 70℃下保存。 113 各项指标的测定 11311 样品的处理 准确称取试验鱼组织样品与预冷的生理盐水 , 按 w∶φ = 1∶9稀释 , 匀浆机匀浆 , 分别按不同检测指标及试剂盒所要求的速度和时间离心 , 取上清液进行检测。血浆在 37℃下水浴融 化后即可检测。每个检测指标的样本数 n = 15, 溶菌酶检测的样本数 n = 20, 均设平行样。 11312 NO及 NOS的测定 取肝脏上清液及血浆 , 操作按 NO及 NOS试剂盒说明书进行。 组织中 NOS活力单位定义 每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NO为一个酶活力单位。 血浆中 NOS活力单位定义 每毫升血浆每分钟生成 1 nmol NO为一个酶活力单位。 11313 SOD活性的测定 参照其它动物测定 SOD的取样量 , 设定 N 个样品取样值 , 从中选取几个样 本 , 按试剂盒说明书操作 , 测定其样品管及对照管的吸光值。按下式计算百分抑制率 : 百分抑制率 = (对照管吸光度 ∃ 测定管吸光度 ) /对照管吸光度 , 其计算结果在 0148～0150之间的为最佳取样量。选择此最佳取样量 , 按试剂盒说明书对待测样本进 行 SOD活性测定。 血浆中 SOD活性定义 每毫升反应液中 , 对 SOD抑制率达 50%时所对应的 SOD量为一个 SOD 活力单位 (U)。 组织匀浆中 SOD活力定义 每毫克组织蛋白在 1 mL反应液中 , 对 SOD抑制率达 50%时所对应 的 SOD量为一个 SOD活力单位 (U)。 11314 MDA含量的测定 按 MDA测定试剂盒中的操作方法对试验鱼血浆、肝组织中的 MDA含量进 行测定。 11315 溶菌酶含量的测定 取微球菌粉加入 010 1 mol/L的 PBS, 研磨 , 制成 5 mg/mL的微球菌粉贮 备菌液 , 4℃下保存 , 一周内可用。测定时按 φ (贮备菌液 ) ∶φ (溶剂 ) = 1∶29的量稀释成应用菌 液。取溶菌酶标准品加蒸馏水配成 2 mg/mL的标准品贮备液 (保存同贮备菌液 ) , 用时以蒸馏水稀释 50倍 , 即成 40μg/mL的标准品应用液。 将试管放入冰水浴中 , 每管加入应用菌液 210 mL, 然后在标准管中加入 012 mL的溶菌酶标准品 应用液 , 测定管中加入组织匀浆上清液 (取 10%组织 , 于 4℃下匀浆 , 以 10 000 r/m in离心 20 m in)。 混匀后 , 测定吸光度 A0。将比色后的溶液立即倒回到冰水浴的试管中 , 将试管取出 , 37℃下水浴 30 m in后 , 立即取试管放入冰水浴中 , 于 530 nm处测定吸光度 At。然后将吸光度 A换算成透光度 T ( T = 1 /10 A ) , 根据下列公式计算出溶菌酶的含量 : 样品中溶菌酶含量 (μg/mL或 μg/g) = (样品 Tt ∃ 样品 T0 ) (标准品 Tt - 标准品 T0 ) ×标准管浓度 ×样本稀释倍数 , 其中 : Tt ———水浴后吸光度 At换算出的透光度; T0 ———水浴前吸光度 A0换算出的透光度。 11316 组织中蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰蛋白测试盒测定肝组织提取液中的蛋白质含量。 11317 数据处理 对数据结果采用 SPSS软件最小显著差数法 (LSD) 进行处理。 2 结果 211 黄芪水煎剂对史氏鲟血浆及肝脏中 NO及 NOS的影响 从表 1可见 , 给史氏鲟灌服不同剂量的黄芪水煎剂后 , 其血浆中的 NO及 NOS虽然较对照组略有 上升 , 但差异不显著 ( P > 0105) ; B组及 C组鱼肝脏中的 NO与对照组相比差异显著 ( P < 0105) , 而 C组鱼肝脏中的 NOS与对照组相比差异也显著 ( P < 0105)。 232 大 连 水 产 学 院 学 报 第 21卷
第3期刘红柏,等:黄芪对史氏鲟抗氧化能力及免疫力的影响 233 表1灌服不同剂量黄芪水煎剂后史氏鲟肝脏和血浆中NO含量及NOS酶活性的变化 Tab.I NO and No syn theta se NOS)activ ites i lier and phsma of Am ur sturgeon dr nkig d t dosages of aqueous extract of mem branous m ilkve tch root 肝脏lier 血浆 plama 组别gup No/(Hmol'g") NOs/(U·mg) NOs/(U·mL1) 对照cont 2.76当 3.71±0.79 441.75±07.77 14.48±.93 3.12±0.82 3.75±0.674 496.95±58.124 14.43+.252 4.93±.75 512.80±36.584 16.83±0.58 5.68±.67 5.51±0.79 472,44±65.26 同一列数值上标有相邻字母者表示差异显著(P<0.05),标有相间字母者表示差异极显著(P<0.01)。下同 Values in the same column with ad jacent superscripts are significantly different (P <0. 05), with interval superscrp ts are extrmely sig 2.2黄芪水煎剂对史氏鲟SOD活性和MDA含量的影响 由表2可见,给史氏鲟灌服黄芪水煎剂后,其血浆及肝脏中的SOD活性上升,其中B组鱼血浆 及肝脏中的SOD活性比对照组显著升高(P<0.05),其余两组的上升幅度不明显;3组鱼血浆中的 MDA含量均明显降低,同对照组比较均有极显著的差异(P<0.01),肝脏中的MDA含量也呈现下 降趋势,但与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。 表2灌服不同剂量黄芪水煎剂后史氏鲟血浆及肝脏中SOD酶活性和MDA含量的变化 Tab 2 Superox ie d isn ut se( SoD)acti ities and ma lona dehyde (MDA) levels in phyma and lNer of Amur sturgeon drikig different dosages of aqueous extract of m em branous m ilkve tch root 血浆phma 组别goup 9OD活性 actIvIty MDA含量 content SOD活性 activity MDA含量 content 对照cont 315.36157.36 42.64±3.98 272.28+5.09 22.25±,60 361.23±10.67 34.77±6.162 286.96±34.42 9.14+.902 451.71±82.62b 34.21±9.29 341.57±20.98° 7.98±,282 376.972.55 27.25+7.72 283.59±57.28-b 8.70±.89 2.3黄芪水煎剂对史氏鲟溶菌酶含量的影响 从表3可见给史氏鲟灌服黄芪水煎剂后,血浆中溶菌酶的量有所上升,B组上升的幅度最大,C组 上升幅度最小,肝脏中溶菌酶的变化趋势与血浆中相似;A组和B组鱼的胃、幽门垂、前肠及后肠的溶菌 酶量均有所上升,C组鱼这几种组织的溶菌酶量较对照组稍有下降。但各试验组与对照组的溶菌酶量 差异均不显著(P>0.05) 表3灌服不同剂量黄芪水煎剂后史氏鲟血浆及组织中溶菌酶含量的变化 Tab 3 Lysozyme con ten t n phsma and tissues of Am ur sturgeon by ora l adm n istra tion of aqueous kvetch root 组别血浆/(ug·g1) 肝 后肠 plsma caecum foregut hindgut 对照 38.6316.72244.7058.87241.64197.57569.78155.36640.%6±95.74629.33士52.7 52.45±1.88311.89±2.00283.6420.58814.39土70.47723.00±86,28694.59±85,20 40.55±1.54267.61150.15213.4417.12535.67±41.244319618.05540.79±98.04 3讨论 对史氏鲟采用灌服药液法,很容易确定鱼类饲料中黄芪的添加剂量及其作用效果,可避免由于 201994-2007ChinaAcademicJourmalElectroniePublishingHouse.Allrightsreservedhutp:/www.enkine
表 1 灌服不同剂量黄芪水煎剂后史氏鲟肝脏和血浆中 NO含量及 NOS酶活性的变化 Tab11 NO levels and No syn theta se ( NOS) activ ities in liver and pla sma of Am ur sturgeon dr ink ing d ifferen t dosages of aqueous extract of m em branous m ilkvetch root 组别 group 肝脏 liver NO / (μmol·g - 1 ) NOS/ (U·mg - 1 ) 血浆 p lasma NO / (μmol·L - 1 ) NOS/ (U·mL - 1 ) 对照 control 2176 ±1133 a 3171 ±0179 a 441175 ±107177 a 14148 ±4193 a A 3112 ±0182 ac 3175 ±0167 a 496195 ±58112 a 14143 ±1125 a B 5130 ±2129 bc 4193 ±1175 ab 512180 ±36158 a 16183 ±0158 a C 5168 ±1167 b 5151 ±0179 b 472144 ±65126 a 16103 ±2162 a 注 : 同一列数值上标有相邻字母者表示差异显著 ( P < 0105) , 标有相间字母者表示差异极显著 ( P < 0101)。下同。 Note: Values in the same column with adjacent superscrip ts are significantly different ( P < 0105) , with interval superscrip ts are extremely sig2 nificantly different ( P < 0101). 212 黄芪水煎剂对史氏鲟 SOD活性和 MDA含量的影响 由表 2可见 , 给史氏鲟灌服黄芪水煎剂后 , 其血浆及肝脏中的 SOD活性上升 , 其中 B组鱼血浆 及肝脏中的 SOD活性比对照组显著升高 ( P < 0105) , 其余两组的上升幅度不明显 ; 3组鱼血浆中的 MDA含量均明显降低 , 同对照组比较均有极显著的差异 ( P < 0101) , 肝脏中的 MDA含量也呈现下 降趋势 , 但与对照组比较无显著性差异 ( P > 0105)。 表 2 灌服不同剂量黄芪水煎剂后史氏鲟血浆及肝脏中 SOD酶活性和 MDA含量的变化 Tab12 Superox ide d ism uta se( SOD ) activ ities and ma lona ldehyde(MDA) levels in pla sma and liver of Am ur sturgeon dr ink ing d ifferen t dosages of aqueous extract of m em branous m ilkvetch root 组别 group 肝脏 liver SOD活性 activity / (U·mL - 1 ) MDA含量 content / (U·mg - 1 ) 血浆 p lasma SOD活性 activity / ( nmol·mL - 1 ) MDA含量 content / ( nmol·mg - 1 ) 对照 control 315136 ±57136 a 42164 ±23198 a 272128 ±75109 a 22125 ±7160 a A 361123 ±110167 ab 34177 ±16116 a 286196 ±34142 ab 9114 ±3190 c B 451171 ±82162 b 34121 ±19129 a 341157 ±20198 b 7198 ±2128 c C 376197 ±72155 ab 27125 ±17172 a 283159 ±57128 ab 8170 ±1189 c 213 黄芪水煎剂对史氏鲟溶菌酶含量的影响 从表 3可见 ,给史氏鲟灌服黄芪水煎剂后 ,血浆中溶菌酶的量有所上升 ,B组上升的幅度最大 , C组 上升幅度最小 ,肝脏中溶菌酶的变化趋势与血浆中相似 ; A组和 B组鱼的胃、幽门垂、前肠及后肠的溶菌 酶量均有所上升 , C组鱼这几种组织的溶菌酶量较对照组稍有下降。但各试验组与对照组的溶菌酶量 差异均不显著 ( P > 0105)。 表 3 灌服不同剂量黄芪水煎剂后史氏鲟血浆及组织中溶菌酶含量的变化 Tab13 Lysozym e con ten t in pla sma and tissues of Am ur sturgeon by ora l adm in istra tion of aqueous extract of m em branous m ilkvetch root μg/mL 组别 group 血浆 / (μg·g - 1 ) p lasma 肝 liver 胃 stomach 幽门垂 pyloric caecum 前肠 foregut 后肠 hindgut 对照 control 38163 ±6172 244170 ±58187 241164 ±97157 569178 ±55136 640196 ±195174 629133 ±152176 A 43192 ±6167 275167 ±34117 289193 ±131184 570173 ±10913 690149 ±26124 678113 ±96116 B 52145 ±11188 311189 ±92100 283164 ±120158 814139 ±170147 723100 ±186128 694159 ±185120 C 40155 ±11154 267161 ±50115 213144 ±117112 535167 ±141124 431196 ±98105 540179 ±198104 3 讨论 对史氏鲟采用灌服药液法 , 很容易确定鱼类饲料中黄芪的添加剂量及其作用效果 , 可避免由于饲 第 3期 刘红柏 ,等 : 黄芪对史氏鲟抗氧化能力及免疫力的影响 332
34 大连水产学院学报 第21卷 料散在水中不易确定摄入量及因史氏鲟的非抢食性摄食造成的饲料添加药物的浪费。黄芪是一种具有 双向免疫调节作用的物质,且对NO的生成也具有双向调节作用8。史氏鲟被灌服黄芪水煎剂后 A组鱼血浆中的NO及NOS虽呈上升趋势,但没有显著性变化,而B组和C组鱼肝脏中的NO则显著 上升,C组鱼的NOS活性也显著增强,表明黄芪水煎剂对鱼肝脏的影响较大,这可能与黄芪的作用 机理或给服方式有关,同时也表明NO在保护肝脏中能起到重要作用。Hogg等"指出,NO是一种链 式阻断剂,能抑制脂质过氧化,清除氧自由基。在生理条件下,cNOS合成适量的NO会对机体起保 护作用;但在病理条件下,由NOS合成大量的NO与氧自由基共同存在时,则对机体有损伤作 用。因此,wnk等提出,适量的NO能清除活性氧,过量的NO能抑制抗氧化系统,使机体的 过氧化损伤作用增强。本试验中,被灌服黄芪后史氏鲟的血浆及肝脏中NO及NOS的变化较为平缓, 说明黄芪可能起到了对抗氧自由基、增强ΔOS活性、抑制NOS的表达和促成NO大量生成的作用 NO易与超氧阴离子反应生成超氧化亚硝基阴离子,酸化后分解成为毒性很大的氧化剂羟自由基 和二氧化氮,因此,在抗感染中具有非特异性的杀伤力。但在这种情况下NO的生理功能受到阻滞 并导致组织损伤,此时SOD的存在就显得极为重要1。SOD能减少上述这种反应,在机体多种组织 器官中具有保护意义H。史氏鲟被灌服黄芪水煎剂后,SOD活性上升,说明黄芪具有抗氧化的作 用,对SOD的活性有促进作用。免疫添加剂的剂量对SOD活性的影响也很大。Eder等发现,给大 鼠投喂高剂量的维生素E后,其SOD的酶活力明显低于投喂低剂量维生素E的大鼠。本试验的结果 表明,黄芪对史氏鲟SOD的作用也为剂量依赖,即不同剂量的黄芪使SOD活性升高的幅度不同,其 中B组试验鱼血浆及肝脏中SOD的酶活性最高,与对照组差异显著。 SOD酶活性的升高有助于减少脂质过氧化物的生成。本试验结果显示,黄芪水煎剂明显降低了 脂质过氧化产物MDA的产生,各试验组鱼的血浆和肝脏中的MDA含量均较对照组降低,且血浆中 有极显著的下降。尽管有研究发现,MDA的降低并不总是与抗氧化酶活性的升高相一致,但黄芪 这种能降低机体内MDA的含量、提高SOD酶活性的作用,说明它对机体的影响是有益的 ∞OD、MDA及NO三者在机体的抗氧化和免疫保护方面有着密切的关系。小鼠砷中毒后,肝脏中 MDA含量升高,而SOD及NO的生成降低,服用竹节荪提取液后,SOD活性及NO的含量升高,而 MDA的含量则下降;疲劳大鼠服用中药口服液后,血中MDA含量明显降低,而9OD酶活性和NO 的含量则升高1。这与本试验的结果相同。 有研究表明,黄芪中的总黄酮和总皂甙具有良好的清除氧自由基的作用,而总多糖有部分清 除氧自由基的作用,其作用强度与浓度呈反比。本试验中很可能是黄芪多糖的这种作用,造成了史氏 鲟NO、SOD及MDA的变化与黄芪水煎剂的灌服剂量不成正比。 Paulsen等0认为,溶菌酶的量和活性变化是由于免疫物质刺激巨噬细胞分化导致溶菌酶基因的 复制。本试验中,选择血浆和主要的消化组织进行检测,尽管黄芪对史氏鲟溶菌酶量的影响效果不显 著,但结果显示,灌服黄芪可以使溶菌酶的量发生一定的变化且与剂量相关。 alerton等在观察虹 鳟免疫反应时,发现在添加剂的免疫调节中消化道局部免疫反应比系统免疫反应的变化大。因此,测 定消化道内的免疫因子,尤其是测定溶菌酶的水平和活性对于研究黄芪的免疫调节作用具有重要意 义 C lenton等l给虹鳟投喂维生素E时也发现,当饲料中维生素E的添加剂量为295mg/kg时,血 清中溶菌酶的活性下降;当添加剂量降低到28mg/kg时,溶菌酶的活性上升,这说明添加剂量对免 疫指标的影响非常重要。本试验的结果也显示,黄芪的剂量过高并没有使鱼体内溶菌酶的含量升高, 反而降低,表明不同的中药添加剂量可以产生不同甚至作用相反的效果 参考文献 1]杜光,王丽黄芪的免疫药理作用研究进展[J]时珍国医国药,2001,12(10):953954 王润田,单保恩,李巧霞,等黄芪提取物免疫调节活性的体外实验研究[J中国中西医结合杂志, 3]李宏全,段县平,马海利,等.黄芪多糖提高鸡抗氧化作用对免疫功能的影响[山西农业大学学报,2002,22(1):78-81 91994-2007chinaAcademicJOurnalElectronicPublishingHousealLrightsreservedhttp://www.cnki.net
料散在水中不易确定摄入量及因史氏鲟的非抢食性摄食造成的饲料添加药物的浪费。黄芪是一种具有 双向免疫调节作用的物质 , 且对 NO的生成也具有双向调节作用 [ 7 - 8 ]。史氏鲟被灌服黄芪水煎剂后 , A组鱼血浆中的 NO及 NOS虽呈上升趋势 , 但没有显著性变化 , 而 B组和 C组鱼肝脏中的 NO则显著 上升 , C组鱼的 NOS活性也显著增强 , 表明黄芪水煎剂对鱼肝脏的影响较大 , 这可能与黄芪的作用 机理或给服方式有关 , 同时也表明 NO在保护肝脏中能起到重要作用。Hogg等 [ 9 ]指出 , NO是一种链 式阻断剂 , 能抑制脂质过氧化 , 清除氧自由基。在生理条件下 , cNOS合成适量的 NO会对机体起保 护作用 ; 但在病理条件下 , 由 iNOS合成大量的 NO 与氧自由基共同存在时 , 则对机体有损伤作 用 [ 10 ]。因此 , W ink等 [ 11 ]提出 , 适量的 NO能清除活性氧 , 过量的 NO能抑制抗氧化系统 , 使机体的 过氧化损伤作用增强。本试验中 , 被灌服黄芪后史氏鲟的血浆及肝脏中 NO及 NOS的变化较为平缓 , 说明黄芪可能起到了对抗氧自由基、增强 cNOS活性、抑制 iNOS的表达和促成 NO大量生成的作用。 NO易与超氧阴离子反应生成超氧化亚硝基阴离子 , 酸化后分解成为毒性很大的氧化剂羟自由基 和二氧化氮 , 因此 , 在抗感染中具有非特异性的杀伤力。但在这种情况下 NO的生理功能受到阻滞 , 并导致组织损伤 , 此时 SOD的存在就显得极为重要 [ 12 ]。SOD能减少上述这种反应 , 在机体多种组织 器官中具有保护意义 [ 13 - 14 ]。史氏鲟被灌服黄芪水煎剂后 , SOD活性上升 , 说明黄芪具有抗氧化的作 用 , 对 SOD的活性有促进作用。免疫添加剂的剂量对 SOD活性的影响也很大。Eder等 [ 15 ]发现 , 给大 鼠投喂高剂量的维生素 E后 , 其 SOD的酶活力明显低于投喂低剂量维生素 E的大鼠。本试验的结果 表明 , 黄芪对史氏鲟 SOD的作用也为剂量依赖 , 即不同剂量的黄芪使 SOD活性升高的幅度不同 , 其 中 B组试验鱼血浆及肝脏中 SOD的酶活性最高 , 与对照组差异显著。 SOD酶活性的升高有助于减少脂质过氧化物的生成。本试验结果显示 , 黄芪水煎剂明显降低了 脂质过氧化产物 MDA的产生 , 各试验组鱼的血浆和肝脏中的 MDA含量均较对照组降低 , 且血浆中 有极显著的下降。尽管有研究发现 , MDA的降低并不总是与抗氧化酶活性的升高相一致 [ 16 ] , 但黄芪 这种能降低机体内 MDA的含量、提高 SOD酶活性的作用 , 说明它对机体的影响是有益的。 SOD、MDA及 NO三者在机体的抗氧化和免疫保护方面有着密切的关系。小鼠砷中毒后 , 肝脏中 MDA含量升高 , 而 SOD及 NO的生成降低 , 服用竹节荪提取液后 , SOD活性及 NO的含量升高 , 而 MDA的含量则下降 [ 17 ] ; 疲劳大鼠服用中药口服液后 , 血中 MDA含量明显降低 , 而 SOD酶活性和 NO 的含量则升高 [ 18 ]。这与本试验的结果相同。 有研究表明 [ 19 ] , 黄芪中的总黄酮和总皂甙具有良好的清除氧自由基的作用 , 而总多糖有部分清 除氧自由基的作用 , 其作用强度与浓度呈反比。本试验中很可能是黄芪多糖的这种作用 , 造成了史氏 鲟 NO、SOD及 MDA的变化与黄芪水煎剂的灌服剂量不成正比。 Paulsen等 [ 20 ]认为 , 溶菌酶的量和活性变化是由于免疫物质刺激巨噬细胞分化导致溶菌酶基因的 复制。本试验中 , 选择血浆和主要的消化组织进行检测 , 尽管黄芪对史氏鲟溶菌酶量的影响效果不显 著 , 但结果显示 , 灌服黄芪可以使溶菌酶的量发生一定的变化且与剂量相关。Clerton等 [ 21 ]在观察虹 鳟免疫反应时 , 发现在添加剂的免疫调节中消化道局部免疫反应比系统免疫反应的变化大。因此 , 测 定消化道内的免疫因子 , 尤其是测定溶菌酶的水平和活性对于研究黄芪的免疫调节作用具有重要意 义。 Clerton等 [ 21 ]给虹鳟投喂维生素 E时也发现 , 当饲料中维生素 E的添加剂量为 295 mg/kg时 , 血 清中溶菌酶的活性下降 ; 当添加剂量降低到 28 mg/kg时 , 溶菌酶的活性上升 , 这说明添加剂量对免 疫指标的影响非常重要。本试验的结果也显示 , 黄芪的剂量过高并没有使鱼体内溶菌酶的含量升高 , 反而降低 , 表明不同的中药添加剂量可以产生不同甚至作用相反的效果。 参考文献 : [ 1 ] 杜光 ,王丽. 黄芪的免疫药理作用研究进展 [J ]. 时珍国医国药 , 2001, 12 (10) : 953 - 954. [ 2 ] 王润田 ,单保恩 ,李巧霞 ,等. 黄芪提取物免疫调节活性的体外实验研究 [J ]. 中国中西医结合杂志 , 2002, 22 (6) : 453 - 456. [ 3 ] 李宏全 ,段县平 ,马海利 ,等. 黄芪多糖提高鸡抗氧化作用对免疫功能的影响 [J ]. 山西农业大学学报 , 2002, 22 (1) : 78 - 81. 432 大 连 水 产 学 院 学 报 第 21卷
第3期刘红柏,等:黄芪对史氏鲟抗氧化能力及免疫力的影响 4]段铭,冯现伟,高宏伟等.复方中草药添加剂饲喂鲫鱼试验[J]饲料研究,199012:28-29 [5] JN J, wU Z Influences of traditional Chinese med c ine on non- specific mmunity of Jian Carp( Cyprinus carpio var Jian)[]. Fish Shellfish mmunoL, 2004, 16(2): 185-191. 6]刘红柏,张颖,杨雨辉等.五种中草药作为饲料添加剂对鯉肠内细菌及生长的影响[大连水产学院学报,2004,19(1):16-20 7]张奕华,任勇,彭司勋中药对一氧化氮的影响研究[J]中国中药杂志,2001,26(2):75·79 8]程富胜胡庭俊梁纪兰,等.黄芪多糖对小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮生成的影响[J中国兽医医药杂志,2001(3):3-5 [9] HOGGN, STRUCK A, GOSS S P, et al hhibition of macrophage- dependent bw density l pop rote in oxidaton by nitric oxide donors [J] J Lpid Res,1995,36(8):1756 10]刘艳,吴伟康,杨成梯,等.从氧自由基,氧化氮探讨四逆汤抗急性失血性体克的肝脏机制[]中国病理生理杂志,2003,19(6) [11 WNKDA, MCHEL JB Chem ical boby of nitric oxide: insight nb regulabry, cytOxic, and cytop otective mechanisms of nitric ox ide [J]. Free Radic B olMed, 1998, 25: 434-456 12]孙蔚细胞外超氧岐化酶对一氧化氮生物活性调节的研究[J]国外医学泌尿系统分册,1997,17(5):220-224 [13] MCH IELS C, RAESM, IOUSSA NTO, et al mportance of Se-glutath one per-oxidase, catalase and CulZn- SOD for cell against oxidative stress[J Free Radical B o Med, 1994, 17: 235-& [14] WNSION GW, DIGUL D RT Oxidant and antixidant mechanim in aquatic organism[J]. Aquat Toxicol, 1991, 24: 143-152 [15 EDER K, FLADER D, HRCHE F, et al Excess dietary vitam in E lowers the activities of antioxidative enzymes in erythOcytes of rats fed mon oil[ JI J Nutr,200,132(11):3400 [16] MARTNEZ- ALVAREZ R M, HDALGO M C, DOMEZAN A, et al Physobgical changes of sturgeon Acipenser naccarii caused by in creasing envionmental salinity[J). J Exp B DL, 2002, 205: 3699-3706 17]罗鹏吴应宽,蒋宪瑶等竹节荪提取液对砷中毒小鼠肝脏的保护作用[J贵阳医学院学报,2003,28(5):402-404 18]陈立翠,刘贤武,林月景.等劲力康口服液对疲劳大鼠MDA,SD,NO含量的影响实验研究[J]成都中医药大学学报,2001,24 (4):45-46 19]汪德清,沈文梅,田亚平,等黄芪的三种提取成分对氧自由基作用的影响[J]中国药理学通报,1994,10(2):129-133 [20] PAULSEN SM, ENGSTAD R E, ROB ERTSEN B. Enhanced lysozyme productin in A tlantic samon( Saho salarL )macrophages trea- sh ImmunoL,2001,1l(1):23-37 [21 CLERTON P, TROU TAUD D, VERLHAC V, et al D etary vitam in E and rainbow tiout (Oncorhynchus m kiss) phagocyte functons effect on gut and on head kidney leucocytes]. Fish Shellfish mmuno1, 2001, 11(1): 1-13 Effects of the aqueous extract of a stra ga lus root astraga lus mem branaceus on mm un ity and an tiox ida tion n amur sturgeon(Acipenser schrencki Brandt) L U Hong-bai, LU Tong yan, ZHANG Chun-yan, SUN Da-jiang, BA IXiu-juan (1. Northeast Agriculture University, Harbin 150030, Chna, 2 Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Ch nese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China; 3 Heibngjang Traditinal Chinese Medical University, Harbin 150030, China) Abstract Effects of aqueous extract of rad ix A stragalus m an branaceus Fisch on mm unity and antioxidation of I year old Amur sturgeon (A cipenser schrencki B randt) were stud ied by oral perfusion The sturgeon were oral- ly perfused aqueous extracts fiom A stragalus oot at a rate of 0. 5%( Group A),1.0%( Group B )and 20% Group C)of diet and distilled water at a rate of o 3 mL /100 g body weight( Goup d)once a day, respec tively The results showed that lysozyme level in p lasma and diffe rent tissues increased in Group A and Group B, and changed in Group C, but statistically there were no significant There were no significant differences in nitrogen monoxide (NO)and nitrogen monoxide synthetase(NOS) levels in p lama in all goups In hepato- pancrease in Goup B and Goup C, however, NO levels were significantly higher than that in Group D. NOS level in hepatopancreas was significantly higher than that in Group D. The fish in Group B had higher super oxide dismutase( SOD) than that in Goup D Key words: A stragalus oot Amur sturgeon; mm unity, antioxidation 91994-2007ChinaAcademicjOumaleLectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.enki.net
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