中国水产科学：《水产药物恩诺沙星》大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定

第14卷第6期 中国水产科学 Vol 14 2007年11月 Journal of fishery sciences of china November 大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定 王翔凌杨先乐12,林茂3喻文娟',张宁,张书俊 (1.上海水产大学农业部渔业动植物病原库,上海200090;2.上海高校水产养殖学E研究院,上海200090;3.集美大学水 产学院,福建厦门361021) 摘要:建立了反相高效液相色谱法检测大口黑鲈( Micropterus salmoides)原代肝细胞中恩诺沙星( rofloxacin,EF)代谢 情况的方法,并通过其代谢产物环丙沙星 Cinrofloxacin,CF)来间接反映恩诺沙星N·脱乙基酶的活性。采用二氯甲烷 提取细胞中的药物,正己烷脂,反相高效液相色谱法测定其中的药物浓度。经测得该方法样品回收率均大于 80.28%,日间变异系数小于5.54%,通过EF与大口黑鲈肝细胞进行孵育,发现EF在细胞中的消除方程为C 50e000°,消除半衰期(T2)为86.63h,消除速率常数(K为8×104/h。对孵育过程中的酶活研究发现最佳孵育时 间为45mn,其酶活性为0.25ug/( min mg),酶动力学参数中最大反应速率(m)为0.29ug( min img),米氏常数(Kn) 为22.37μg/mL,内在清除率(clm)为0.01mL/( min .mg)。结果表明,该酶与底物结合力不强,酶促反应强度较弱,EF 在大口黑鲈肝细胞中的代谢较缓慢。[中国水产科学,2007,14(6):1004-1009] 关键词:大口黑鲈;,肝细胞;恩诺沙星;反相高效液相色谱法;消除;酶活 中图分类号:S94 文献标识码:A 文章编号:1005-8737(2007)06·1004·06 细胞色素P450是肝微粒体混合功能氧化酶中诺酮类药物,由于其广谱抗菌特性,曾在兽医和水产 最重要的一族在外源性和内源性物质代谢中起着上得到了广泛的应用51。目前该药由于其残留问 极其重要的作用1-21。恩诺沙星( Enrofloxacin,EF)题,在有些水产动物体内已被禁用,因此关于该药在 的代谢反应为典型的P450酶代谢反应,代谢酶水产动物体内的代谢及消除问题已经引起了人们的 为N脱乙基酶,其主要活性代谢产物为环丙沙星重视。 ( Ciprofloxacin,CF)(图1)14。EF作为第三代氟喹 EF(Mw3594) CF(Mw331.3) 图1EF的氧化脱乙基 Fig. 1 Oxidative deet hylation of EF 目前对药物残留问题的研究主要是通过其在动定P450酶活性的报道多数是以肝微粒体为反应体 物体内的代谢情况来反应,EF在家禽、家畜以及海系8,但用靶动物大口黑鲈的肝细胞进行药物代 水鲈体内的代谢研究已有报道3-6,而在体外研究谢的研究尚未见报道。在细胞中研究药物代谢及相 EF的代谢及其代谢酶的活性从而能够省时经济地关酶活能够排除体内各种因素对该研究的影响,全 反应药物的残留状况目前尚未见报道。有关体外测面真实地反应药物代谢,因此本实验用反相高效 收稿日期:2007-04-21;修订日期2007-07-20 基金项目:国家自然科学基金项目(30371109);上海市教委E-研究院建设资助项目(E03009);上海市重点学科建设资助项目(Y01) 作者简介:王翔凌(1979-),女,博士研究生,主要从事水产动物疾病与药理学研究.Te:021-65710870,Emal: nancywxl@eyou.om 通讯作者杨先乐.e:021-65710503;Emal:xiyang@shu.edu.cn 1994-2009ChinaAcademicJOunalElectronicpUblishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net

大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定 王翔凌 ,杨先乐1 ,2 ,林茂3 ,喻文娟1 ,张宁1 ,张书俊1 (11 上海水产大学农业部渔业动植物病原库 ,上海 200090 ; 21 上海高校水产养殖学 E2研究院 ,上海 200090 ; 31 集美大学水 产学院 ,福建 厦门 361021) 摘要 :建立了反相高效液相色谱法检测大口黑鲈 ( Micropterus salmoides) 原代肝细胞中恩诺沙星 ( Enrofloxacin , EF) 代谢 情况的方法 ,并通过其代谢产物环丙沙星(Ciprofloxacin ,CF) 来间接反映恩诺沙星 N - 脱乙基酶的活性。采用二氯甲烷 提取细胞中的药物 ,正己烷去脂 ,反相高效液相色谱法测定其中的药物浓度。经测得该方法样品回收率均大于 80128 % ,日间变异系数小于 5154 %。通过 EF 与大口黑鲈肝细胞进行孵育 ,发现 EF 在细胞中的消除方程为 C = 50e - 01000 8 t ,消除半衰期( T1/ 2 ) 为 86163 h ,消除速率常数( K) 为 8 ×10 - 4 / h。对孵育过程中的酶活研究发现最佳孵育时 间为 45 min ,其酶活性为 0125μg/ (min·mg) ,酶动力学参数中最大反应速率( V max ) 为 0129μg/ (min·mg) ,米氏常数( Km) 为 22137μg/ mL ,内在清除率( Clint ) 为 0101 mL/ (min·mg) 。结果表明 ,该酶与底物结合力不强 ,酶促反应强度较弱 , EF 在大口黑鲈肝细胞中的代谢较缓慢。[中国水产科学 ,2007 ,14 (6) :1 004 - 1 009 ] 关键词 :大口黑鲈 ;肝细胞 ;恩诺沙星 ;反相高效液相色谱法 ;消除 ;酶活 中图分类号 :S94 文献标识码 :A 文章编号 :1005 - 8737 - (2007) 06 - 1004 - 06 收稿日期 :2007 - 04 - 21 ; 修订日期 :2007 - 07 - 20. 基金项目 :国家自然科学基金项目(30371109) ;上海市教委 E - 研究院建设资助项目( E03009) ;上海市重点学科建设资助项目( Y1101) . 作者简介 :王翔凌(1979 - ) ,女 ,博士研究生 ,主要从事水产动物疾病与药理学研究. Tel :021 - 65710870 ,E2mail :nancywxl @eyou. com 通讯作者 :杨先乐. Tel :021 - 65710503 ; E2mail :xlyang @shfu. edu. cn 细胞色素 P450 是肝微粒体混合功能氧化酶中 最重要的一族 ,在外源性和内源性物质代谢中起着 极其重要的作用[1 - 2 ] 。恩诺沙星( Enrofloxacin ,EF) 的代谢反应为典型的 P450 酶代谢反应[3 ] ,代谢酶 为 N2脱乙基酶 ,其主要活性代谢产物为环丙沙星 (Ciprofloxacin ,CF) (图 1) [4 ] 。EF 作为第三代氟喹 诺酮类药物 ,由于其广谱抗菌特性 ,曾在兽医和水产 上得到了广泛的应用[5 ] 。目前该药由于其残留问 题 ,在有些水产动物体内已被禁用 ,因此关于该药在 水产动物体内的代谢及消除问题已经引起了人们的 重视。 图 1 EF 的氧化脱乙基 Fig11 Oxidative deethylation of EF 目前对药物残留问题的研究主要是通过其在动 物体内的代谢情况来反应 , EF 在家禽、家畜以及海 水鲈体内的代谢研究已有报道[3 - 6 ] ,而在体外研究 EF 的代谢及其代谢酶的活性从而能够省时经济地 反应药物的残留状况目前尚未见报道。有关体外测 定 P450 酶活性的报道多数是以肝微粒体为反应体 系[7 - 8 ] ,但用靶动物大口黑鲈的肝细胞进行药物代 谢的研究尚未见报道。在细胞中研究药物代谢及相 关酶活能够排除体内各种因素对该研究的影响 ,全 面真实地反应药物代谢 ,因此本实验采用反相高效 第 14 卷第 6 期 2 0 0 7 年 1 1 月 中 国 水 产 科 学 Journal of Fishery Sciences of China Vol. 14 No. 6 November 2007

王翔凌等:大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定 液相色谱(RP-HPLC)法测定了抗菌药物EF在大20μ进样,进行HPLC测定 口黑鲈( Micropterus salmo des)肝细胞中代谢情况1.5定量方法的建立 从而间接反映代谢酶的活性,并建立了N脱乙基酶1.5.1标准曲线的制备及线性范围的测定将 的基础酶活模型,同时该研究也能够为该酶所属的系列不同浓度的EF或CF标准液依次加入到各空 PA450家族或亚家族的酶活研究提供理论基础,为水白细胞中制得含药物质量浓度分别为0.020.05 产品的药物残留监控提供理论基础,对该酶的实际0.10.52.5、5、10、20、50、100、200μg/mL的细胞 应用方面具有一定的指导意义 样品,按1.4中所述方法制样,进行HPLC检测 1材料和方法 以药物标准品在空白样品中的质量浓度(C)为横 坐标,以药物峰面积(A1)为纵坐标,分别绘制EF和 1.1材料 CF在细胞中的标准曲线并且得出回归方程,根据各 大口黑鲈原代肝细胞,由本实验室(双业部渔业样品标准曲线的相关系数估计细胞样品中EF和 动植物病原库)其他人员协助提供,以M199与L15CF定量的线性范围 混合培养基(1:1)置于28℃5%O2下培养 1.5.2最低检测限(LOD)的测定将细胞样品标 1.2药品及试剂 准曲线范围内的最低浓度的EF和CF标准液依次 EF标准品(含量98%,CF标准品(含量稀释成呈梯度降低的一系列标准液并加入到空白细 99.03%),均由 SIGMA公司提供;二氯甲烷、正己胞样品中,按1.4中所述方法制样,进行HPLC检 烷、四丁基溴化铵、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢测。以信噪比≥的最低浓度作为样品中EF和CF 钠、磷酸、肝素钠等均为国产分析纯,由中国医药集的最低检测限(LOD) 团上海化学试剂有限公司提供;乙腈为美国 Fisher1.5.3回收率和变异系数的测定取空白样品,添 色谱纯 加适量药物标准液,配制成分别含EF或CF浓度为 1.3高效液相色谱仪及色谱条件 0.0220200ug/m的细胞样品,日内每个浓度设 gilet 10型高效液相色谱(HPC)仪(色谱柱置5个样品(日内),在不同时间重复以上操作5次 类型: ZORBAX SBC184.6×150mm,um,);可变波(日间),进行HPLC检测。分别求得细胞样品中EF 长紫外检测器;流动相记乙腈讠H7.4磷酸钠缓冲液或CF峰面积A,可得日内变异系数( Intra-day 含0.5%四丁基溴化铵)=595(V/V),用珏PO4调CV)和日间变异系数(nter- day Cv)。同时将 pH至3.0,过滤脱气后现用;流速1.0mL/min;柱温定量的标准液用流动相配成对应的水平做HPLC 40℃;紫外检测波长276nm;进样量20叫 分析,可得以上6种浓度的EF或CF标准液的峰面 1.4制样方法 积(B)。根据公式AB×100%即可得各空白样品 取细胞,倒掉培养基,用 D- Hank’s液轻洗细胞中添加EF或CF的回收率( Recovery)。 2~3次,不要破坏细胞层。将细胞轻轻吹打后用D1.6大口黑鲈原代肝细胞中恩诺沙星的代谢及脱 Hank's液稀释成一定浓度,计数。参考王翔凌等乙基酶活的测定 所报道的该类药物的提取方法,取1mL该细胞于离1.6.1大口黑鲈原代肝细胞的获取参照文献 心管中加入一定量的所需浓度的EF或CF将制得的[10]的方法,待培养的大口黑鲈原代肝细胞状态良好 细胞样品于漩涡混合器上混合2min,再根据所取细时,倒掉原有的培养基,用pH7.4的BS缓冲液清洗 胞量按14(V/V)分别加入二氯甲烷,混合2min,液2~3遍刮取细胞加入适量PBS缓冲液,500r/min 体快速混合器上中速混合10min,8000r/min离心离心5mn,弃上层,下层用pH74的缓冲液将细胞 10min,弃去上层水相,将下层有机相倒入7mL具稀释到密度约2×10° ind/ mL,即可用于实验。 塞离心管中,将残渣再次加入以上试剂,试剂量减1.6.2恩诺沙星的体外温孵实验在状态良好的 半,重复以上操作步骤,进行第二次萃取,合并两次大口黑鲈原代肝细胞中加入EF的标准品,使其终 有机相,用样品蒸干仪在45℃恒温中蒸干。蒸残物浓度为50μgmL,37℃摇床振荡,分别孵育0、15、 用0.5mL流动相溶解,漩涡混合器上混匀2min,30456090min;另取细胞与浓度为5、10、20、50、 加入1mL正己烷去脂,液体快速混合器上混匀100ug/mL的EF共孵育45min。每点设5个平行 l0min,8000r/min离心l0min,吸取下层液体样,按1.4中所述方法制样,测得孵育后EF和CF 1994-2009ChinaAcademicJOurmalElectronicPublishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net

液相色谱(RP - HPLC) 法测定了抗菌药物 EF 在大 口黑鲈 ( Micropterus sal moi des) 肝细胞中代谢情况 从而间接反映代谢酶的活性 ,并建立了 N2脱乙基酶 的基础酶活模型 ,同时该研究也能够为该酶所属的 P450 家族或亚家族的酶活研究提供理论基础 ,为水 产品的药物残留监控提供理论基础 ,对该酶的实际 应用方面具有一定的指导意义。 1 材料和方法 111 材料 大口黑鲈原代肝细胞 ,由本实验室(农业部渔业 动植物病原库) 其他人员协助提供 ,以 M199 与 L15 混合培养基(1∶1) 置于 28 ℃、5 %CO2下培养。 112 药品及试剂 EF 标 准 品 (含 量 98 %) , CF 标 准 品 (含 量 99103 %) ,均由 SIGMA 公司提供 ;二氯甲烷、正己 烷、四丁基溴化铵、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢 钠、磷酸、肝素钠等均为国产分析纯 ,由中国医药集 团上海化学试剂有限公司提供 ;乙腈为美国 Fisher 色谱纯。 113 高效液相色谱仪及色谱条件 Agilent 1100 型高效液相色谱(HPLC) 仪(色谱柱 类型:ZORBAX SB2C18 ,416 ×150 mm ,5μm ,) ;可变波 长紫外检测器;流动相∶乙腈∶pH 714 磷酸钠缓冲液 (含 015 %四丁基溴化铵) = 5∶95 (V/ V) ,用 H3PO4调 pH 至 310 ,过滤脱气后现用;流速 110 mL/ min ;柱温 40 ℃;紫外检测波长 276 nm;进样量20μL。 114 制样方法 取细胞 ,倒掉培养基 ,用 D2Hank’s 液轻洗细胞 2～3次 ,不要破坏细胞层。将细胞轻轻吹打后用 D2 Hank’s 液稀释成一定浓度 ,计数。参考王翔凌等[9 ] 所报道的该类药物的提取方法 ,取 1 mL 该细胞于离 心管中加入一定量的所需浓度的 EF 或 CF ,将制得的 细胞样品于漩涡混合器上混合 2 min ,再根据所取细 胞量按 1∶4 (V/ V) 分别加入二氯甲烷 ,混合2 min ,液 体快速混合器上中速混合 10 min ,8 000 r/ min 离心 10 min ,弃去上层水相 ,将下层有机相倒入 7 mL 具 塞离心管中 ,将残渣再次加入以上试剂 ,试剂量减 半 ,重复以上操作步骤 ,进行第二次萃取 ,合并两次 有机相 ,用样品蒸干仪在 45 ℃恒温中蒸干。蒸残物 用 015 mL 流动相溶解 ,漩涡混合器上混匀 2 min , 加入 1 mL 正己烷去脂 ,液体快速混合器上混匀 10 min ,8 000 r/ min 离心 10 min , 吸取下层液体 20μL 进样 ,进行 HPLC 测定。 115 定量方法的建立 11511 标准曲线的制备及线性范围的测定 将一 系列不同浓度的 EF 或 CF 标准液依次加入到各空 白细胞中 ,制得含药物质量浓度分别为 0102、0105、 011、015、215、5、10、20、50、100、200μg/ mL 的细胞 样品 ,按 114 中所述方法制样 ,进行 HPLC 检测。 以药物标准品在空白样品中的质量浓度 ( Ci ) 为横 坐标 ,以药物峰面积( A i ) 为纵坐标 ,分别绘制 EF 和 CF 在细胞中的标准曲线并且得出回归方程 ,根据各 样品标准曲线的相关系数估计细胞样品中 EF 和 CF 定量的线性范围。 11512 最低检测限( LOD) 的测定 将细胞样品标 准曲线范围内的最低浓度的 EF 和 CF 标准液依次 稀释成呈梯度降低的一系列标准液并加入到空白细 胞样品中 ,按 114 中所述方法制样 ,进行 HPLC 检 测。以信噪比 ≥3 的最低浓度作为样品中 EF 和 CF 的最低检测限(LOD) 。 11513 回收率和变异系数的测定 取空白样品 ,添 加适量药物标准液 ,配制成分别含 EF 或 CF 浓度为 0102、20、200μg/ mL 的细胞样品 ,日内每个浓度设 置 5 个样品(日内) ,在不同时间重复以上操作 5 次 (日间) ,进行 HPLC 检测。分别求得细胞样品中 EF 或 CF 峰面积 A ,可得日内变异系数 ( Intra - day CV) 和日间变异系数 ( Inter - day CV) 。同时将一 定量的标准液用流动相配成对应的水平做 HPLC 分析 ,可得以上 6 种浓度的 EF 或 CF 标准液的峰面 积(B) 。根据公式 A/ B ×100 %即可得各空白样品 中添加 EF 或 CF 的回收率(Recovery) 。 116 大口黑鲈原代肝细胞中恩诺沙星的代谢及脱 乙基酶活的测定 11611 大口黑鲈原代肝细胞的获取 参照文献 [10 ]的方法 ,待培养的大口黑鲈原代肝细胞状态良好 时 ,倒掉原有的培养基 ,用 pH 714 的 PBS缓冲液清洗 2～3 遍 ,刮取细胞 ,加入适量 PBS 缓冲液 ,500 r/ min , 离心 5 min ,弃上层 ,下层用 pH 714 的缓冲液将细胞 稀释到密度约 2 ×10 6 ind/ mL ,即可用于实验。 11612 恩诺沙星的体外温孵实验 在状态良好的 大口黑鲈原代肝细胞中加入 EF 的标准品 ,使其终 浓度为 50μg/ mL ,37 ℃摇床振荡 ,分别孵育 0、15、 30、45、60、90 min ;另取细胞与浓度为 5、10、20、50、 100μg/ mL 的 EF 共孵育 45 min。每点设 5 个平行 样 ,按 114 中所述方法制样 ,测得孵育后 EF 和 CF 第 6 期 王翔凌等 :大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定 1005

1006 中国水产科学 第14卷 的峰面积,每个时间点设5个平行样,按1.4中所述式为 方法制样,进行HPC检测,根据标准曲线计算EF ⊥_Km Clint= 和CF浓度。 Lowry法l测定细胞中蛋白含量,则 EF脱乙基酶的活性以酶促反应速率,即每mg蛋白 其中Km为米氏常数,Vmx为最大反应速率 单位时间内的CF生成量[g/( min mg)]表示。 m为内在清除率 1.7数据处理 2结果与分析 数据处理中利用SPSS(11.5)进行显著性分析 采用 one- way anovA(单因素方差分析)中的Dum2.1色谱条件的确定 can检验进行多重比较,当P<0.05时认为差异显 优化流动相组成、pH和流速等条件后,EF和 著。消除方程采用C=Coe-k公式经非线性过程CF药物峰峰形较好且能完全分离,并且与杂质峰完 处理,C表示药物浓度,C0表示初始浓度,k表示消全分开。CF保留时间在4.91mn左右,EF保留时 除速率常数。药酶反应动态图采用 Excel软件绘间在6.73min左右,空白样品提取液在上述保留时 制;参照林茂等121所采用的 LineweaverBurk方程间无干扰峰出现(图2)。 式作图反映药酶动力学,并计算酶动力学参数,其公 Norm 120 保留时间/ min Retention time 保留时间/ min Retention time 保留时间/ min Retention time 图2恩诺沙星(EF)及环丙沙星(CP在大口黑鲈肝细胞中的色谱图 A:空白细胞提取液B:含EF10gm的细胞提取液;C:EF与细胞孵育45min Fig 2 HPLC chromatogram for EF and CF in Micropterus salmoides hepatocytes A: HPLC chromatogram from cells free of EF and CF; B: HPLC chromatogram of EF (1OWg/ mL) extracted from cell C: HPLC chromatogram of EF incubated with cell for 45 minutes 2.2定量方法 的LOD为0.05ugmL,CF在细胞中的LOD为 2.2.1标准曲线及线性范围标准曲线的药物浓0.02ug/mL。 度线性范围、回归方程及相关系数如下(A1表示药2.2.3回收率和变异系数按1.4制样方法操作 物与内标峰面积比,C1表示药物标准品在空白细胞后,由表1可见。测得各样品中平均回收率均大于 中的浓度):EF0.02~200ug/mL,A1=140.13C-(80.28±4.44)%,测得的日内变异系数不大于 5748,R=0.9999;CF0.02~200ug/m,A1=5.13%,日间变异系数不大于5.54%。所得数据表 9578C-93.15,R=0.9998 明此方法的重现性好,精密度高。 222最低检测限(LOD)经测得EF在细胞中 表1空白细胞中添加EF和CF时回收率及变异系数 Tab. I Recoveries and CV of EF and CF to Micropterus salmoides Hepatocytes n=5:X+SD; CE 质量浓度 回收率 异系数 变异系数CV (ug mL) 日内 日间 回收率 日内 日间 Reoovery rate Recovery rate 82.70±.44 80.28±4.4 5.13 83.19±4.37 85.88±4 91.54+424 4.63 90,73+3.60 3.97 o1994-2009ChinaAcademicjOUrmalElectronicPublishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net

的峰面积 ,每个时间点设 5 个平行样 ,按 114 中所述 方法制样 ,进行 HPLC 检测 ,根据标准曲线计算 EF 和 CF 浓度。Lowry 法[11 ]测定细胞中蛋白含量 ,则 EF 脱乙基酶的活性以酶促反应速率 ,即每 mg 蛋白 单位时间内的 CF 生成量[μg/ (min·mg) ]表示。 117 数据处理 数据处理中利用 SPSS(1115) 进行显著性分析 , 采用 one2way ANOVA (单因素方差分析) 中的 Dun2 can 检验进行多重比较 ,当 P < 0105 时认为差异显 著。消除方程采用 Ci = C0 e - k t公式经非线性过程 处理 , Ci表示药物浓度 , C0表示初始浓度 ,k 表示消 除速率常数。药酶反应动态图采用 Excel 软件绘 制 ;参照林茂等[12 ]所采用的 Lineweaver2Burk 方程 式作图反映药酶动力学 ,并计算酶动力学参数 ,其公 式为 : 1 V = Km V max × 1 [ S ] + 1 V max , Clint = V max Km 其中 Km 为米氏常数 , V max为最大反应速率 , Clint为内在清除率。 2 结果与分析 211 色谱条件的确定 优化流动相组成、p H 和流速等条件后 , EF 和 CF 药物峰峰形较好且能完全分离 ,并且与杂质峰完 全分开。CF 保留时间在 4191 min 左右 ,EF 保留时 间在 6173 min 左右 ,空白样品提取液在上述保留时 间无干扰峰出现(图 2) 。 图 2 恩诺沙星( EF) 及环丙沙星(CF) 在大口黑鲈肝细胞中的色谱图 A :空白细胞提取液 ;B :含 EF 10μg/ mL 的细胞提取液 ;C: EF 与细胞孵育 45 min Fig12 HPLC chromatogram for EF and CF in Micropterus salmoides hepatocytes A :HPLC chromatogram from cells free of EF and CF ;B :HPLC chromatogram of EF (10μg/ mL) extracted from cell ;C: HPLC chromatogram of EF incubated with cell for 45 minutes. 212 定量方法 21211 标准曲线及线性范围 标准曲线的药物浓 度线性范围、回归方程及相关系数如下 ( A i 表示药 物与内标峰面积比 , Ci 表示药物标准品在空白细胞 中的浓度) :EF 0102～200μg/ mL , A i = 140113 Ci - 57148 , R = 01999 9 ; CF 0102～200 μg/ mL , A i = 95178 Ci - 93115 , R = 01999 8。 21212 最低检测限( LOD) 经测得 EF 在细胞中 的 LOD 为 0105μg/ mL , CF 在细胞中的 LOD 为 0102μg/ mL 。 21213 回收率和变异系数 按 114 制样方法操作 后 ,由表 1 可见。测得各样品中平均回收率均大于 (80128 ±4144) % , 测得的日内变异系数不大于 5113 % ,日间变异系数不大于 5154 %。所得数据表 明此方法的重现性好 ,精密度高。 表 1 空白细胞中添加 EF和 CF时回收率及变异系数 Tab11 Recoveries and CV of EF and CF to Micropterus salmoides Hepatocytes n = 5 ; X ±SD ; % 质量浓度 (μg·mL - 1 ) EF CF 回收率 Recovery rate 变异系数 CV 日内 Intra2day 日间 Inter2day 回收率 Recovery rate 变异系数 CV 日内 Intra2day 日间 Inter2day 0102 82170 ±4144 4107 5137 80128 ±4144 5113 5154 20 83119 ±4137 3144 5125 85188 ±4166 4134 5143 200 91154 ±4124 3111 4163 90173 ±3160 3127 3197 1006 中 国 水 产 科 学 第 14 卷

王翔凌等:大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定 1007 2.3恩诺沙星体外温孵的结果 如图5。根据方程计算酶动力学参数,其最大反应 231恩诺沙星在大口黑鲈肝细胞中的消除EF速率Vmx为0.29ug( mIn"mg),米氏常数Km为 与大口黑鲈原代肝细胞孵育一定时间后,(CH)和2.37ug/mL,内在清除率Chm为0.01mL/(min (Cc)的量随孵育时间的变化情况即药时曲线如图mg)。 3,可知EF的量随孵育时间的延长在由快到慢的降 低,而CF的生成量则是在由快到慢的升高,到曾 90min时二者几乎趋于平稳状态,但二者在大口黑 0.25 鲈肝细胞中的变化均为非线性,曲线拟合得消除方 程为C=50e000相关指数(R2)为0.71,消除 速率常数(K)为8×10-/h,消除半衰期(T2)为喜 15 86.63h ◆EFN脱乙基酶活 多0.05 EF- N- deethylase activit ▲·CF浓度 CF concentrat … 图4大口黑鲈肝细胞中EF·N·脱乙基酶的酶活与CF 浓度曲线(n=5,X±SD) 誉出44 Fig 4 The curve for EF-N. deet hylase activity and CH EF concentration concentration in Micropterus salmo des hepatocytes CF concentration n=5,X±SD) 图3大口黑鲈肝细胞中EF代谢的药时曲线(n=5,X Fig 3 Concentration of Ef time curve in Micropterus salmon des hepatocytes 三 0 2.3.2孵育时间对恩诺沙星脱乙基酶活的影响 s(EF,ug·ml 底物EF与大口黑鲈原代肝细胞孵育后,其代谢该 药物的酶EF脱乙基酶的活性随孵育时间的变化如 /[S](EF,ug·mL) 图4所示。 可看出虽然随着孵育时间的延长,CF的生成量图5大口黑鲈肝细胞中EF脱乙基酶的 lineweaverBurk 在升高,但升高的速度却在变小,因此由酶活性公式 作图(n=5,X土SD) 可知其酶活却在降低,尤其在45mn后下降较明h1g.5 The lineweaver Burk plot for EF deet hylas activity in 显。通过显著性比较分析可看出当孵育时间为 Micropterus salmo des hepatocytes(n=5, XtS 45mn时,其酶活性最高为0.25ug/( min mg)。因 此可知在该条件下底物与细胞孵育的最佳时间为 3讨论 45 min 3.1色谱条件的优化 2.3.3恩诺沙星在大口黑鲈肝细胞中的酶动力学 在色谱条件的确定中,流动相的组成曾尝试选用 EF与大口黑鲈原代肝细胞孵育45min后,通过过甲醇但是基线不易平稳,并且柱压较高不利于测 HPLC法检测EF剩余浓度(C)和CF生成量(Cn),样。通过对EF标准液在HPC上进行波谱扫描发现 根据 Linewaver Burk作图,其酶促反应动力学方程其最大吸收波长为276mm,因此本实验条件下选定 为:1=78.35×/S]+3.5017(R2=0.9211),276m做为紫外检测波长。在流动相的配比中也做 91994-2009ChinaAcademicJOurmalElectronicpUblishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net

213 恩诺沙星体外温孵的结果 21311 恩诺沙星在大口黑鲈肝细胞中的消除 EF 与大口黑鲈原代肝细胞孵育一定时间后 , ( CEF ) 和 ( CCF ) 的量随孵育时间的变化情况即药时曲线如图 3 ,可知 EF 的量随孵育时间的延长在由快到慢的降 低 ,而 CF 的生成量则是在由快到慢的升高 , 到 90 min时二者几乎趋于平稳状态 ,但二者在大口黑 鲈肝细胞中的变化均为非线性 ,曲线拟合得消除方 程为 C = 50e - 01000 8 t ,相关指数 ( R 2 ) 为 0171 ,消除 速率常数( K) 为 8 ×10 - 4 / h ,消除半衰期 ( T1/ 2 ) 为 86163 h。 图 3 大口黑鲈肝细胞中 EF 代谢的药时曲线 ( n = 5 , X ±SD) Fig13 Concentration of EF time curve in Micropterus salmoides hepatocytes( n = 5 , X ±SD) 21312 孵育时间对恩诺沙星脱乙基酶活的影响 底物 EF 与大口黑鲈原代肝细胞孵育后 ,其代谢该 药物的酶 EF 脱乙基酶的活性随孵育时间的变化如 图 4 所示。 可看出虽然随着孵育时间的延长 ,CF 的生成量 在升高 ,但升高的速度却在变小 ,因此由酶活性公式 可知其酶活却在降低 ,尤其在 45 min 后下降较明 显。通过显著性比较分析可看出当孵育时间为 45 min时 ,其酶活性最高为 0125μg/ (min·mg) 。因 此可知在该条件下底物与细胞孵育的最佳时间为 45 min。 21313 恩诺沙星在大口黑鲈肝细胞中的酶动力学 EF 与大口黑鲈原代肝细胞孵育 45 min 后 ,通过 HPLC 法检测 EF 剩余浓度(Ct ) 和 CF 生成量(Cn ) , 根据 Linewaver2Burk 作图 ,其酶促反应动力学方程 为 :1/ V = 78135 ×1/ [ S ] + 31501 7 ( R 2 = 019211) , 如图 5。根据方程计算酶动力学参数 ,其最大反应 速率 V max为 0129μg/ (min·mg) ,米氏常数 Km 为 22137μg/ mL ,内在清除率 Clint为 0101 mL/ (min· mg) 。 图 4 大口黑鲈肝细胞中 EF - N - 脱乙基酶的酶活与 CF 浓度曲线( n = 5 , X ±SD) Fig14 The curve for EF - N - deethylase activity and CF concentration in Micropterus salmoides hepatocytes ( n = 5 , X ±SD) 图 5 大口黑鲈肝细胞中 EF 脱乙基酶的 lineweaver2Burk 作图( n = 5 , X ±SD) Fig15 The lineweaver2Burk plot for EF deethylase activity in Micropterus salmoides hepatocytes( n = 5 , X ±SD) 3 讨论 311 色谱条件的优化 在色谱条件的确定中 ,流动相的组成曾尝试选用 过甲醇 ,但是基线不易平稳 ,并且柱压较高 ,不利于测 样。通过对 EF 标准液在 HPLC上进行波谱扫描发现 其最大吸收波长为 276 nm ,因此本实验条件下选定 276 nm 做为紫外检测波长。在流动相的配比中也做 第 6 期 王翔凌等 :大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定 1007

中国水产科学 了不少的尝试,直至两峰得到良好分离。由于EF是尚需大量的实验来验证或推断,以使体外实验更具 两性物质,在流动相中易解离,对组份的保留时间和有实际意义。体外研究方法便于控制,操作简便,代 峰形都会造成不良影响,在流动相中加入四丁基溴化谢体系较纯净,易于对代谢产物进行分离提取,可以 铵,用以消除色谱柱中十八烷基键合硅胶的硅羟基对在较短的时间内得到较为明确的结果,适用于非常 EF碱性基团的吸附作用,同时将流动相pH调至3.0重要的I相代谢产物的研究,能够为药物的结构改 左右,以抑制药物解离或改变峰形 造及临床给药151提供依据 3.2研究体系的选择及药物的分离提取及检测 3.4EF在细胞中的代谢及其基础酶活模型 药物体外代谢的研究中反应体系的选择是影响 本试验中,选用鱼类常用抗菌药EF来研究其 结果准确性的首要因素,目前为止,主要用到的有亚代谢活性,不仅为该药在细胞内的代谢提供了一定 细胞结构cDNA表达的P450酶以及肝细胞和肝切的价值,而且通过测定细胞中蛋白含量后,用EF的 片等,但经过与文献[13-14比发现,由于肝细胞代谢产物CF的产量来反映酶活性的方法简单易 技术的发展,使用完整的细胞进行研究能够更加符行,是测定P450酶活性所常用的方法。关于P450 合药物在体内的代谢情况,从而更加准确地推测药酶的活性的诱导和抑制已引起医药界的关注15,建 物在体内的实际代谢,也使得肝细胞在体外代谢方立一种高效而简便的酶活性检测方法尤为重要。 面有了一定的应用。因此本实验中选用的是的优于 EF与大口黑鲈在37℃下振荡,孵育时间为 鱼的肝微粒体等亚细胞结构或其他反应体系的的肝45min,其酶活最高,因此在该条件下可选定最佳孵 细胞来研究药物代谢,更能反应真实情况。 育时间为45min。通过对酶动力学的研究发现 实验过程中曾用甲醇、乙腈或三氯醋酸直接提Vmax为0.29μg/( min mg),内在清除率Cint为 取回收率均不够理想且杂质较多。本实验最终采0.01mL/( min mg),说明该酶在大口黑鲈肝细胞中 用了二氯甲烷作为萃取剂,去除细胞中蛋白的效果的基础酶活一般,由于药物间代谢的相互作用是影响 较好且回收率变异系数等均能符合要求,且二氯甲药物在体内浓度水平的一个重要因素,因此关于 烷沸点较低(40O,极易吹干,因此二氯甲烷是较对该酶的诱导和抑制的作用有待于进一步的研究。 理想的萃取剂。另外在样品吹干后,将其浓缩2倍, 有研究初步证实EF脱乙基酶属于CYP3A亚 以降低药物在细胞中的最低检测限 家族ln,该家族的P450酶不仅可代谢一些内源性 3.3恩诺沙星在大口黑鲈肝细胞中的代谢 激素(如氢化考的松、雌激素等)和某些饮食中的有 EF与大口黑鲈肝细胞温孵后,从HPLC图上害污染物,还参与了许多环境致癌剂以及包括多种 可见EF被迅速代谢形成代谢物CF,随着时间的延常用化疗药物在内的人体中50%以上的药物代 长,EF在大口黑鲈肝细胞中呈非线性消除,与此同谢13-.因此通过对EF脱乙基酶的基础酶活模型 时其脱乙基代谢物CF呈非线性增加,当给药后的研究能够为该代谢酶所属的P450家族或亚家族 90min时,CF几乎处于饱和状态。 Intone等研作为环境毒理学的生物标志物和水域环境的指示剂 究了EF在黑鲈体内代谢及消除情况,发现在体内的研究提供一定的理论基础;另外通过该药在细胞 的代谢产物同样为CF说明代谢该药物的P450酶中代谢的研究能够了解该药在水产动物体内作用机 活性在体内外存在一致性。另外体内研究发现代理与消除规律,进而对该药的残留监控有一定的指 谢产物CF主要出现在肝脏中其次是血浆中,而皮导意义。 肤和肌肉很少出现,说明该代谢酶主要存在于肝脏 中,因此选取该酶含量较高的肝细胞作为体外实验参考文献 材料,具有一定的可操作性。EF在体外的消除半衰(1 Meyer UA. Overview of enzymes of drug metabolis.par 期为86.63h,而在体内的消除半衰期为25h,体内 消除速率常数为0.03/h,体外消除速率常数为8×(2 Steven A w, Mark v B, Barbara R. The human drug metabo- 104/h,体内外药物的消除速度存在着一定的差 lizing cytochromes P450[J]. Pharmacokinet Biopharm, 1996, 24 别,差别的存在是由于多种因素造成的如体内外环((s)46 ore L. Cecchini s. bertini s. et al pharmaco kinetics of er 境的差异、体内给药的剂量以及体外药物与细胞孵 floxacin in the sea bass( Dicentrarchus labrax)[J. Aquacul- 育时的浓度等,因此关于体内外药物代谢的相关性 ure,2000,182:49-59 c1994-2009ChinaAcademicjOurnalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp www.cnkinet

了不少的尝试 ,直至两峰得到良好分离。由于 EF 是 两性物质 ,在流动相中易解离 ,对组份的保留时间和 峰形都会造成不良影响 ,在流动相中加入四丁基溴化 铵 ,用以消除色谱柱中十八烷基键合硅胶的硅羟基对 EF 碱性基团的吸附作用 ,同时将流动相 pH 调至 310 左右 ,以抑制药物解离或改变峰形。 312 研究体系的选择及药物的分离提取及检测 药物体外代谢的研究中反应体系的选择是影响 结果准确性的首要因素 ,目前为止 ,主要用到的有亚 细胞结构、cDNA 表达的 P450 酶以及肝细胞和肝切 片等 ,但经过与文献[ 13 - 14 ]比较发现 ,由于肝细胞 技术的发展 ,使用完整的细胞进行研究能够更加符 合药物在体内的代谢情况 ,从而更加准确地推测药 物在体内的实际代谢 ,也使得肝细胞在体外代谢方 面有了一定的应用。因此本实验中选用的是的优于 鱼的肝微粒体等亚细胞结构或其他反应体系的的肝 细胞来研究药物代谢 ,更能反应真实情况。 实验过程中曾用甲醇、乙腈或三氯醋酸直接提 取 ,回收率均不够理想且杂质较多。本实验最终采 用了二氯甲烷作为萃取剂 ,去除细胞中蛋白的效果 较好且回收率、变异系数等均能符合要求 ,且二氯甲 烷沸点较低 (40 ℃) ,极易吹干 ,因此二氯甲烷是较 理想的萃取剂。另外在样品吹干后 ,将其浓缩 2 倍 , 以降低药物在细胞中的最低检测限。 313 恩诺沙星在大口黑鲈肝细胞中的代谢 EF 与大口黑鲈肝细胞温孵后 ,从 HPLC 图上 可见 EF 被迅速代谢形成代谢物 CF ,随着时间的延 长 ,EF 在大口黑鲈肝细胞中呈非线性消除 ,与此同 时其脱乙基代谢物 CF 呈非线性增加 ,当给药后 90 min 时 ,CF 几乎处于饱和状态。Intorre 等[3 ]研 究了 EF 在黑鲈体内代谢及消除情况 ,发现在体内 的代谢产物同样为 CF ,说明代谢该药物的 P450 酶 活性在体内外存在一致性。另外 ,体内研究发现代 谢产物 CF 主要出现在肝脏中 ,其次是血浆中 ,而皮 肤和肌肉很少出现 ,说明该代谢酶主要存在于肝脏 中 ,因此选取该酶含量较高的肝细胞作为体外实验 材料 ,具有一定的可操作性。EF 在体外的消除半衰 期为 86163 h ,而在体内的消除半衰期为 25 h ,体内 消除速率常数为 0103/ h ,体外消除速率常数为 8 × 10 - 4 / h ,体内外药物的消除速度存在着一定的差 别 ,差别的存在是由于多种因素造成的 ,如体内外环 境的差异、体内给药的剂量以及体外药物与细胞孵 育时的浓度等 ,因此关于体内外药物代谢的相关性 尚需大量的实验来验证或推断 ,以使体外实验更具 有实际意义。体外研究方法便于控制 ,操作简便 ,代 谢体系较纯净 ,易于对代谢产物进行分离提取 ,可以 在较短的时间内得到较为明确的结果 ,适用于非常 重要的 Ⅰ相代谢产物的研究 ,能够为药物的结构改 造及临床给药[15 ]提供依据。 314 EF 在细胞中的代谢及其基础酶活模型 本试验中 ,选用鱼类常用抗菌药 EF 来研究其 代谢活性 ,不仅为该药在细胞内的代谢提供了一定 的价值 ,而且通过测定细胞中蛋白含量后 ,用 EF 的 代谢产物 CF 的产量来反映酶活性的方法简单易 行 ,是测定 P450 酶活性所常用的方法。关于 P450 酶的活性的诱导和抑制已引起医药界的关注[15 ] ,建 立一种高效而简便的酶活性检测方法尤为重要。 EF 与大口黑鲈在 37 ℃下振荡 ,孵育时间为 45 min ,其酶活最高 ,因此在该条件下可选定最佳孵 育时间为 45 min。通过对酶动力学的研究发现 Vmax 为 0129μg/ (min·mg) ,内在清除率 Clint 为 0101 mL/ (min·mg) ,说明该酶在大口黑鲈肝细胞中 的基础酶活一般 ,由于药物间代谢的相互作用是影响 药物在体内浓度水平的一个重要因素[16 ] ,因此关于 对该酶的诱导和抑制的作用有待于进一步的研究。 有研究初步证实 EF 脱乙基酶属于 CYP3A 亚 家族[17 ] ,该家族的 P450 酶不仅可代谢一些内源性 激素(如氢化考的松、雌激素等) 和某些饮食中的有 害污染物 ,还参与了许多环境致癌剂以及包括多种 常用化疗药物在内的人体中 50 %以上的药物代 谢[18 - 19 ] ,因此通过对 EF 脱乙基酶的基础酶活模型 的研究能够为该代谢酶所属的 P450 家族或亚家族 作为环境毒理学的生物标志物和水域环境的指示剂 的研究提供一定的理论基础 ;另外通过该药在细胞 中代谢的研究能够了解该药在水产动物体内作用机 理与消除规律 ,进而对该药的残留监控有一定的指 导意义。 参考文献 : [ 1 ] Meyer U A. Overview of enzymes of drug metabolism[J ]. Phar2 macokinet Biopharm ,1996 ,24 (5) :449 - 459. [ 2 ] Steven A W ,Mark V B ,Barbara J R. The human drug metabo2 lizing cytochromes P450 [J ]. Pharmacokinet Biopharm ,1996 ,24 (5) :461. [ 3 ] Intorre L ,Cecchini S ,Bertini S ,et al. Pharmacokinetics of en2 rofloxacin in the sea bass ( Dicentrarchus labrax ) [J ]. Aquacul2 ture ,2000 ,182 :49 - 59. 1008 中 国 水 产 科 学 第 14 卷