食品微生物实验指导书
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实验须知为了保证实验的质量，提高教学效果，更好的从实践中培养分析问题和解决问题的能力。根据微生物工作的特点，提出以下几点注意事项：一、实验开始前（1）每次实验前，要充分预习实验讲义，明了实验的目的要求、原理方法，弄懂其中的难点，初步熟悉实验操作的关键步骤，使自己对该实验的内容做到心中有数。这样在实验中就能掌握主动权，对整个内容统筹规划，合理安排，尽量避免发生错误。(2)4每次实验前要将实验台面擦干净，自己要洗手。二、实验过程中(1)要保持实验清洁，在实验中尽量不要走动，防止尘埃飞扬。(2)与本实验无关的书籍、物品不要带进实验室。必须带进的物品要放好，保持整齐，不要影响实验操作。(3)凡是实验中用过的试管、培养血、三角瓶等，事先都要做好标记，注明日期、名称、内容、姓名、组别，以免搞错。(4)凡是用过的带菌吸管、滴管、玻片等，应立即投放5%石炭酸缸中，浸泡后再进行清洗。(5)认真做好实验记录。实验中所观察到的现象都应及时、如实的记录下来。所做的记录要注明实验日期、和实验条件。如果是从别人处获得的实验结果，也应注明。只有这样，才能客观的对实验进行分析总结，找出成败的原因。(6）要爱护仪器、公物，节约水电、煤气，注意安全。凡是公用物品，不能锁进自己的抽屉里。三、实验结束后(1)清洗各种应处理的器血、物品。(2)实验台面擦拭干净，值日生负责打扫整个实验室。(3)用肥皂和自来水洗手。(4)关好水电、煤气、门窗等。(5)及时观察和分析实验结果，以科学认真的态度写出实验报告
实验须知 为了保证实验的质量，提高教学效果，更好的从实践中培养分析问题和解决问题的 能力。根据微生物工作的特点，提出以下几点注意事项： 一、实验开始前 （1） 每次实验前，要充分预习实验讲义，明了实验的目的要求、原理方法，弄懂 其中的难点，初步熟悉实验操作的关键步骤，使自己对该实验的内容做到心 中有数。这样在实验中就能掌握主动权，对整个内容统筹规划，合理安排， 尽量避免发生错误。 （2） 每次实验前要将实验台面擦干净，自己要洗手。 二、实验过程中 （1） 要保持实验清洁，在实验中尽量不要走动，防止尘埃飞扬。 （2） 与本实验无关的书籍、物品不要带进实验室。必须带进的物品要放好，保持 整齐，不要影响实验操作。 （3） 凡是实验中用过的试管、培养皿、三角瓶等，事先都要做好标记，注明日期、 名称、内容、姓名、组别，以免搞错。 （4） 凡是用过的带菌吸管、滴管、玻片等，应立即投放 5%石炭酸缸中，浸泡后 再进行清洗。 （5） 认真做好实验记录。实验中所观察到的现象都应及时、如实的记录下来。所 做的记录要注明实验日期、和实验条件。如果是从别人处获得的实验结果， 也应注明。只有这样，才能客观的对实验进行分析总结，找出成败的原因。 （6） 要爱护仪器、公物，节约水电、煤气，注意安全。凡是公用物品，不能锁进 自己的抽屉里。 三、实验结束后 （1） 清洗各种应处理的器皿、物品。 （2） 实验台面擦拭干净，值日生负责打扫整个实验室。 （3） 用肥皂和自来水洗手。 （4） 关好水电、煤气、门窗等。 （5） 及时观察和分析实验结果，以科学认真的态度写出实验报告
实验一普通光学显微镜的使用和维护微生物的个体微小，必须借助显微镜才能看到。因此，学会使用显微镜对学习微生物学和从事微生物学的科研和生产都是十分重要的。显微镜可分为普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等不同类型。本章着重介绍普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的结构原理和使用方法c一、实验目的1：了解显微镜的结构及油浸镜的工作原理。2.掌握显微镜的基本使用技术。3.学会利用油镜观察细菌的基本形态，掌握油镜的保养方法二、实验材料普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的染色涂片。三、光学显微镜的构造显微镜是一种高度放大的光学仪器，它的种类很多，根据实验目的的不同，可分别选用普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜和电子显微镜。在微生物的一般形态观察中，普通光学显微镜最为常用，它的主要构造包括机械和光学两部分。普通光学显微镜的构造如图1一1所示。（一）机械部分包括镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、粗调螺旋和细调螺旋、推进器、聚光器、升降螺旋等部件。1.镜座显微镜的基座，用以支撑整个显微镜。2.镜臂携带或移动显微镜的把手，上连镜筒、下连镜座，用以支撑镜筒，与镜座连接处为一关节，可使镜身倾斜。3.镜筒由金属制成的中空圆筒，上端放置目镜，下端连接转换器，形成目镜与物镜间的暗室。4.物镜转换器由两个金属圆盘叠合而成，上有-133～4个安装物镜的螺旋口，可依物镜放大倍数高低，图1-1显微镜的结构顺序安装3～4个物镜。根据需要，可转动转换器将1.粗调螺旋2.细调螺旋3.镜臂4.推进器其中的某一物镜和镜筒接通，与镜筒上方的接目镜5.升降螺旋6.倾斜关节7.接目镜8.镜筒配合，构成一个放大系统。转换器的两个金属圆盘9.物镜转换器10.接目镜11.载物台12.转换中，上面那个圆盘的正后装有一个弹簧舌片，下面器13.虹彩光圈14.反光镜15.镜座那个圆盘侧面与每个物镜相应的位置各有一个小凹缝。转换物镜时必须使弹簧舌片嵌入此凹缝中，才是达到了正确的位置
实验一 普通光学显微镜的使用和维护 微生物的个体微小，必须借助显微镜才能看到。因此，学会使用显微镜对学习微生物 学和从事微生物学的科研和生产都是十分重要的。 显微镜可分为普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显 微镜、荧光显微镜和电子显微镜等不同类型。 本章着重介绍普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的结构原 理和使用方法 c 一、实验目的 1. 了解显微镜的结构及油浸镜的工作原理。 2. 掌握显微镜的基本使用技术。 3. 学会利用油镜观察细菌的基本形态,掌握油镜的保养方法. 二、实验材料 普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的染 色涂片。 三、光学显微镜的构造 显微镜是一种高度放大的光学仪器，它的种类很多，根据实验目的的不同，可分别 选用普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜和电子显 微镜。在微生物的一般形态观察中，普通光学显微镜最为常用，它的主要构造包括机械 和光学两部分。普通光学显微镜的构造如图 1-1 所示。 （一）机械部分 包括镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、 粗调螺旋和细调螺旋、推进器、聚光器、升降螺旋 等部件。 1.镜座 显微镜的基座，用以支撑整个显微镜。 2.镜臂 携带或移动显微镜的把手，上连镜筒、 下连镜座，用以支撑镜筒，与镜座连接处为一关节， 可使镜身倾斜。 3.镜筒 由金属制成的中空圆筒，上端放置目 镜，下端连接转换器，形成目镜与物镜间的暗室。 4.物镜转换器由两个金属圆盘叠合而成，上有 3～4 个安装物镜的螺旋口，可依物镜放大倍数高低， 顺序安装 3～4 个物镜。根据需要，可转动转换器将 其中的某一物镜和镜筒接通，与镜筒上方的接目镜 配合，构成一个放大系统。转换器的两个金属圆盘 中，上面那个圆盘的正后装有一个弹簧舌片，下面 那个圆盘侧面与每个物镜相应的位置各有一个小凹 缝。转换物镜时必须使弹簧舌片嵌入此凹缝中，才是达到了正确的位置。 图 1-1 显微镜的结构 1.粗调螺旋 2.细调螺旋 3.镜臂 4.推进器 5.升降螺旋 6.倾斜关节 7.接目镜 8.镜筒 9.物镜转换器 10.接目镜 11.载物台 12.转换 器 13.虹彩光圈 14.反光镜 15.镜座
5.载物台位于镜筒下方，呈方形，中间有孔可透过光线。台上装有推进器，用以固定或移动标本的位置，使镜检标本恰好位于视野中，有些显微镜无推进器而有一对弹簧夹为固定标本用。6.粗调螺旋和细调螺旋位于镜筒的两旁，粗调螺旋位于细调螺旋的上方。它们可使镜筒升降，目的是使被观察物与物镜的距离恰好等于物镜的工作距离。要使镜筒作较大幅度升降，可用粗调螺旋，要使之作微小的升降，则用细调螺旋。细调螺旋每转一圈，镜筒升降100μm，很多显微镜的细调螺旋上附有刻度，每转动一小格相当于升降2μm，当细调螺旋旋转到极限时，则不应继续用力旋转，而应重新调节粗调螺旋，使物镜与标本距离稍微拉开一些，然后反拧细调螺旋便可将物镜调至最适高度。7.升降螺旋聚光器升降螺旋装在载物台下面的一个可使聚光器升降的部件，用它可以调节反光镜反射出来的光线。（二）光学部分光学部分又可分为照明和放大两个系统，前者包括反光镜、聚光器和虹彩光圈，有的还有特殊的光源部件：后者包括物镜和接目镜。1.反光镜位于显微镜的最下方，有平凹两面，可以自由转动方向，其作用是将投射到它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，穿过透镜，照明标本。当外源光线较强时应使用平面反光镜，光线较弱时应使用凹面镜。2.聚光器位于反光镜上方，由一组透镜组成。其作用是将反光镜反射来的光线聚为一束强的光锥于载玻片标本上，聚光器可根据需要上下移动调节，一般用低倍镜时应降低聚光器，用油浸镜时，聚光器应升至最高。3.虹彩光圈位于聚光镜下方，由十儿张金属薄片组成，中心部分形成圆孔，推动光圈把手，可开大或开小，用以调节射入聚光镜光线的多少，使照明达到最适当的程度。4.物镜通常称为镜头，是显微镜的重要组成部件，它不仅可以放大标本，而且具有辨晰性能。因此，它决定着显微镜的性能。一台显微镜通常有三个接物镜，一个是低倍镜（10×），一个是高倍镜（40×），这两个都是于燥系接物镜（于燥系是指接物镜与被检物之间介质是空气）还有一个是油浸系接物镜（100），简称油镜或油浸镜（油浸系是指接物镜与被检物之间的介质是某种油类物质）。三个放大镜按放大倍数顺序安装在转换器上，以便依次转换使用。接物镜的放大率可以直接通过镜头侧面刻有的放大倍数来辨认，也可由其外形来辨认，一般低倍镜物镜较短，高倍镜物镜较长，油浸镜也较长，但上面带有一圈不同颜色的线做标记。放大倍数越高的接物镜，它的焦距越小，工作距离也越小，也就是说，在观察时它与被观察物的距离越小。因此，在使用油浸镜观察时其镜头和玻片极为接近。5.接自镜通常成为自镜，位于镜筒的上端，由两块透镜组成，它只能将接物镜所造成的实像进一步放大形成虚像映入眼部，不具有辨晰能力。接目镜上刻有表示放大倍数的标记，如5×、10×、16×等。通常每台显微镜都备有几种不同放大倍数的接目镜，可根据需要选择其中的一种使用。有的接目镜为便于指示物像，镜头中央装有一条黑色细丝作为指针。四、显微镜的性能
5.载物台位于镜筒下方，呈方形，中间有孔可透过光线。台上装有推进器，用以固 定或移动标本的位置，使镜检标本恰好位于视野中，有些显微镜无推进器而有一对弹簧 夹为固定标本用。 6.粗调螺旋和细调螺旋位于镜筒的两旁，粗调螺旋位于细调螺旋的上方。它们可使 镜筒升降，目的是使被观察物与物镜的距离恰好等于物镜的工作距离。要使镜筒作较大 幅度升降，可用粗调螺旋，要使之作微小的升降，则用细调螺旋。细调螺旋每转一圈， 镜筒升降 100μm，很多显微镜的细调螺旋上附有刻度，每转动一小格相当于升降 2μm， 当细调螺旋旋转到极限时，则不应继续用力旋转，而应重新调节粗调螺旋，使物镜与标 本距离稍微拉开一些，然后反拧细调螺旋便可将物镜调至最适高度。 7.升降螺旋 聚光器升降螺旋装在载物台下面的一个可使聚光器升降的部件，用它可以 调节反光镜反射出来的光线。 (二)光学部分 光学部分又可分为照明和放大两个系统，前者包括反光镜、聚光器和虹彩光圈，有 的还有特殊的光源部件;后者包括物镜和接目镜。 1.反光镜 位于显微镜的最下方，有平凹两面，可以自由转动方向，其作用是将投 射到它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，穿过透镜，照明标本。当外源光线较强时 应使用平面反光镜，光线较弱时应使用凹面镜。 2.聚光器 位于反光镜上方，由一组透镜组成。其作用是将反光镜反射来的光线聚 为一束强的光锥于载玻片标本上，聚光器可根据需要上下移动调节，一般用低倍镜时应 降低聚光器，用油浸镜时，聚光器应升至最高。 3.虹彩光圈 位于聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，中心部分形成圆孔，推动光 圈把手，可开大或开小，用以调节射入聚光镜光线的多少，使照明达到最适当的程度。 4.物镜 通常称为镜头，是显微镜的重要组成部件，它不仅可以放大标本，而且具有 辨晰性能。因此，它决定着显微镜的性能。一台显微镜通常有三个接物镜，一个是低倍 镜（10×），一个是高倍镜（40×），这两个都是干燥系接物镜（干燥系是指接物镜与被 检物之间介质是空气）还有一个是油浸系接物镜（100×），简称油镜或油浸镜（油浸系 是指接物镜与被检物之间的介质是某种油类物质）。三个放大镜按放大倍数顺序安装在转 换器上，以便依次转换使用。 接物镜的放大率可以直接通过镜头侧面刻有的放大倍数来辨认，也可由其外形来辨 认，一般低倍镜物镜较短，高倍镜物镜较长，油浸镜也较长，但上面带有一圈不同颜色 的线做标记。 放大倍数越高的接物镜，它的焦距越小，工作距离也越小，也就是说，在观察时它 与被观察物的距离越小。因此，在使用油浸镜观察时其镜头和玻片极为接近。 5.接目镜 通常成为目镜，位于镜筒的上端，由两块透镜组成，它只能将接物镜所造成 的实像进一步放大形成虚像映入眼部，不具有辨晰能力。接目镜上刻有表示放大倍数的 标记，如 5×、10×、16×等。通常每台显微镜都备有几种不同放大倍数的接目镜，可根 据需要选择其中的一种使用。有的接目镜为便于指示物像，镜头中央装有一条黑色细丝 作为指针。 四、显微镜的性能
显微镜的总放大倍数等于物镜放大率和目镜放大率的乘积。但显微镜性能的优劣不只是视其放大倍数的高低，而更主要的视视其辨晰细微结构的能力，即分辨率的大小。显微镜辨晰细微结构的能力可用分辨率表示，其能够辨晰的细微结构越小，则分辨率越高。分辨率的高低，首先取决于物镜的性能，若设物镜分辨出的物体两点间的最小距离为D，则：元D=-2NA式中，入为可见光的波长，平均为0.55μmNA为物镜镜口率或称开口率、数值口径。镜口率NA是物镜和被检标本间介质的折射率Ⅱ与镜口角（即入射角）的半数正弦的乘积，常以下式表示：镜口率NA=nsinα2元所以，D也可以表示为D=，2nsin(α/2)由上式可见，显微镜的分辨率与波长、介质折射率和镜口角有关。入越大，D值越大，分辨率越低：n和a越大，D值越小，分辨率越高。因此，可以通过缩短光线波长，增大介质折射率和加大镜口角来提高分辨率。紫外光显微镜和电子显微镜就是利用短波光和电子波来提高分辨率的。但普通光学显微镜用的是可见光，波长一定，平均为0.55μm，而镜口角是指物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度，理论上最大为180°，故sin（a/2)理论最大值为1（实际上镜口角度最大只能为140°），因此，试图通过缩短波长或提高镜口角来提高光学显微镜的分辨率是有限度的。只有通过提高介质的折射率来提高镜口率，从而提高其分辨率。在使用低倍镜和高倍镜时，镜头与玻片标本间的介质是空气，其折射率是1，sin（a/2)=sin70°=0.94，故其镜口率NA=1X0.94。使用油镜时，镜头与玻片标本间的介质是香柏油，香柏油的折射率为1.515，则其NA=1.515×0.94，故油镜的镜口率总是大于低倍或高倍镜的镜口率，其镜口率最大可达到1.4，所以油镜的分辨率比低倍镜或高倍镜要高的多。例如，在可见光照射下，用镜口率1.25的油镜（一般油镜的镜口角半数的正弦为0.81），能分辨出物体两点间的最短距离D=0.55/(2×1.25)=0.22μm。而且镜口率为0.65的高倍镜，能分辨出的最短距离D=0.55/(2×0.65)=0.42μm。即两点间的最小距离如果小于0.4μm，在高倍镜下即混为一点，不可辨晰，而在油镜下则清晰可见。使用某一物镜时，应配合一定镜口率的聚光镜。一般以聚光镜的镜口率大于或等于物镜的镜口率为宜，否则影响物镜的性能。由此可见，显微镜的性能不只是决定于总放大率。一般来说，显微镜的总放大率应以物镜镜口率的500～1000倍为宜，这个范围内的放大率叫有效放大率。例如，用NA1.25（100×）的物镜，其有效放大率为1250，超过此数叫无效放大率，虽用15×的目镜可放大1500倍，但对分辨率是没有任何帮助的。五、微镜的使用方法
显微镜的总放大倍数等于物镜放大率和目镜放大率的乘积。但显微镜性能的优劣不 只是视其放大倍数的高低，而更主要的视视其辨晰细微结构的能力，即分辨率的大小。 显微镜辨晰细微结构的能力可用分辨率表示，其能够辨晰的细微结构越小，则分辨 率越高。分辨率的高低，首先取决于物镜的性能，若设物镜分辨出的物体两点间的最小 距离为 D，则： D= 2NA 式中，λ为可见光的波长，平均为 0.55μm；NA 为物镜镜口率或称开口率、数值口 径。镜口率 NA 是物镜和被检标本间介质的折射率 n 与镜口角（即入射角α）的半数正弦 的乘积，常以下式表示： 镜口率 NA=nsin 2 所以，D 也可以表示为 D= 2 sin( / 2) n 由上式可见，显微镜的分辨率与波长、介质折射率和镜口角有关。λ越大，D 值越大， 分辨率越低；n 和α越大，D 值越小，分辨率越高。因此，可以通过缩短光线波长，增大 介质折射率和加大镜口角来提高分辨率。紫外光显微镜和电子显微镜就是利用短波光和 电子波来提高分辨率的。但普通光学显微镜用的是可见光，波长一定，平均为 0.55μm， 而镜口角是指物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度， 理论上最大为 180°，故 sin (α/2)理论最大值为 1(实际上镜口角度最大只能为 140°)， 因此，试图通过缩短波长或提高镜口角来提高光学显微镜的分辨率是有限度的。只有通 过提高介质的折射率来提高镜口率，从而提高其分辨率。在使用低倍镜和高倍镜时，镜 头与玻片标本间的介质是空气，其折射率是 1，sin(α/2)=sin70°=0.94，故其镜口率 NA=1×0.94。使用油镜时，镜头与玻片标本间的介质是香柏油，香柏油的折射率为 1.515， 则其 NA=1.515×0.94，故油镜的镜口率总是大于低倍或高倍镜的镜口率，其镜口率最大 可达到 1.4，所以油镜的分辨率比低倍镜或高倍镜要高的多。例如，在可见光照射下，用 镜口率 1.25 的油镜(一般油镜的镜口角半数的正弦为 0.81)，能分辨出物体两点间的最短 距离 D=0.55/(2×1.25)=0.22μm。而且镜口率为 0.65 的高倍镜，能分辨出的最短距离 D=0.55/(2×0.65)=0.42μm。即两点间的最小距离如果小于 0.4μm，在高倍镜下即混为 一点，不可辨晰，而在油镜下则清晰可见。 使用某一物镜时，应配合一定镜口率的聚光镜。一般以聚光镜的镜口率大于或等于 物镜的镜口率为宜，否则影响物镜的性能。 由此可见，显微镜的性能不只是决定于总放大率。一般来说，显微镜的总放大率应 以物镜镜口率的 500～1000 倍为宜，这个范围内的放大率叫有效放大率。 例如，用 NA1.25(100×)的物镜，其有效放大率为 1250，超过此数叫无效放大率， 虽用 15×的目镜可放大 1500 倍，但对分辨率是没有任何帮助的。 五、微镜的使用方法