第三节 吸光光度法 一、测定原理 基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括比色法、可见分光 光度法及紫外分光光度法等。本章重点讨论可见光区的吸光光度法。 有些物质的溶液是有色的，例如 KMnO4 溶液呈紫红色， K Cr O 2 2 7 水溶液呈橙色。许多 物质的溶液本身是无色或浅色的，但它们与某些试剂发生反应后生成有色物质，例如 3 Fe + 与 3 Fe + 生成血红色配合物； 2 Fe + 与邻二氮菲生成红色配合物。有色物质溶液颜色的深浅与 其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深。如果是通过与标准色阶比较颜色深浅的方法确定溶液中 有色物质的含量，则称为目视比色法，如果是使用分光光度计，利用溶液对单色光的吸收程 度确定物质含量，则称为分光光度法。 吸光光度法主要用于测定试样中的微量组分，具有以下特点： (1)灵敏度高。常可不经富集用于测定质量分数为 2 10− ～ 5 10− 。的微量组分，甚至可测 定低至质量分数为 6 10− ～ 8 10− 的痕量组分。通常所测试的浓度下限达 5 10− ～ 6 10− 1 mol L− 。 (2)准确度高。一般目视比色法的相对误差为 5％～l0％，分光光度法为 2％～5％。 (3)应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用分光光度 法进行测定。不仅用于测定微量组分，也能用于高含量组分的测定及配合物组成、化学平衡 等的研究。如农业部门常用于品质分析、动植物生 理生化及土壤、植株等的测定。 (4)仪器简单，操作方便，快速。近年来，由于新的、灵敏度高、选择性好的显色剂和 掩蔽剂的不断出现，以及化学计量学方法的应用，常常可以不经分离就能直接进行比色或分 光光度测定。 （一）物质对光的选择性吸收 1．光的基本性质 光是一种电磁波，同时具有波动性和微粒性。光的传播，如光的折射、衍射、偏振和干 涉等现象可用光的波动性来解释。描述波动性的重要参数是波长 (m) 、频率 (HZ ) ，它们
第三节 吸光光度法 一、测定原理 基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括比色法、可见分光 光度法及紫外分光光度法等。本章重点讨论可见光区的吸光光度法。 有些物质的溶液是有色的，例如 KMnO4 溶液呈紫红色， K Cr O 2 2 7 水溶液呈橙色。许多 物质的溶液本身是无色或浅色的，但它们与某些试剂发生反应后生成有色物质，例如 3 Fe + 与 3 Fe + 生成血红色配合物； 2 Fe + 与邻二氮菲生成红色配合物。有色物质溶液颜色的深浅与 其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深。如果是通过与标准色阶比较颜色深浅的方法确定溶液中 有色物质的含量，则称为目视比色法，如果是使用分光光度计，利用溶液对单色光的吸收程 度确定物质含量，则称为分光光度法。 吸光光度法主要用于测定试样中的微量组分，具有以下特点： (1)灵敏度高。常可不经富集用于测定质量分数为 2 10− ～ 5 10− 。的微量组分，甚至可测 定低至质量分数为 6 10− ～ 8 10− 的痕量组分。通常所测试的浓度下限达 5 10− ～ 6 10− 1 mol L− 。 (2)准确度高。一般目视比色法的相对误差为 5％～l0％，分光光度法为 2％～5％。 (3)应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用分光光度 法进行测定。不仅用于测定微量组分，也能用于高含量组分的测定及配合物组成、化学平衡 等的研究。如农业部门常用于品质分析、动植物生 理生化及土壤、植株等的测定。 (4)仪器简单，操作方便，快速。近年来，由于新的、灵敏度高、选择性好的显色剂和 掩蔽剂的不断出现，以及化学计量学方法的应用，常常可以不经分离就能直接进行比色或分 光光度测定。 （一）物质对光的选择性吸收 1．光的基本性质 光是一种电磁波，同时具有波动性和微粒性。光的传播，如光的折射、衍射、偏振和干 涉等现象可用光的波动性来解释。描述波动性的重要参数是波长 (m) 、频率 (HZ ) ，它们
与光速 c 的关系是： 34 1 3 10 c c J sm s E h h − − = = = = c (10．1) 在真空介质中光速为 2.9979 8 10 1 m s − ，约等于 8 1 3 10 m s − 还有一些现象，如光电效 应、光的吸收和发射等，只能用光的微粒性才能说明，即把光看作是带有能量的微粒流。这 种微粒称为光子或光量子，其能量 E 决定于光的频率。 c E h h = = (10．2) 式中 E 为光子的能量(J)；h 为普朗克常数(6.626 34 10− J s )。 由式(10．2)可知，A 越小，E 越大，所以短波能量高，长波能量低。 我们将眼睛能够 感觉到的那一小段的光称为可见光，它只是电磁波中的一个很小的波段(400～750 nm)，也 就是我们日常所见的日光、白炽光，是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种不同色光组合而 成的复合光(即由不同波长的光所组成的光)。理论上，将仅具有某一波长的光称为单色光， 单色光由具有相同能量的光子所组成。由不同波长的光组成的光称为复合光。单色光其实只 是一种理想的单色，实际上常含有少量其他波长的色光。各种单色光之间并无严格的界限， 例如黄色与绿色之间就有各种不同色调的黄绿色。不仅七种单色光可以混合成白光，两种适 当颜色的单色光按一定强度比例混合也可得到白光。这两种单色光称为互补色，例如绿色光 和紫色互补，黄色光和蓝色光互补等。 2．光吸收曲线 颜色是物质对不同波长光的吸收特性表现在人视觉上所产生的反映。一种物质呈现何种 颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。如果把不同颜色的物体放在暗处，什么颜 色也看不到。当光束照射到物体上时，由于不同物质对于不同波长的光的吸收、透射、反射、 折射的程度不同而呈现不同的颜色。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点(离子或分子) 对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。当白光通过某一有色溶液时，该溶液会选择性地 吸收某些波长的色光而让那些未被吸收的色光透射过去即溶液呈现透射光的颜色，亦即呈现 的是它吸收光的互补色的颜色。例如， KMnO4 溶液选择吸收了白光中的绿色光，与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶 液，所以 KMnO4 溶液呈现紫色。 当依次将各种波长的单色光通过某一有色溶液，测量每一波长下有色溶液对该波长光的 吸收程度(吸光度 A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为该
与光速 c 的关系是： 34 1 3 10 c c J sm s E h h − − = = = = c (10．1) 在真空介质中光速为 2.9979 8 10 1 m s − ，约等于 8 1 3 10 m s − 还有一些现象，如光电效 应、光的吸收和发射等，只能用光的微粒性才能说明，即把光看作是带有能量的微粒流。这 种微粒称为光子或光量子，其能量 E 决定于光的频率。 c E h h = = (10．2) 式中 E 为光子的能量(J)；h 为普朗克常数(6.626 34 10− J s )。 由式(10．2)可知，A 越小，E 越大，所以短波能量高，长波能量低。 我们将眼睛能够 感觉到的那一小段的光称为可见光，它只是电磁波中的一个很小的波段(400～750 nm)，也 就是我们日常所见的日光、白炽光，是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种不同色光组合而 成的复合光(即由不同波长的光所组成的光)。理论上，将仅具有某一波长的光称为单色光， 单色光由具有相同能量的光子所组成。由不同波长的光组成的光称为复合光。单色光其实只 是一种理想的单色，实际上常含有少量其他波长的色光。各种单色光之间并无严格的界限， 例如黄色与绿色之间就有各种不同色调的黄绿色。不仅七种单色光可以混合成白光，两种适 当颜色的单色光按一定强度比例混合也可得到白光。这两种单色光称为互补色，例如绿色光 和紫色互补，黄色光和蓝色光互补等。 2．光吸收曲线 颜色是物质对不同波长光的吸收特性表现在人视觉上所产生的反映。一种物质呈现何种 颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。如果把不同颜色的物体放在暗处，什么颜 色也看不到。当光束照射到物体上时，由于不同物质对于不同波长的光的吸收、透射、反射、 折射的程度不同而呈现不同的颜色。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点(离子或分子) 对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。当白光通过某一有色溶液时，该溶液会选择性地 吸收某些波长的色光而让那些未被吸收的色光透射过去即溶液呈现透射光的颜色，亦即呈现 的是它吸收光的互补色的颜色。例如， KMnO4 溶液选择吸收了白光中的绿色光，与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶 液，所以 KMnO4 溶液呈现紫色。 当依次将各种波长的单色光通过某一有色溶液，测量每一波长下有色溶液对该波长光的 吸收程度(吸光度 A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为该
溶液的吸收曲线，亦称为吸收光谱。 （3）吸收光谱产生的原理 吸收光谱一般有原子吸收光谱和分子吸收光谱。原子吸收光谱是由原子外层电子选择性 地吸收某些波长的电磁波产生跃迁而引起的。我们所讨论的溶液的吸光度，属于分子吸收， 所产生的光谱为分子吸收光谱，是分子中的价电子在分子轨道间跃迁产生的。在分子中，除 了电子相对于原子核的运动之外，还有原子核的相对运动，分子作为整体围绕其重心的转动、 分子的平动，以及原子之间的相对振动和分子中基团间的内旋转运动。因此，在分子中，除 了电子运动能 E。原子的核能 E 小分子转动能 E，和分子平动能 E。外，还有原子间的相对 振动能 E。和基团间的内旋转能 E。等。当不考虑各种运动之间的相互作用时，可近似地认 为分子的总能量为： E E E E E E E = + + + + + e n r t v i 由于在一般化学实验条件下， E n 不发生变化， Et 和 Ei 又比较小，所以一般只需考虑 电子运动能量、振动能量和转动能量： E E E E + + e v r 而这三种能量又都是量子化的，对应有一定的能级。 在同一电子能级内，分子的能量 还因振动能量的不同而分成若干分级，称为振动能级。当分子处于某一电子能级中某一振动 能级时，分子的能量还会因转动能量的不同再分为若干分级，称为转动能级。显然，电子能 级的能量差 E e ，振动能级的能量差 E v 和转动能级的能量差 E r ，间相对大小关系为： E e > E v > E v 当分子状态一定时，分子的总能量就是分子所处的电子能级、振动能级和转动能级的能 量之和。 分子的转动能级能量差一般在 0．005～0．05 eV，产生此能级的跃迁，需吸收波长约 为 250～25 m 的远红外光，这种光谱称为转动光谱或远红外光谱。 分子的振动能级能 量差一般在 0．05～1 eV，需吸收波长约为 25～1．25 m 的红外光才能产生跃迁。在分子 振动时，同时有分子的转动运动。这样，分子振动产生的吸收光谱中，必然包括转动光谱， 所以常称为振一转光谱。振一转光谱是一系列波长间隔很小的谱线，加上谱线变宽和仪器分 辨率低的原因，观察到的是一个谱峰，或称吸收带。因此它是带状光谱，每一不同的吸收带 对应于不同的振动跃迁。由于它所吸收的能量处于红外光区，所以常称为红外光谱。各种物
溶液的吸收曲线，亦称为吸收光谱。 （3）吸收光谱产生的原理 吸收光谱一般有原子吸收光谱和分子吸收光谱。原子吸收光谱是由原子外层电子选择性 地吸收某些波长的电磁波产生跃迁而引起的。我们所讨论的溶液的吸光度，属于分子吸收， 所产生的光谱为分子吸收光谱，是分子中的价电子在分子轨道间跃迁产生的。在分子中，除 了电子相对于原子核的运动之外，还有原子核的相对运动，分子作为整体围绕其重心的转动、 分子的平动，以及原子之间的相对振动和分子中基团间的内旋转运动。因此，在分子中，除 了电子运动能 E。原子的核能 E 小分子转动能 E，和分子平动能 E。外，还有原子间的相对 振动能 E。和基团间的内旋转能 E。等。当不考虑各种运动之间的相互作用时，可近似地认 为分子的总能量为： E E E E E E E = + + + + + e n r t v i 由于在一般化学实验条件下， E n 不发生变化， Et 和 Ei 又比较小，所以一般只需考虑 电子运动能量、振动能量和转动能量： E E E E + + e v r 而这三种能量又都是量子化的，对应有一定的能级。 在同一电子能级内，分子的能量 还因振动能量的不同而分成若干分级，称为振动能级。当分子处于某一电子能级中某一振动 能级时，分子的能量还会因转动能量的不同再分为若干分级，称为转动能级。显然，电子能 级的能量差 E e ，振动能级的能量差 E v 和转动能级的能量差 E r ，间相对大小关系为： E e > E v > E v 当分子状态一定时，分子的总能量就是分子所处的电子能级、振动能级和转动能级的能 量之和。 分子的转动能级能量差一般在 0．005～0．05 eV，产生此能级的跃迁，需吸收波长约 为 250～25 m 的远红外光，这种光谱称为转动光谱或远红外光谱。 分子的振动能级能 量差一般在 0．05～1 eV，需吸收波长约为 25～1．25 m 的红外光才能产生跃迁。在分子 振动时，同时有分子的转动运动。这样，分子振动产生的吸收光谱中，必然包括转动光谱， 所以常称为振一转光谱。振一转光谱是一系列波长间隔很小的谱线，加上谱线变宽和仪器分 辨率低的原因，观察到的是一个谱峰，或称吸收带。因此它是带状光谱，每一不同的吸收带 对应于不同的振动跃迁。由于它所吸收的能量处于红外光区，所以常称为红外光谱。各种物
质的分子对红外光的选择吸收与其分子结构密切相关，故红外吸收光谱可应用于分子结构的 研究。 分子的电子能级能量差约 1～20 eV，比分子振动能级差要大几十倍，所吸收光的波长 约为 1．25～0．06 m ，主要在真空紫外到可见光区，相应形成的光谱，称为电子光谱或 紫外、可见光谱。通常，分子是处在电子能级基态的振动能级上，当用紫外、可见光照射分 子时，价电子可以跃迁产生的吸收光谱，在电子能级变化的同时，不可避免地伴随分子振动 和转动的能级变化。因此它包含了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带。 （二）光的吸收的基本定律 1．朗伯一比耳定律 1760 年，朗伯(Lamber)指出，当单色光通过浓度一定的、均匀的吸收溶液时，该溶液 对光的吸收程度与液层厚度 b 成正比。这种关系称为朗伯定律，数学表达式为： 0 1 lg I k b I = 1852 年，比耳(Beer)指出，当单色光通过液层厚度一定的、均匀的吸收溶液时，该溶 液对光的吸收程度与溶液中吸光物质的浓度 c 成正比。这种关系称为比耳定律，数学表达式 为： 0 2 lg I k c I = 如果同时考虑溶液浓度与液层厚度对光吸收程度的影响，即将朗伯定律与比耳定律结合 起来，则可得： 0 lg I Kbc I = 该式称为朗伯一比耳定律的数学表达式。上述各式中 0 I 、 I 分别为人射光强度和透射 光强度；b 为光通过的液层厚度(cm)；c 为吸光物质的浓度( 1 mol L− )； 1 k ， 2 k 和 K 均为比 例常数，与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。上式的物理意义为：当一束平 行的单色光通过均匀的某吸收溶液时，溶液对光的吸收程度 0 lg I I 等与吸光物质的浓度和光 通过的液层厚度的乘积成正比。 由于式中的 0 lg I I 等项表明了溶液对光的吸收程度，定义为吸光度，并用符号 A 表示； 同时， 0 I I 是透射光强度与入射光强度之比，表示了入射光透过溶液的程度，称为透光度(以％ 表示时为透光率)，以 T 表示，所以又可表示为
质的分子对红外光的选择吸收与其分子结构密切相关，故红外吸收光谱可应用于分子结构的 研究。 分子的电子能级能量差约 1～20 eV，比分子振动能级差要大几十倍，所吸收光的波长 约为 1．25～0．06 m ，主要在真空紫外到可见光区，相应形成的光谱，称为电子光谱或 紫外、可见光谱。通常，分子是处在电子能级基态的振动能级上，当用紫外、可见光照射分 子时，价电子可以跃迁产生的吸收光谱，在电子能级变化的同时，不可避免地伴随分子振动 和转动的能级变化。因此它包含了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带。 （二）光的吸收的基本定律 1．朗伯一比耳定律 1760 年，朗伯(Lamber)指出，当单色光通过浓度一定的、均匀的吸收溶液时，该溶液 对光的吸收程度与液层厚度 b 成正比。这种关系称为朗伯定律，数学表达式为： 0 1 lg I k b I = 1852 年，比耳(Beer)指出，当单色光通过液层厚度一定的、均匀的吸收溶液时，该溶 液对光的吸收程度与溶液中吸光物质的浓度 c 成正比。这种关系称为比耳定律，数学表达式 为： 0 2 lg I k c I = 如果同时考虑溶液浓度与液层厚度对光吸收程度的影响，即将朗伯定律与比耳定律结合 起来，则可得： 0 lg I Kbc I = 该式称为朗伯一比耳定律的数学表达式。上述各式中 0 I 、 I 分别为人射光强度和透射 光强度；b 为光通过的液层厚度(cm)；c 为吸光物质的浓度( 1 mol L− )； 1 k ， 2 k 和 K 均为比 例常数，与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。上式的物理意义为：当一束平 行的单色光通过均匀的某吸收溶液时，溶液对光的吸收程度 0 lg I I 等与吸光物质的浓度和光 通过的液层厚度的乘积成正比。 由于式中的 0 lg I I 等项表明了溶液对光的吸收程度，定义为吸光度，并用符号 A 表示； 同时， 0 I I 是透射光强度与入射光强度之比，表示了入射光透过溶液的程度，称为透光度(以％ 表示时为透光率)，以 T 表示，所以又可表示为
0 1 lg lg I A Kbc I T = = = 应用该定律时应注意：(1)朗伯一比耳定律不仅适用于有色溶液，也可适用于其他均匀 非散射的吸光物质(包括液体、气体和固体)；(2)该定律应用于单色光时，既适用于可见光， 也适用于红外光和紫外光，是各类吸光光度法的定量依据；(3)吸光度具有加和性，是指溶 液的总吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。根据这一规律，可以进行多组分的测定及某些 化学反应平衡常数的测定。这个性质对于理解吸光光度法的实验操作和应用都有着极其重要 的意义。 2．吸光系数和摩尔吸光系数 式中的比例常数 K 值随 c、b 所用单位不同而不同，如果液层厚度 b 的单位为 cm，浓度 c 的单位为 1 g L− ，K 用以表示，n 称为吸光系数，其单位是 1 1 L g cm − − ，则(10．6)式写为： A=abc (10．7) 如果液层厚度 b 的单位仍为 cm，但浓度 c 的单位为 1 mol L− ，则常数 K 用 表示， 称 为摩尔吸光系数，其单位是 1 1 L mol cm − − ，此时(10．6)写为： A= bc 吸光系数 a 和摩尔吸光系数 是吸光物质在一定条件、一定波长和溶剂情况下的特征常 数。同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时具有不同的 值，同一化合物在 不同波长处的 也可能不同，在最大吸收波长处的摩尔吸光系数常以 max 一表示。 值越大， 表示该有色物质对入射光的吸收能力越强，显色反应越灵敏。所以，可根据不同显色剂与待 测组分形成有色化合物的 值的大小，比较它们对测定该组分的灵敏度。以前曾认为 >1× 4 10 1 1 L mol cm − − 的反应即为灵敏反应，随着近代高灵敏显色反应体系的不断开发， 现 在 ， 通 常 认 为 ≥ 6× 4 10 1 1 L mol cm − − 的 显 色 反 应 才 属 灵 敏 反 应 ， <2× 4 10 1 1 L mol cm − − 已属于不灵敏的显色反应。目前已有许多 ≥1.0× 5 10 1 1 L mol cm − − 的高灵敏显色反应可供选择。 应该指出的是， 值仅在数值上等于浓度为 1 1 mol L− ，液层厚度为 1 cm 时有色溶液 的吸光度，在分析实践中不可能直接取浓度为 1 1 mol L− 的有色溶液测定 值，而是根据低 浓度时的吸光度，通过计算求得
0 1 lg lg I A Kbc I T = = = 应用该定律时应注意：(1)朗伯一比耳定律不仅适用于有色溶液，也可适用于其他均匀 非散射的吸光物质(包括液体、气体和固体)；(2)该定律应用于单色光时，既适用于可见光， 也适用于红外光和紫外光，是各类吸光光度法的定量依据；(3)吸光度具有加和性，是指溶 液的总吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。根据这一规律，可以进行多组分的测定及某些 化学反应平衡常数的测定。这个性质对于理解吸光光度法的实验操作和应用都有着极其重要 的意义。 2．吸光系数和摩尔吸光系数 式中的比例常数 K 值随 c、b 所用单位不同而不同，如果液层厚度 b 的单位为 cm，浓度 c 的单位为 1 g L− ，K 用以表示，n 称为吸光系数，其单位是 1 1 L g cm − − ，则(10．6)式写为： A=abc (10．7) 如果液层厚度 b 的单位仍为 cm，但浓度 c 的单位为 1 mol L− ，则常数 K 用 表示， 称 为摩尔吸光系数，其单位是 1 1 L mol cm − − ，此时(10．6)写为： A= bc 吸光系数 a 和摩尔吸光系数 是吸光物质在一定条件、一定波长和溶剂情况下的特征常 数。同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时具有不同的 值，同一化合物在 不同波长处的 也可能不同，在最大吸收波长处的摩尔吸光系数常以 max 一表示。 值越大， 表示该有色物质对入射光的吸收能力越强，显色反应越灵敏。所以，可根据不同显色剂与待 测组分形成有色化合物的 值的大小，比较它们对测定该组分的灵敏度。以前曾认为 >1× 4 10 1 1 L mol cm − − 的反应即为灵敏反应，随着近代高灵敏显色反应体系的不断开发， 现 在 ， 通 常 认 为 ≥ 6× 4 10 1 1 L mol cm − − 的 显 色 反 应 才 属 灵 敏 反 应 ， <2× 4 10 1 1 L mol cm − − 已属于不灵敏的显色反应。目前已有许多 ≥1.0× 5 10 1 1 L mol cm − − 的高灵敏显色反应可供选择。 应该指出的是， 值仅在数值上等于浓度为 1 1 mol L− ，液层厚度为 1 cm 时有色溶液 的吸光度，在分析实践中不可能直接取浓度为 1 1 mol L− 的有色溶液测定 值，而是根据低 浓度时的吸光度，通过计算求得